汇总资料cho细胞蛋白表达系统

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1、表达系统特点产量原 核 生 物大肠杆菌(E.coli)具有原核细胞良好的可操作 性，成本低.产率高，但不 能进行糖基化修饰，胞内分 泌形成包涵体。外源蛋白占细菌总蛋白量：胞 内表达10%70%,胞外表达 0.3-4%酵母(yeasts)兼具原核细胞良好的可操 作性和真核系统的后加工能 力，但存在产量低及过度糖 基化等问题。外源蛋白占菌体总蛋白量：10%真核甲醇营养型酵母 (Methylotroph yeasts)第二代酵母表达系统，部分 克服了利甩酵母表达的过度糖基化缺 点，有较好的分泌牲，产量 较高，但产品结构与天然分 子仍有一些差异外源蛋白占菌体总蛋白量：10-30%生物昆虫杆状病毒系统具

2、有高等真核生物表达系统 的优点，产品的抗原性免疫 原性和功能与天然蛋白质相 似，表达水平较高，但其糖 基化程度较低，形式较为单发酵液中目的产物含量： l500mg / L哺乳动物细胞产品的抗原性、免疫原性和 功能与天然蛋白质最接近， 糖基化等后加工最准确，表 达水平较低发酵液中目的产物含量；0.2 200mg / L大肠杆菌(E.coli)是使用最早的表达系统，其显著优点是易于操作，产量高，成本低，但由于 用E.coli生产的蛋白质药物因缺乏糖基化而在人体内易被降解，因此它的药放大大降低。此 外，它还存在易产生内毒素和包涵体的问题。CHO细胞属于成纤维细胞，既可以贴壁生长。也可以悬浮生长。容易

3、发生基因突变，也 较易进行基因转染，是良好的哺乳动物基因表达宿主细胞，代表性细胞有二氢叶 酸还原酶(dihydrofolate reductase)营养缺陷型突变细胞株(CHO/dhfr_)、转染 谷氨酰胺合成酶(Glutamine synthetase,GS)基因的GS-CHO细胞。MEg 何n口 1iE；CHQ-K1卉KW INy-WI-l CfH-?Q?iPeiCn： CMP/dhFr-二氢叶酸还原酶是真核细胞核苷酸生物合成过程中起着重要作用的一种 酶，是常用的遗传选择标记之一，它可催化二氢叶酸还原成四氢叶酸。对于dhfr 突变体细胞而言，由于不能够合成四氢叶酸，阻断了正常核酸代谢途径，

4、因此不 能在常规培养基上生长，但若在培养基中加入次黄嘌吟(hypoxanthine)和胸苷 (thymidine)，则突变体细胞可以借助核苷酸的补救合成途径维持生长。利用dhfr 基因进行筛选时，首先将重组DNA分子导Adhfr表型的受体细胞，然后撤除原 培养基中的的次黄嘌吟和胸苷，即可获得dhfr+并能表达外源基因的克隆细胞系。 因此在挑选表达外源基因的阳性克隆细胞时需选用不含次黄嘌吟和胸苷的培养 基。另外，氨甲喋吟(MTX)选择压力可使CHO/dhfr细胞的外源基因的拷贝数 扩增并得到较高水平的表达。CHO-GS细胞是用含单抗蛋白等的目的基因和谷氨酰胺合成酶(GS)基因标 记的表达载体，转

5、染宿主细胞CHO,再通过L-氨基亚砜蛋氨酸 (methioninesulphoximine， MSX)等化合物选择加压促使GS基因和目的蛋白基因 扩增，筛选获得重组细胞株，可在不含谷氨酰胺培养基中生长、增殖，可避免或减少细胞代谢过程中谷氨酰胺降解积累的氨对细胞的损伤、抑制作用。近年来，为降低生产成本和减少血制品带来的潜在危害性，动物细胞生产开始使用无血 清培养基(SFM)，但SFM往往导致细胞活力差，贴壁性差，分泌外源蛋白的能力差等缺点。 另有研究者尝试将类胰岛素生长因子IGF基因和转铁蛋白基因转ACHO细胞获得能自身 分泌必需蛋白的“超级CHO”，无需在培养基中转铁蛋白和胰岛素，细胞可在SF

