SDSPAGE电泳最新课件

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1、LOGO蛋白质的SDS-PAGE电泳一一.实验目的实验目的学习学习SDS-PAGE测定蛋白质分子量的原理。测定蛋白质分子量的原理。掌握垂直板电泳的操作方法。掌握垂直板电泳的操作方法。二二.实验原理实验原理 聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺(Acr)(Acr)和交联剂和交联剂N,N-N,N-甲叉双丙烯酰胺甲叉双丙烯酰胺(Bis)(Bis)在加速在加速剂剂N N，N N，N N，N N 四甲基乙二胺四甲基乙二胺(TEMED)(TEMED)和催和催化剂过硫酸铵化剂过硫酸铵(AP)(AP)或核黄素的作用下聚合交或核黄素的作用下聚合交联成三维网状结构的凝胶，以此凝胶为支持联成

2、三维网状结构的凝胶，以此凝胶为支持物的电泳称为聚丙烯酰胺凝胶电泳物的电泳称为聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)(PAGE)。分子量范围与凝胶浓度的关系分子量范围与凝胶浓度的关系 丙烯酰胺浓度（丙烯酰胺浓度（%）线性分离范围（线性分离范围（kDkD）1515121243431010161668687.57.5363694945.05.05757212212 SDSSDS聚丙烯酰胺凝胶电泳（聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGESDS-PAGE）：蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶电泳时，它的迁移率取蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶电泳时，它的迁移率取决于它所带净电荷以及分子的大小和形状等因素。决于它所带净电荷以及分子的大小

3、和形状等因素。如果在丙烯酰胺凝胶系统中加入阴离子去污剂十如果在丙烯酰胺凝胶系统中加入阴离子去污剂十二烷基磺酸钠二烷基磺酸钠(SDS)(SDS)，则蛋白质分子的电泳迁移率，则蛋白质分子的电泳迁移率主要取决于它的分子量，而与所带电荷和形状无主要取决于它的分子量，而与所带电荷和形状无关。因此可以利用关。因此可以利用SDS-PAGESDS-PAGE测定蛋白质分子量。测定蛋白质分子量。当蛋白质的分子量在当蛋白质的分子量在15KD200KD15KD200KD之间时，电之间时，电泳迁移率与分子量的对数呈线性关系。泳迁移率与分子量的对数呈线性关系。凝胶由分离胶和浓缩胶组成：凝胶由分离胶和浓缩胶组成：上层为浓缩

4、胶，凝胶孔径较大，没有上层为浓缩胶，凝胶孔径较大，没有分子筛效应，其分子筛效应，其pHpH为为6.86.8，由于快慢离子所，由于快慢离子所形成的高电压梯度，使得变性蛋白质分子在形成的高电压梯度，使得变性蛋白质分子在泳动中被压缩为很薄的一层，大大提高了分泳动中被压缩为很薄的一层，大大提高了分辨率。辨率。下层为分离胶，凝胶孔径较小，有分下层为分离胶，凝胶孔径较小，有分子筛效应，子筛效应，pHpH为为8.88.8，变性蛋白质分子所带，变性蛋白质分子所带负电荷基本一致，泳动速度主要决定于分子负电荷基本一致，泳动速度主要决定于分子量。量。电泳过程中分子迁移的规律，小分子走在前头，大分子滞后电泳过程中分子

5、迁移的规律，小分子走在前头，大分子滞后混合样品混合样品带孔胶带孔胶 按分子按分子大小分离大小分离电泳方向电泳方向 电泳电泳 小分子小分子大分子大分子三三.实验试剂和器材实验试剂和器材1.材料：材料：标准蛋白标准蛋白2.试剂：试剂：(1)30%丙烯酰胺丙烯酰胺 (2)10%SDS (3)分离胶缓冲液分离胶缓冲液:1.5mol/L Tris-HCl pH 8.8 (4)浓缩胶缓冲液浓缩胶缓冲液:0.5mol/L Tris-HCl pH6.8试剂：试剂：(5)10%(5)10%过硫酸铵过硫酸铵(APS)(APS)溶液溶液 (6)(6)四甲基乙二胺四甲基乙二胺(TEMED)(TEMED)(7)SDS(

6、7)SDS上样缓冲液上样缓冲液:Tris-HClTris-HCl、SDSSDS、溴酚蓝、甘、溴酚蓝、甘油、油、2-2-巯基乙醇巯基乙醇 (8)(8)电极缓冲液电极缓冲液（Tris-Tris-甘氨酸缓冲液）甘氨酸缓冲液）(9)(9)染色液染色液:甲醇、水甲醇、水 、冰乙酸、冰乙酸 、考马斯亮蓝、考马斯亮蓝R250 R250(10)(10)脱色液脱色液:甲醇、水甲醇、水 、冰乙酸、冰乙酸 3.3.实验器材：实验器材：垂直板电泳装置垂直板电泳装置稳压稳流电泳仪稳压稳流电泳仪 脱色摇床脱色摇床移液枪移液枪滤纸滤纸 大培养皿大培养皿各部分凝胶配制各部分凝胶配制分离胶分离胶(10%10ml)(10%10m

