报告基因载体0001

《报告基因载体0001》由会员分享，可在线阅读，更多相关《报告基因载体0001（3页珍藏版）》请在装配图网上搜索。

1、报 告 基 因 载 体报告基因载体的特点：除了具有表达蛋白质所需要的结构外，理想的报告基因载体本身无调节结合 位点或序列，而具有有意插入的调节结合位点，尽管可以从报告基因载体除去已 知的结合位点，减少报告基因上游的转录，但从几千kb的DNA中去除所有潜在 的调控序列是不可能的。因此在使用报告基因载体时，应使用合适的对照载体。 报告基因质粒载体一般在大肠杆菌中繁殖，因此包括一个DNA复制起始点(ori) 和基因筛选标记，通常为氨苄西林抗性基因(Ampr)。另外还具有丝状噬菌体复制 起始点(flori)，可使载体形成单链DNA，便于基因突变和测序。(2)报告基因和侧翼区：报告基因编码区和侧翼区常被

2、改变。例如，去除SEAP(分泌型碱性磷酸酶) 羧基末端24个氨基酸，使SEAP能直接分泌到细胞外，因此测定SEAP活性不必 裂解细胞。去除荧光素酶的过氧化物酶体靶向序列，使荧光素酶转运到细胞质而 非过氧化物酶体中。为了使报告基因表达最大化，核糖体最佳结合序列 (GCCGCCCCATG)被置于报告基因的5端。此序列能增加翻译效率，产生NcoI酶 切位点，可使外源基因N末端与报告基因融合。多克隆位点：许多报告基因含有2个以上克隆位点(MCS)，一个位于报告基因上游，用于 插入假定的克隆启动子或增强子/启动子区；另一个位于其他位置，用于插入克 隆调控元件，例如插入可远距离发挥作用的增强子。另外，还有

3、用于插入基因筛 选标记的克隆位点，用于筛选稳定表达报告基因的宿主细胞。MGS具有几个单 酶切位点，用限制性内切酶催化可产生黏性末端DNA片段可插到此位点。MCS 还包括一个或两个MCS末端，此末端序列可由限制性内切酶催化断裂形成3悬 垂末端，可用核酸外切酶III进行嵌套缺失分析。多聚腺苷酸信号：多聚腺苷酸(polyA)可增强哺乳细胞mRNA稳定性和mRNA的翻译。polyA序 列紧随报告基因之后，可指导RNA转录物3端添加200250个腺苷酸残基。 在转录单位5端插入polyA信号能降低源于载体的隐匿启动子序列基因表达水 平，去除背景表达，增加报告基因系统的灵敏性。在报告基因转录单位上游3 个

4、阅读框中均插入终止密码子，可进一步降低源于载体的假转录背景。常见的报告基因报告基因必须具备的特点： 由原核基因编码的基因产物必须与同转染前真核细胞内任何相似的产物 相区别； 细胞内其他基因产物不会于扰报告基因产物的检测； 报告基因编码产物的检测应该快速、简便、灵敏度高，而且重现性好。到目前为止，报告基因通常是在报告基因载体质粒中与被检测基因序列相 连，先让质粒在大肠杆菌中进行增殖，再提取质粒，转染人感兴趣的真核细胞中。 与此同时，还要将有真核启动子和增强子的另一种报告基因质粒共转染同一细 胞，作为转染率的内对照。氯霉素乙酰基转移酶(CAT)该报告基因来源于大肠杆菌转位子9,是第1个用于检测细胞

5、内转录活性的 报告基因。氯霉素乙酰基转移酶可催化乙酰CoA的乙酰基转移到氯霉素3羟基， 而使氯霉素解毒。CAT在哺乳细胞无内源性表达，性质稳定，半衰期较短，适于瞬时表达研究。 可用同位素、荧光素和酶联免疫吸附测定(enzyme-linkedimmunosorbantassay， ELISA)检测其活性，也可进行蛋白质印迹(Westernblotting免疫组织化学分析。 CAT与其他报告基因相比，线性范围较窄，灵敏性较低。B半乳糖苷酶：B半乳糖苷酶由大肠杆菌lacZ基因编码，可催化半乳糖苷水解。最大优势是 易于用免疫组织化学法观测其原位表达，是最常用的监测转染率的报道基因之 一。以邻一硝基苯一