6、M中生长良好。 与其他表达系统相比，CHO表达系统具有以下的优点：(1) 具有准确的转录后修饰功能，表达的蛋白在分子结构、理化特性和生物学功能方面最接 近于天然蛋白分子；(2) 既可贴壁生长，又可以悬浮培养，且有较高的耐受剪切力和渗透压能力；(3) 具有重组基因的高效扩增和表达能力，外源蛋白的整合稳定；(4) 具有产物胞外分泌功能，并且很少分泌自身的内源蛋白，便于下游产物分离纯化； 缺点：CHO细胞培养成本高，条件难掌握，易污染，在一定程度上影响了它的广泛应用。Cho细胞的培养CHO细胞血清培养传统上CHO细胞的培养都是在DMEM/F12基础培养基中添加510的小牛血清(用 于重组蛋白)或胎牛

7、血清(用于杂交瘤生产)单抗来完成的，血清除了供给细胞的营养成分外， 还能促进细胞开始合成DNA，对细胞的增殖有很大的作用。实验证明，血清在细胞的体外 培养中提供了细胞增殖所必需的生长因子。但哺乳动物的血清价格昂贵，成本高不适于今天 的大规模工业化生产。而且哺乳动物血清作为补加物，存在许多问题，首先血清的来源存在 问题，血清来源于特定的地区，因而如果该地区发生灾荒或牛群中流行疾病，都可导致血清 失去供应源。血清批量之间的差异大，重复性差，由于血清来源于动物，动物个体或群体的 差异及时间上的差异都能导致每个批号的血清不完全一样。从重组蛋白生产的角度来看，出于Q和Qc的要求，每换一个批号的血清，都包

8、含大量 的验证工作，这就给生产带来很大的麻烦。另外血清来源于动物因此经常被污染，污染的血 清往往导致细胞生长缓慢，蛋白产量下降，甚至导致细胞死亡。目前购自各大公司的血清虽 能消灭细菌和所有支原体，但很难保证除去所有的病毒污染。血清的成分十分复杂，经研究 表明，血清除含有促进生长的活性成分外，还含有一定的细胞毒性物质和抑制物质，对细胞 有去分化作用，影响细胞功能的表达血清复杂的成分也给基因工程表达产物的下游工作带 来很大的困难，因此成分明确，价格经济的无血清培养基成为CHO细胞培养的一种必然需 求。CHO细胞的无血清培养基由于血清的成分不清而且十分复杂，具有多种促进细胞生长和增殖的因子，因此要找

9、到 血清替代物是相当困难的。目前已经发现一些物质单独或一起使用可以替代血清。这些物质 分别是微量元素、生长因子、激素、脂蛋白、脂肪酸、酶抑制剂。微量元素是细胞代谢所必 需的，是无血清培养基的主要添加物之一，铁、锌、硒等都是不可缺少的，有些资料证明还 需要铜、锰、钼、钒等元素，这些元素在血清培养中由血清提供，在无血清培养中需要补加。 促生长因子是无血清培养基的主要补加物之一。从血清、各种组织和生物成分中用生物工程的方法，制取了各种促细胞生长物，如表皮 生长因子(EGF)，成纤维细胞生长因子(FGF)，血小板生长因子(PDGF)、生长调节素(SM)等。 现已证明很多激素具有促进细胞生长的作用，胰岛

10、素能促进细胞利用葡萄糖和氨基酸，无血清培养基缺乏对细胞的保护，血清培养残余的胰蛋白酶对血清的损伤十分严重，因而无血清 培养基必须添加酶抑制剂。另外，脂类是细胞膜的主要成分，添加脂类可以促进细胞增殖。无血清培养的方法细胞的无血清驯化过程如下：取处于对数生长期的贴壁CHO细胞，活率大于95%，开始进行无血清驯化。细胞驯化可以在方瓶(T-flask)、摇瓶(shake-flask)或转瓶(spinner-bottle)中进行。将无血清细胞培养基和含血清培养基的按1： 1(V/V)的比例进行混合，接种密度为2- 4x105cells/ml的细胞，在37C、5%CO2培养箱进行培养。根据细胞生长和活率情