7、l)浓缩胶浓缩胶(5%10ml)(5%10ml)ddHddH2 2O O4.05ml4.05ml6.8ml6.8ml30%Acr30%Acr3.3ml3.3ml1.7ml1.7mlBufferBuffer1.5mol/L pH=8.8 1.5mol/L pH=8.8 Tris-HCl 2.5mlTris-HCl 2.5ml0.5mol/L pH=6.8 0.5mol/L pH=6.8 Tris-HCl 1.25mlTris-HCl 1.25ml10%SDS10%SDS100l100l100l100l10%Ap10%Ap50l50l100l100lTEMEDTEMED10l10l10l10l四四

8、.实验步骤实验步骤1.安装制胶模具。安装制胶模具。2.调制分离胶（调制分离胶（10%），加入），加入10%APS和和TEMED，混匀，立即灌注至模具高度的，混匀，立即灌注至模具高度的70%。3.加一层纯水，约加一层纯水，约30min后聚合。后聚合。4.倒出水并用滤纸把剩余的水分吸干。倒出水并用滤纸把剩余的水分吸干。5.调制浓缩胶（调制浓缩胶（5%），加入），加入10%APS和和TEMED混匀，立即灌注插入梳子。静置混匀，立即灌注插入梳子。静置40min。出现明显界面时，出现明显界面时，分离胶凝聚完成分离胶凝聚完成（minh）倒出水或正丁醇，倒出水或正丁醇，并用滤纸吸干并用滤纸吸干v制备分离胶制

9、备分离胶封水的目的是使分离胶上表面平直，并排除气泡。凝胶聚合好的标志是胶与水层之间形成清晰的界面。加入浓缩胶溶加入浓缩胶溶液液pH6.8v制备浓缩胶制备浓缩胶样梳需一次平稳插入样梳需一次平稳插入,梳梳口处不得有气泡口处不得有气泡,梳底需梳底需水平。水平。插入样品梳插入样品梳6.样品及标准品的准备：标准品按说明书进样品及标准品的准备：标准品按说明书进行处理，样品加入行处理，样品加入ddH2O溶解后，再加入溶解后，再加入SDS上样缓冲液。上样缓冲液。7.加样电泳（每孔加样加样电泳（每孔加样15l）。开始）。开始8V/cm（60V），染料进入分离胶时，电压提到），染料进入分离胶时，电压提到15V/c

10、m（110V），继续电泳，让溴酚蓝到），继续电泳，让溴酚蓝到达分离胶底部时关闭电源。达分离胶底部时关闭电源。8.卸下玻板，剥离凝胶放在器皿内，切去一卸下玻板，剥离凝胶放在器皿内，切去一角作为方位标记。角作为方位标记。v上样及电泳上样及电泳9.9.染色：用至少五倍体积染色液浸泡凝胶，染色：用至少五倍体积染色液浸泡凝胶，于平缓摇摆平台上室温于平缓摇摆平台上室温1h1h左右。左右。10.10.脱色：用蒸馏水漂洗数次，再用脱色液脱色：用蒸馏水漂洗数次，再用脱色液脱色，至蛋白质条带清晰。脱色，至蛋白质条带清晰。注意事项注意事项（1）安装电泳槽时要注意均匀用力旋紧固定安装电泳槽时要注意均匀用力旋紧固定螺丝

11、，防止夹坏玻璃板，避免缓冲液渗漏。螺丝，防止夹坏玻璃板，避免缓冲液渗漏。（2）凝胶配制过程要迅速凝胶配制过程要迅速,催化剂催化剂TEMEDTEMED要在要在注胶前再加入注胶前再加入,否则凝结无法注胶。注胶过否则凝结无法注胶。注胶过程最好一次性完成程最好一次性完成,避免产生气泡。避免产生气泡。（3）梳子需一次平稳插入梳子需一次平稳插入,梳口处不得有气泡梳口处不得有气泡,梳底需水平。梳底需水平。（4）微量注射器（加样器）上样时微量注射器（加样器）上样时,注射器注射器不可过低不可过低,以防刺破胶体；也不可过高以防刺破胶体；也不可过高,样样品下沉时易发生扩散，溢出加样孔。品下沉时易发生扩散，溢出加样孔

12、。（5）剥胶时要小心剥胶时要小心,保持胶完好无损保持胶完好无损,染色要染色要充分。充分。（6 6）聚丙烯酰胺具有神经毒性，操作时要戴）聚丙烯酰胺具有神经毒性，操作时要戴手套。手套。思考题思考题:1.SDS1.SDS在该电泳方法中的作用是什么？在该电泳方法中的作用是什么？2.2.在在SDS-PAGESDS-PAGE中中TEMEDTEMED和和APAP的作用的作用?浓缩胶的作用是有堆积作用，凝胶浓度较小，孔径较大，把较稀的样品加在浓缩胶上，经过大孔径凝胶的迁移作用而被浓缩至一个狭窄的区带。当样品液和浓缩胶选Tris/HCL缓冲液，电级液选Tris/甘氨酸。电泳开始后，HCL解离成氯离子，甘氨酸解离出少量的甘氨酸根离子。蛋白质带负电荷，因此一起向正极移动，其中氯离子最快，甘氨酸根离子最慢，蛋白居中。电泳开始时氯离子泳动率最大，超过蛋白，因此在后面形成低电导区，而电场强度与低电导区成反比，因而产生较高的电场强度，使蛋白和甘氨酸根离子迅速移动，形成以稳定的界面，使蛋白聚集在移动界面附近，浓缩成一中间层