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1、遗传工程动物及其应用遗传工程动物及其应用遗传工程动物明星 多利世界上第一只用已经分化的成熟的体细胞已经分化的成熟的体细胞(乳腺细胞)克隆出的羊遗传工程动物明星 乙肝小鼠持续表达乙肝病毒表面抗原的转基因小鼠。将乙型肝炎病毒基因注入小鼠受精卵，整合进基因组，让乙型肝炎病毒在小鼠体内生存，并代代相传 乙型肝炎的病因 发病机理及防治 药物筛选 疫苗验证遗传工程动物明星 荧光鼠取小鼠早期囊胚，注射转染了绿色荧光蛋白基因的小鼠胚胎干细胞后植入代孕母鼠子宫内制作遗传工程动物目的 探索基因功能发现基因 改造动物产生新的生物学功能、特性，或者丧失原有功能 遗传学机理研究对遗传本质的研究内容提要 遗传工程动物制作
2、的基本原理和技术 遗传工程动物的种类和应用遗传工程技术 对 遗传物质（DNA）的体外施工 主要建立在基因水平上，因此也被称为基因工程/重组DNA技术 相比于传统保种、育种技术的优势：1、高度预见性2、精确3、高效率4、打破自然界限制（时空、种属）打破自然界限制（时空、种属）基因工程动物 原理：分子遗传学 技术手段：分子生物学、微生物学 基本过程：体外构建杂交DNA(重组），导入活细胞，发育为个体 结果：改变原有遗传性状，获得新品种/物种 意义：使基因操作走向整体动物水平从分子水平改造动物/改变动物基因组，从整体水平（活体动物）观察效应基因工程动物 基因工程动物：通过基因工程基因工程技术/重组D
3、NA，人为改改变遗传性状变遗传性状的动物 转基因动物：以实验方法将特定外源基因导入动物受精卵或胚胎，使之稳定整合于染色体基因组，并能够遗传给后代的一类动物（有别于嵌合体动物）1、其所有细胞均整合有外源基因2、其外源基因能够遗传给子代嵌合体 嵌合体在希腊神话中是指具有狮头、羊身和蛇尾的一种怪物。种内嵌合体1965年 获得了小鼠的嵌合体后代1968年 获得了绵羊的嵌合体后代1974年 获得了大鼠、家兔的嵌合体后代1984年 获得了牛的嵌合体后代1987年 获得了猪的嵌合体后代种间嵌合体1973年 小鼠与大鼠1980年 家养小鼠与野生小鼠1983年 牛与水牛1984年 绵羊与山羊嵌合体 哺乳动物嵌合
4、体的生产方法1卵裂球聚合法将不同遗传性能而发育阶段相同或相近的胚胎卵裂球聚合在一起获得嵌合体的方法，胚胎发育阶段在8细胞至桑椹胚阶段较为理想。2囊胚注射法把一种或多种胚胎的卵裂球、内细胞团细胞或EC细胞、ES细胞直接注射到另一枚囊胚的腔隙中获得嵌合体的方法。嵌合体 嵌合体的生产效率低，种间嵌合体仅在少数动物上取得成功，远缘动物嵌合体仍存在很大障碍。通过嵌合方式可能会得到经济价值或观赏价值更高的动物。种间嵌合体技术也为拯救濒危动物提供一种方法。特异性嵌合体技术若能使嵌入的细胞定向分化为嵌合体的某一组织或某一器官，有极高的医学价值（人心猪，真人耳鼠）。转基因技术 广义：对动物基因组的所有改动 狭义
5、：以显微注射、反转录病毒介导、胚胎干细胞介导等方式转入基因，获得新功能转基因动物 基因转移/基因打靶：以精确的基因替换技术获得新基因，knock-in knock-out转基因技术 转基因（狭义）原理和局限1、细胞学原理：利用MII期卵母细胞无核膜、外源基因易导入特点2、胚胎学原理：利用雌雄原核融合之前雄原核易见特点3、分子生物学原理：随机整合 整合位点、表达效果的不可预期性转基因技术 常用转基因技术手段1、显微注射将外源基因直接注射到受精卵原核内，迄今应用较为普遍和富有成就对DNA片段大小无限制无需载体，可获无载体片段的转入目的基因操作简单，周期短各种随机整合结果：位点、多拷贝可能不整合/游
6、离体转基因技术2、电脉冲法 利用高压电短脉冲破坏细胞膜电位，造成细胞膜可逆性穿孔，以便外源DNA进入细胞 瞬时转染/游离体、稳定转染/整合 DNA用量大、细胞容易死亡转基因技术3、逆转录病毒法 利用逆转录病毒侵入宿主细胞并整合于DNA的能力，适合难以观察到雄原核的禽类受精卵 整合率较高 单拷贝单位点 可能得到嵌合体、逆转录病毒的潜在危害、可携带DNA长度有限转基因技术4、精子载体法利用受精作用避免人工方法导致原核损伤实践中成功率较低胚胎干细胞介导 胚胎干细胞：高度未分化细胞，可被诱导分化为几乎所有机体细胞类型；哺乳动物囊胚期内的细胞团分离出的尚未分化的胚胎细胞（囊胚期内层细胞），具有发育为各种