11、况，在降血清的每一阶段可稳定传代1-3代，接种密度维持在2- 4x105cells/mlo逐步提高无血清细胞培养基在混合液中的比例(V/V)，即降低混合液中的血清含量，传代 过程的细胞接种密度仍维持为2- 4x105cells/mlo直至混合液中的血清浓度降低至0.1-0.2%，每一代的细胞活率大于90%后，此时可将细胞 完全培养在CHO无血清无动物组分培养基中。在CHO无血清无动物组分培养基中进行放大培养，建立起适应无血清无动物组分培养的 CHO种子细胞库。无血清培养试验步骤1 .实验材料CHO细胞株购于俄罗斯Soym Agromed，无血清培养基(CHO-S-sFM1I)购于Gibeo公司

12、。2.实验方法2.1无血清培养基的配制用90ml纯水溶解制备1升量的袋装Gibeo CHO-S-sFM1I，加人2.45g NaHC03,用1M NaOH 将pH调为8.0,再用1MHC1调回至pH7.1，定容后用0.22以滤器过滤除菌。2.2 CHO细胞的适应用含血清的常规培养基和无血清培养基1:1(v/v)悬浮细胞，接种量为3X105 个/ml。在37C， 8%培养箱中培养，使细胞密度达5X105个/m1o然后用等体积的CHO-S-sFM1I将细胞稀 释到3x 105个/ml，继续培养，重复上述操作，直至血清浓度降为).1%后，用完全无血清培 养基培养到3X106个/ml。再以3Xl05个

13、/ml接种，传50代，至此完成适应工作。无血清培养基无血清培养基的研究有两个方向：一是培养基中不含有任何动物来源的添加组分；二是 培养基中不含有不明确的添加组分。依此可以将当前应用较多的无血清培养基归纳为以下四 种：(1) 无血清培养基，为一般意义上无血清培养基，用各类可替代血清功能的生物材料配制细 胞培养基，如牛血清白蛋白(BSA)、转铁蛋白、胰岛素等生物大分子物质，以及从血清中 提取的去除蛋白质的混合脂类以及水解蛋白等。其特点是培养基中的蛋白含量较高,添加物 质的化学成分不明确，其中含有大量的动物来源蛋白。(2) 无动物来源培养基，许多商业公司开发的无动物来源培养基是基于生产重组药物的安全

14、 考虑，培养基中的添加组分无动物来源，需要的蛋白来源于重组蛋白或者蛋白水解物，这些 组分可以保障细胞生长及增殖的需要。(3) 无动物蛋白培养基，培养基完全不用动物来源的蛋白，但仍有部分添加物是来源于植物 蛋白的水解片段或合成多肽片段等其他衍生物。此类培养基组分相对稳定，但必须添加类固醇激素和脂类前体，并且对培养的细胞是高度特异性的。（4）化学组分限定培养基，此类培养基是目前最安全、最为理想的培养基，首先可以保证培养基批次间的一致性，其中所添加的少量动物来源的蛋白水解物、蛋白都是成分明确的组份。 其特点是培养基的性质明确，有利于进行细胞培养的代谢研究，同时分离纯化也比较方便。目前的无血清培养基已

15、进入第三代，第一代无血清培养基虽然不含有血清，但含有大量 的动物或植物蛋白，口BSA或激素等，虽然它所含的总体蛋白要低于血清，但蛋白的含量 依然很高，八十年代末，开发出第二代无血清培养基，它完全不用动物来源的蛋白，如LTI 公司生产的CH0SSFM I，它采用悬浮的CHO表达蛋白，培养基蛋白含量很低（少于 100g/m1），使重组蛋白的纯化简单，目前市售的无血清培养基主要是这一类。第三代无血 清培养基现在已经出现，它完全不含有蛋白或含量极低，如LTI公司最近推出的CHOIPFM，培养基不含任何蛋白质，没有任何动物、人类蛋白或多肽，为表达产品的 下游处理工作提供极大方便。无血清培养基1. 避免批

16、间差异和不明的血清组分对细胞培养的影响2. 避免血清的外源性污染和对细胞毒性作用3. 使产品易于纯化，提高回收率4. 成分明确，有利于研究细胞的生理调节机制；可根据不 同细胞株设计和优化出适合其高密度生长或高水平目 的产物表达的培养基5. 适用的细胞系宙窄，对特定的细胞株有时需自己摸索新 配方或最优条件6. 粘度小，细胞易受搅拌等机械因素的影响有血清培养基1. 存在批间差异，需要大量的验证工作2. 含促进生长的活性成分和抑制生长的成分，需 测试才知对细胞生长的净作用3. 血清中蛋白含量超过45g/l,成分复杂,不下于 150种，不利于下游的分篱纯化4. 常被病毒和支原体污染5. 在产业化时难以