6、BD一半乳毗喃糖苷(ONPG)为底物可用标准的比色法检测 酶活性，其检测动力学范围为6个数量级。氯酚红一B一D一半乳毗喃糖苷(CPRG) 是另一个可用比色法检测酶活性的底物，其灵敏度比ONPG高近10倍。以MUG 和荧光素二半乳糖苷(FDG)为底物则可用荧光法检测其活性。此法可检测单个细 胞的酶活性，并可用于流式细胞学作入。，)分析。如以二氧杂环丁烷为底物，可用 化学发光法检测酶活性，其检测动力学范围最大，灵敏度最高，与用生物发光法 检测荧光素酶活性的灵敏度相似。(3)荧光素酶：荧光素酶是能够催化不同底物氧化发光的一类酶，哺乳细胞无内源性荧光素 酶。最常用的荧光素酶有细菌荧光素酶、萤火虫荧光素

7、酶和Renilla荧光素酶。 细菌荧光素酶对热敏感，因此在哺乳细胞的应用中受到限制。萤火虫荧光素酶灵 敏度高，检测线性范围宽达78个数量级，是最常用于哺乳细胞的报道基因， 用荧光比色计即可检测酶活性，因而适用于高通量筛选。随着具有膜通透性和光 裂解作用的萤火虫荧光素酶的应用，无需裂解细胞即可检测酶活性。Renilla荧光 素酶催化肠腔素(coelenterazine)氧化，产物可透过生物膜，可能是最适用于活细 胞的报告分子。将荧光素酶报告基因载体转染到细胞中，可用荧光素酶检测系统 灵敏方便地测定荧光素酶基因的表达。自1986年起，萤火虫荧光素酶基因被用作测定基因表达的报告基因，获得 了广泛的应

8、用。Promega公司的pGL3及pGL2系列载体，含SV40启动子及增强 子的不同组合，有助于分析DNA片段的转录活性。荧光素酶报告基因有许多优点： 非放射性； 比CAT及其他报告基因速度快； 比CAT灵敏100倍； 荧光素酶在哺乳细胞中的半衰期为3小时，在植物中的半衰期为3. 5小时。由于半衰期短，故启动子的改变会即时导致荧光素酶活性的改变，而荧光素 酶不会积累。相反，CAT在哺乳细胞中的半衰期为50小时。荧光素酶浓度在10 16mol / L(10pS / L)到10-8mol / L(1mg / L)范围内，荧光信号强度与酶浓度成正 比。在理想条件下，可检测到l0-20mol / L的

9、荧光素酶。Promega公司的荧光素 酶检测系统比一般的方法灵敏及简单，产生的光稳定。分泌型碱性磷酸酶(SEAP):SEAP是人胎盘碱性磷酸酶的突变体，无内源性表达。SEAP缺乏胎盘碱性磷 酸酶羧基末端的24个氨基酸。其优点是无需裂解细胞，只用培养介质即可检测 酶活性，便于进行时效反应试验。以间硝基苯磷酸盐(PNPP)为底物时可用标准的 比色法测定酶活性，操作简单，反应时间短，价格廉价，但灵敏度低。以黄素腺 嘌吟二核苷酸磷酸为底物进行比色测定，其灵敏度增高。SEAP可催化D荧光 素一O一磷酸盐水解生成D一荧光素，后者又可作为荧光素酶的底物，此即两步 生物发光法检测酶活性的原理。此方法灵敏度高，

10、接近于荧光素酶报告基因的检 测。还可用一步化学发光法检测酶活性。荧光蛋白家族：荧光蛋白家族是从水螅纲和珊瑚类动物中发现的相对分子质量为20000 30000的同源蛋白。绿色荧光蛋白(GFP)是应用最多的发光蛋白。GFP存在于发光 水母(AequoreaVictoria)中。用395Bin的紫外线和475nm的蓝光激发，GFP可在 508nm处自行发射绿色荧光，无需辅助因子和底物。GFP最大的优势是无需损伤 细胞即可研究细胞内事件。1991年克隆了 GFP基因，目前已获得几个突变体，如“红色迁移”突变体 (red-shiftmutant)，其荧光更强。其他突变体还有蓝色荧光蛋白(BFP)、增强型 GFP(EGFP)和去稳定EGFP(destabilizedEGFP)等。红色荧光蛋白(RFP)是从珊瑚 (Discosomasp.)中分离的发光蛋白(drFP583或DsRed)，可发射明亮的红色荧光。 这些常用的报告基因也可被联合应用，同时检测2个甚至3个基因的表达。报告 基因的选择依赖于其灵敏性、可靠性及监测的动力学范围。稳定性好的报告基因 适于基因转录动力学研究和高通量筛选，尤其适用于基因转移的定性研究。