7、成体器官细胞的多能性，但不能发育为胎盘，因此不具有发育为完整个体的全能性 将整合外源基因的ES细胞注入受体囊胚腔中发育为嵌合体，或培育筛选无损囊胚植入代孕母体子宫发育为转基因动物 对ES细胞的操作和培养容易，但ES细胞系难建立 囊胚内注射转基因技术基因定点突变（基因打靶）利用DNA同源重组，即同源DNA之间相互配对并互换的自然现象（自然状况下可增加自身和后代遗传多样性促进生物进化）构建打靶载体（目的基因上下游同源DNA），实现特定基因的剔除/导入大量knock-in knock-out动物用于特定基因的研究转基因动物应用用转基因动物建立疾病动物模型 模型来源一般途径：1、理化生物造模手段诱发获
8、得（诱发模型）2、传统定向培育或自发筛选获得（自发模型）-效果不确切不稳定-周期长-各种技术上和伦理的限制转基因动物应用 转基因动物大量用于遗传病、传染病、肿瘤的研究，且以大鼠、小鼠和兔为主 遗传病：单基因遗传疾病、多基因遗传疾病（舞蹈症、人囊性纤维化）传染病：突破病毒宿主的特异性（乙肝小鼠、人脊髓灰质炎小鼠）肿瘤：肿瘤和基因的关系转基因动物应用转基因动物用于功能基因组研究 体外研究-纸上谈兵 基因结构和功能 基因表达的组织特异性、时相特异性 基因表达调控 基因治疗：基因补偿、纠正、导入、反义RNA转基因动物应用转基因动物用于人体器官移植研究 同种器官来源不足 器官移植后免疫排斥 利用转基因技
9、术改造供体器官避免排斥反应，如关闭引起免疫应答的基因（猪 a-1,3-半乳糖转移酶基因）、替换动物补体调节蛋白因子基因（组织工程再造器官组织：人耳鼠）转基因动物应用用 转基因动物生产药物、生物制品 动物生物反应器（会走路的药厂）：将具有生物医学重要作用的生物活性物质基因导入动物DNA，从动物体收获基因产物（重组蛋白）第一批目标基因：血液产品 第二批目标基因：抗体、激素、受体、细胞因子、疫苗、营养药物、食品等转基因动物应用乳腺生物反应器 强大的蛋白合成能力，高品质 收获、提取等后续工作简便 独立的分泌系统，外源蛋白产物不影响自身功能 实例小鼠-（人t-PA基因）-人源性组织纤溶酶原活化因子牛-（
10、人乳铁蛋白基因）-人源化牛乳山羊-（人凝血酶III基因）-凝血酶转基因动物应用 猪-（人血红蛋白基因）-猪血/人血液制品 小鼠-（人生长激素基因）-小鼠尿液/人生长激素胚胎工程胚胎工程 针对：两性生殖细胞-囊胚 目的：增加胚胎数量、提高胚胎质量 应用：细胞生物学、发育生物学、生殖生物学胚胎工程 超数排卵-10倍 体外受精-提供大量受精卵 胚胎培养-胚胎工程基本技术，各期胚胎培养难度不同 胚胎冷冻保存-种质保存、转移 胚胎移植-胚胎克隆、受精卵移植 胚胎分割-同卵多胞胎 胚胎嵌合-制造嵌合体 核移植-体细胞核 卵的激活和孤雌发育试管动物试管动物 体外人工受精+早期胚胎培养+移植+代孕 发育生物学
11、研究 克服生殖缺陷、定向培育 提高繁殖力获得大量个体遵循遗传规律、有性生殖克隆克隆动物 克隆-自我复制：蛙-羊-小鼠-牛-猫-猪-猴 经无性繁殖产生多个遗传上完全相同的个体 利用细胞潜在全能性克隆胚胎分割-最简单的克隆人工干预多胞胎人工干预多胞胎 将早期（未着床）胚胎分割后使其分别发育为完全相同的个体 利用桑葚胚或更早期胚胎细胞的全能性 不是严格意义上的克隆（无性繁殖）胚胎分割+融合：将两枚来自2对不同亲代具有不同遗传组成的胚胎分割后融合，突破传统生殖界限构成嵌合体，创造新物种，理论上可以融合无限多胚胎克隆核移植动物克隆的关键技术 将供体细胞核导入去核卵母细胞（受体）构建胚胎并使之发育成个体体
12、细胞核移植 采用高度分化的体细胞为供体 真正意义上的克隆动物 唤醒基因胚胎克隆胚胎细胞核移植 采用早期胚胎细胞为供体 比胚胎分割进一步 多利羊的培育过程是：将一只母羊（A羊）卵细胞的细胞核吸出，得到不含核的卵细胞。然后，将实验室中培养的另一只母羊（B羊）的乳腺上皮细胞的细胞核注入到无细胞核的卵细胞中并进行电刺激，这样就通过核移植技术形成了一个同时含有B羊核遗传物质和A羊细胞质的重组卵细胞。融合后的卵细胞经过体外细胞培养形成早期胚胎。然后把这个胚胎移植到第三只羊（C羊）的子宫中，让C羊为胚胎发育提供发育场所和营养物质，这个过程利用了胚胎移植技术。胚胎就在C羊子宫内发育成熟。C羊产下的羊就是克隆羊
13、多利。多利产生的过程中没有使用基因工程技术。克隆体细胞克隆的应用 体细胞克隆大规模复制特定品种：如优良品种、转基因品种 干细胞治疗：患者细胞-重组胚胎-培育-分离ES细胞-诱导定向分化-导入患者体内（多能干细胞：具有分化为多种细胞的潜能，但失去发育成完整个体的能力）组织再生：如神经组织克隆 克隆动物问题1、早衰和先天缺陷2、干扰自然进化，个体高度均一3、克隆人社会伦理复习思考 概念：转基因动物、克隆动物、嵌合体动物、动物生物反应器 转基因动物的应用（案例）显微注射、逆转录病毒载体介导、DNA同源重组（基因打靶）在转基因效果上的区别 动物生物反应器的应用（案例）动物克隆技术的原理、种类、特点和应用 如何理解多利羊被称为“真正的克隆动物”
医学实验动物学课件：遗传工程动物及其应用