17、建立SOP,成本高6. 血清的来源可能受到来源地区的气候及牛群疾 病影响而影响生产7. 保存和应用方便成分优缺点相关产品第一代无血清，但含有大量的动物或植 物蛋白，如BSA或激素等总体蛋白要低于血清，但蛋白的含量依然很高DMEM-F12第二代无动物来源的蛋白培养基蛋白含量很低（少于100g/m1），使 重组蛋白的纯化简单。CHO III PFM，CH0-S-SFM II第三代无血清，无蛋白培养基或含量极 低化学成分确定，细胞培养及生产过程比较 恒定，分离纯化简单，容易管理。CD CHO MediumCHO细胞悬浮培养细胞驯化的确没什么技术含量，对于很熟练的人来说，3周左右吧。就是拿培养基来试！

18、尽 量选择CD级别培养基，对于反应的控制和以后的纯化都有好处。2,说来现在用的工程细胞也就以CHO, 293，杂交瘤为主了。如果你的细胞株已经是贴壁 的，就尽量驯化成悬浮的。3，过程可以直接去掉血清，直接换成无血清培养基。也可以把血清加到培养基当中，再逐 步减少血清，直到完全换成无血清培养基。4,在换成无血清培养基后，要密切观察细胞的变化。前期有20-50%的细胞死亡是正常现象。 当然也有差异了。更换培养基时尽量换一半，保留一半的条件培养基（条件培养基是养2-3 天细胞的培养基），里面含有细胞外泌的因子。有利于细胞的生长。5,如果是驯化贴壁到悬浮，用CD的培养基会有细胞漂起来，但细胞不一定会死

19、。可以收 集起来继续培养。也会有细胞成团的现象，只要不是特别多的细胞聚在一起，不要紧。可以 观察一下，养一阶段以后，细胞就会散开。一定浓度的Pluronic F68、肝素钠或硫酸葡聚 糖，能够改善细胞成团的现象。6, 如果前期你的细胞生长特别慢，增殖不好，可以考虑加入5-10ug/ml的insulin胰岛素， 当细胞完全适应培养基后，可以逐渐去掉胰岛素，最后完全去除。7, 前期适应时，不要急于传代，要等到活细胞密度达到10e6以上再传代，传代后接种的密 度不小于1-3 x 10e5/ml。用CD培养基时，不能用胰酶消化细胞（因为CD培养基中没有蛋 白，无法终止胰酶的作用），可用EDTA0.1%

20、-0.5%都可以。8, 细胞适应培养基后，活细胞的数量每代是稳定的，达到最大细胞密度的周期是稳定的。而且细胞的状态和有血清时差别不大。细胞的表达量略低于或接近有血清培养。有的要高于 有血清培养。9，冻存：条件培养基和新鲜培养基的比例是1： 1，同时加入5-10%的DMSO，活细胞数量 要不低于3-5x10e6。10，细胞完全适应以后，在进入反应器之前，是要在摇瓶或转瓶里培养，达到足够的密度和 适应程度再进入反应器。驯|服CHO-K1步骤1 5%FBS胎牛血清的培养基（14326）培养正常的CHO-K1。2当细胞汇合度达到80%-90%时，PBS洗涤，胰酶消化，2%FBS的培养基（14326）终

21、止。 计数并离心。3 2%FBS的培养基（14326）重悬细胞，以1 X1Q5个细胞/毫升的密度接种细胞。4当细胞的汇合度达到80%-90%，保留培养基中悬浮的细胞，观察悬浮细胞的活力，如果 悬浮细胞无活力，丢弃。如果有活力，保留并与胰酶消化的贴壁细胞混合。5消化按照步骤2进行，1%FBS的培养基（14326）终止。计数并离心。6 1%FBS的培养基（14326）重悬细胞，以2X105个细胞/毫升的密度接种细胞。7每天观察细胞，并用手掌轻拍细胞瓶让细胞悬浮，重放回培养箱直到细胞的汇合度达到 80%-90% （约 4-5 天）8 一旦细胞汇合，保留悬浮的细胞并用手掌轻拍细胞瓶，避免气泡产生。用吸

