分子生物学实验

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1、分子生物学实验分子生物学实验实验四实验四 原核细胞质粒原核细胞质粒DNADNA的提取的提取第第3周周分子生物学实验仪器设备简介和实分子生物学实验仪器设备简介和实验有关内容介绍验有关内容介绍 第第4周周从植物组织提取从植物组织提取DNA第第5周周从动物组织提取从动物组织提取DNA第第7周周原核细胞质粒原核细胞质粒DNA的提取的提取第第8周周核酸的琼脂糖凝胶电泳核酸的琼脂糖凝胶电泳 第第9周周紫外吸收测定核酸含量紫外吸收测定核酸含量第第10周周限制性内切酶酶切质粒限制性内切酶酶切质粒DNA 第第11周周凝胶电泳回收和纯化凝胶电泳回收和纯化DNA片段片段第第12周周细菌感受态的制备细菌感受态的制备

2、第第13周周质粒质粒DNA的转化的转化第第14周周目的基因的目的基因的PCR扩增与检测扩增与检测第第15周周原核蛋白质原核蛋白质SDS-PAGE电泳电泳第第17周周考试考试一、实验原理一、实验原理 由溶菌酶破坏细胞壁的糖肽层再经经由溶菌酶破坏细胞壁的糖肽层再经经EDTAEDTA破坏带有质粒的细菌外膜系统，再经去垢破坏带有质粒的细菌外膜系统，再经去垢剂剂SDSSDS变性作用，使细胞膜蛋白质变性裂解而使胞内变性作用，使细胞膜蛋白质变性裂解而使胞内DNADNA全部释放出来。质粒全部释放出来。质粒DNADNA具有较强具有较强的耐剪切和耐碱特性（），且恢复中性后又呈天然构型，而染色体的耐剪切和耐碱特性（

3、），且恢复中性后又呈天然构型，而染色体DNADNA仍处于变性状态，仍处于变性状态，用乙酸钾沉淀变性的蛋白质和染色体，再用乙醇沉淀上清液中的质粒用乙酸钾沉淀变性的蛋白质和染色体，再用乙醇沉淀上清液中的质粒DNADNA，便可得到含染，便可得到含染色体色体DNADNA较少的质粒较少的质粒DNADNA粗提物，可直接用于酶切和转化实验。粗提物，可直接用于酶切和转化实验。二、二、材料与设备材料与设备 菌株；冷冻离心机，高压灭菌锅，恒温培养箱，超净工作台菌株；冷冻离心机，高压灭菌锅，恒温培养箱，超净工作台三、试剂与配制三、试剂与配制1)质粒质粒DNA碱裂解法试剂：碱裂解法试剂：溶液溶液I：葡萄糖葡萄糖 50

4、 mmol/L EDTANa2 10 mmol/L Tris-HCl（）（）25 mmol/L溶液溶液II：（临用时新配制）：（临用时新配制）NaOH 0.2 mol/L SDS（w/v）1%NaOH 和和2%SDS（w/v）对半混匀即可。）对半混匀即可。溶液溶液III：5 mol/L 醋酸钾醋酸钾 60 mL 冰醋酸冰醋酸 11.5 mL DDW 28.5 mL注意：溶液注意：溶液I、III都须高压灭菌。都须高压灭菌。2)氯仿氯仿:异戊醇异戊醇=24:1 3)无水乙醇；无水乙醇；70%乙醇；异丙醇乙醇；异丙醇 4)TE（）：（）：10 mmol/L Tris-HCl,1 mmol/L EDT

5、A 四、实验步骤：四、实验步骤：（1）取菌液）取菌液1.0mL,7000 rpm离心离心5min,弃上清。弃上清。（2）加入预冷的）加入预冷的100 l 溶液溶液I。震荡混匀。室温放置。震荡混匀。室温放置5min。（3）加入）加入200 l溶液溶液II，盖紧管口，轻轻快速颠倒离心管，盖紧管口，轻轻快速颠倒离心管3-5次（不要剧烈震荡）次（不要剧烈震荡）,冰浴放置冰浴放置5min。（4）加入预冷的）加入预冷的150 l 溶液溶液III。温和震荡混匀，冰浴。温和震荡混匀，冰浴3min。（5）4 12000rpm离心离心5min。（6）取上清至另一干净的）取上清至另一干净的EP离心管中，加入离心管中

6、，加入400 l 氯仿氯仿:异戊醇，混匀。异戊醇，混匀。4 12000rpm离心离心5min。（7）轻轻取上清至另一干净的）轻轻取上清至另一干净的EP离心管中，加入离心管中，加入800 l无水乙醇或倍体积异丙醇，无水乙醇或倍体积异丙醇，充分混匀后，室温静置沉淀充分混匀后，室温静置沉淀5min。（8）4 12000rpm离心离心5min，弃上清。，弃上清。（9）用）用500l 70%的乙醇漂洗沉淀的乙醇漂洗沉淀2-3次，次，12000rpm离心离心5min。（10）沉淀物自然干燥后加入）沉淀物自然干燥后加入30 l 含含RNAase的的TE(pH8.0)，以溶解质粒，以溶解质粒DNA。（11）电泳检测实验结果。）电泳检测实验结果。五、作业五、作业：1 1、细菌质粒、细菌质粒DNADNA的提取过程中如何去除细菌基因组的提取过程中如何去除细菌基因组DNADNA的污染？的污染？2 2、溶液、溶液I I、溶液、溶液IIII和溶液和溶液IIIIII的作用分别是什么？的作用分别是什么？微微量量移移液液器器NoImage使用对应的吸头（枪头）、确认样品的加入。台式离心机NoImage水浴锅NoImage