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1、用Diva软件进行HLA-B27手动获取和分析一、样本制备：（同自动软件）二、Diva软件手动获取及分析：（1）.在“浏览框”建文件夹（HLA-B27）和实验组（HLA-B27），样本（日期），采 集管（HLA-B27），并重命名。（2）.将“浏览框”的采集箭头选中采集管，点击“ Cytometer”的参数parameter 页面，删除不必要的荧光参数，仅保留FITC和PE，散射光和FITC荧光参数均选 择线性，PE参数选择对数，FSC选择H高度信号，其余参数均选择A面积信号。 在Global Worksheet上做图，选择点图或直方图工具，总共画三个图，两个散点图， 一个直方图。1）散点图F
2、SC-H/SSC-A，选择点图工具，在空白处画出一个新的散点图：X Parameter 横轴参数：FSC-H，Y Parameter 纵轴参数：SSC-A；2）散点图FSC-H/CD3-PE，选择点图工具，在空白处画出一个新的散点图：X Parameter 横轴参数：FSC-H，Y Parameter 纵轴参数：PE-A，在图中画门P1圈上PE阳性的细胞；3）直方图HLA-B27-FITC/Count，选择直方图工具，在空白处画出一个新的直方 图：X Parameter 横轴参数：FITC-A；右键单击该图，选择“Show Population-P1”，单击右键，选择“Show Populat
3、ion Hierarchy”；选择间隔门工具，在直方图中画P2,圈定所有细胞；右键单击这个直方图，选择“ Creat Statics View ”对直方图进行统计，右键单 击统计图，选择“Edit Statistics View”，统计框中选择Tube Name、Mean和 Median；4）设计试剂参数，在Experiment菜单中选择Experiment Layout，在Lable标签中 输入各管样本对应的参数：FITCHLA-B27，PECD3。2）上机（1）标准微球样本：取1ml鞘液加入1滴标准微球上机，调整FSC、SSC电压使微球在FSC/SSC 图中显示在合适的位置，在FSC/PE
4、图中设门圈定微球，在FITC荧光通道中收集 微球荧光信号，根据说明书上在微球的平均荧光强度数值，乘以1024换算成在 FACSCantoII上的荧光强度数值（说明书上的荧光道数为256, FACSCantoII的FITC 取线性坐标为262144，故在FACSCantoII上荧光强度为说明书的1024倍），例如 微球的荧光强度被调至说明书上微球的平均荧光强度数值的位置：140，相对应位 置为143360左右。通过调节电压，使微球荧光强度稳定于此位置。（2）HLAB27 样本：在测定标准微球并调节好FITC电压后，不可再改变FITC的设置。通过 FSC/CD3PE设门圈定CD3阳性细胞（T淋巴细胞），检测其B27的平均荧光强度， 将其Median值和试剂后缀的大小比较，从而判定样本为阳性还是阴性。例如试剂 后缀为142,相应乘以1024倍后为145408，标本荧光强度均值小于145408为阴 性，反之为阳性。如果在临界值附近的弱阳性，须以其他方法确认，再提示阳性报告。
流式细胞仪4-用Diva软件进行HLA-B27手动获取和分析