22、管吹落瓶壁上 的细胞，同时将细胞吹散。细胞计数并离心。9无FBS的培养基（14326）重悬细胞，以8X105个细胞/毫升的密度接种细胞培养。直到 细胞的密度达到1.5-2X106个细胞/毫升（约3-4天）。10 吹散细胞，计数并离心。11无FBS的培养基（14326）重悬细胞，以8X105个细胞/毫升的密度接种细胞。直到细胞 的密度达到1.5-2X106个细胞/毫升。注意细胞聚团的大小（每团细胞的个数）。12反复重复步骤9-1113以6X105个细胞/毫升的密度接种细胞，60rpm转速培养。14培养方法建立之后，可以进行转瓶的扩大培养。15按照规程和密度，可以对悬浮细胞进行规模化的培养。备注：

23、如果细胞聚团严重，可让大团的细胞沉到细胞瓶底部。吸取单个细胞进行培养。确定 总细胞数量和单个悬浮细胞的数量，以安排合理的接种密度。CHO细胞的转染电穿孔法：通过短暂的高电场电脉冲处理细胞，沿细胞膜的电压差异会导致细胞 膜的暂时穿孔DNA被认为是穿过孔扩散到细胞内的。电脉冲和场强的优化对于 成功的转染非常重要，因为过高的场强和过长的电脉冲时间会不可逆地伤害细胞 膜而裂解细胞。理论上说电穿孔法可用于各种细胞，且不需要另外采购特殊试剂， 但需要昂贵的电转仪。此法每次转染需要更多的细胞和DNA，因为细胞的死亡率 高。每种细胞电转的条件都需要进行多次优化。有文献称：280V电压电击20ms、 质粒用量为

24、20pg时，转染细胞中蛋白的表达量最高。脂质体法：中性脂质体是利用脂质膜包裹DNA，借助脂质膜将DNA导入细胞膜内。 带正电的阳离子脂质体则不同，DNA并没有预先包埋在脂质体中，而是带负电的 DNA自动结合到带正电的脂质体上，形成DNA-阳离子脂质体复合物，从而吸附到 带负电的细胞膜表面，经过内吞被导入细胞。脂质体法始于1987年，此法的出 现使得转染效率、转染的稳定性和可重复性大大提高。阳离子脂质体细胞毒性相 对较高，对不同的细胞可能会干扰细胞的代谢。非脂质体的脂质：新一代的脂质体技术，其与DNA结合形成胶束结构而非简单的 双层膜结构，使DNA的传递更有效且细胞毒性明显降低。活化的树状聚合物

25、：该聚合物的高度树状分枝形成球形结构，借助每个球体无数 活化的氨基末端凝聚在DNA 上形成较为致密的结构，并吸附在细胞膜上，经内吞 进入细胞。活化的氨基可以调节胞内溶酶体pH值，抑制降解活性，使DNA稳定 存在。转染效率高，毒性低，可重复性好。血清的存在能显著提高转染效率。CHO细胞的筛选方法挑选高表达的单克隆细胞株一般采用两种流程:第一种方案首先通过检测外源基因的表 达，逐一筛选dhfr阳性单克隆，再转到浓度持续升高的MTX之下生长，分别进行扩增；另 一种方法先把dhfr阳性单克隆合并，在不断升高的MTX之下加压扩增外源基因的表达，最 后挑出稳定的、高表达的单克隆细胞株。加压扩增外源基因表达，除了单纯使用dhfr扩增 系统或GS扩增系统外，也可采用G418与MTX联合作用细胞，G418与MSX （methioninesulphoximine，GS抑制物）联合作用细胞，或者利用dhfr扩增系统与GS扩增 系统共加压。混合克隆的表达水平远赶不上表达较高的单个克隆，这是因为转染的CHO 细胞中存在不表达或低表达的非生产细胞，并可在长期生存，甚至MTX加压时占生长优势， 排斥其它高表达细胞，成为细胞群体中的主要部分，导致产量严重下降，并对MTX加压无 反应。当撤除MTX，会发生外源蛋白表达量下降的情况，原因也可能在此。