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1、流式双染测凋亡原理、步骤和结果判断一、原理:磷脂酰丝氨酸(Phosphatidylserine, PS)正常位于细胞膜的内侧，但在细 胞凋亡的早期，PS可从细胞膜的内侧翻转到细胞膜的表面，暴露在细胞外环境中。 Annexin-V是一种分子量为3536KD的Ca2+依赖性磷脂结合蛋白，能与PS高亲 和力特异性结合。将Annexin-V进行荧光素(FITC)标记，以标记了荧光素(FITC) 的Annexin-V作为荧光探针，利用流式细胞仪可检测细胞凋亡的发生。碘化丙啶(propidine iodide, PI)是一种核酸染料，它不能透过完整的细胞 膜，但在凋亡中晚期的细胞和坏死细胞，PI能够穿透细
2、胞膜而使细胞核红染，所 以PI主要检测坏死或中晚期调亡细胞(二者的膜都发生了破裂)。因此将 Annexin-V与PI匹配使用，就可以将早期凋亡细胞和中晚期以及坏死细胞区分开 来。二、步骤：1、无菌条件下获取新鲜的肝组织，置于事先消毒好的200目不锈钢细胞筛网上， 下接50ml小烧杯。用眼科剪把组织剪成小块，眼科镊去除小血管及结缔组织，用 玻璃棒轻轻研磨组织，使细胞脱落。待研磨充分后，用5%预冷的RPMI-1640液冲 洗，收集小烧杯中单细胞悬液，随后以500-1000r/min离心5min ,弃上清。重悬、 离心洗涤2次，以获得较纯化的肝细胞。将肝细胞悬液取样在光镜下用血细胞计 数板计数，调节
3、细胞数目至1 X106/ml。2、取1ml单细胞悬液，用预冷的PBS洗涤两次，然后加入1乂结合缓冲液1 ml重 悬细胞。3、取100ul加入到5ml的培养管中，加入5ulFITC标记的Annexin-V和5ul PI， 混匀后室温下避光孵育15min，然后再加入400ul的1X结合缓冲液。整个操作过 程动作要尽量轻柔，勿用力吹打细胞。4、反应完毕后尽快在一小时内上机检测，用FL通道检测FITC- Annexin V1荧光，FL2通道检测PI荧光。同时以不加FITC- AnnexinV及PI的一管作 为阴性对照。三、结果判断：凋亡中晚期的细胞和坏死细胞其胞膜有损伤，PI能够穿透细胞膜而使DNA被 PI着染产生红色荧光。而细胞膜保持完好的早期凋亡细胞对于细胞活性鉴定的染 料PI有抗染性，则不会有红色荧光产生，正常活细胞与之相似。在双变量流式细 胞仪的散点图上，左下象限显示活细胞，为(FITC-/PI-)；右上象限是非活细胞， 即坏死细胞，为(FITC+/PI+)；而右下象限为凋亡细胞，呈现(FITC+/PI-)。
流式测凋亡原理步骤和结果判断
