2提质粒XXXX年分子生物学实验

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1、1实实 验验 一一质粒质粒DNADNA的提取及鉴定的提取及鉴定2背景理论知识背景理论知识Section 13 掌握质粒信息和用途，学会自己看掌握质粒信息和用途，学会自己看质粒图谱质粒图谱 掌握快速提取小量质粒掌握快速提取小量质粒DNADNA的方法的方法 了解质粒了解质粒DNADNA提取的基本原理提取的基本原理 掌握琼脂糖凝胶电泳的方法掌握琼脂糖凝胶电泳的方法4定义：基因工程中携带目的基因进入宿主定义：基因工程中携带目的基因进入宿主 细胞进行扩增和表达的工具。细胞进行扩增和表达的工具。类型：大肠杆菌中的质粒、类型：大肠杆菌中的质粒、噬菌体、噬菌体、M13M13噬菌体、噬菌粒外，还有酵母人工噬菌体

2、、噬菌粒外，还有酵母人工染色体载体及动、植物病毒载体等。染色体载体及动、植物病毒载体等。5l复制子：一段具有特殊结构复制子：一段具有特殊结构的的DNADNA序列，使与序列，使与之结合的外源基因复制。之结合的外源基因复制。l可检测的遗传表型：如抗药性、显色表型反可检测的遗传表型：如抗药性、显色表型反应。应。l限制性内切酶的单一识别位点：便于外源基限制性内切酶的单一识别位点：便于外源基因的插入。因的插入。l适合的拷贝数：较高的拷贝数不仅有利于载适合的拷贝数：较高的拷贝数不仅有利于载体的制备；使细胞中克隆基因的剂量增加。体的制备；使细胞中克隆基因的剂量增加。6是是染色体外小型的双链环状的染色体外小型

3、的双链环状的DNADNA，常用载体之一，常用载体之一u自我复制自我复制u具有合适的限制酶切位点具有合适的限制酶切位点u筛选标记筛选标记 可编码某些遗传性状可编码某些遗传性状 如抗药性、耐受重金属、如抗药性、耐受重金属、产生细菌素等，被质粒转化的细菌也获得了额外产生细菌素等，被质粒转化的细菌也获得了额外的特性的特性u高拷贝数高拷贝数u小分子量小分子量1-200Kb 1-200Kb u高稳定性高稳定性7克隆载体克隆载体表达载体表达载体原核原核真核真核穿梭载体穿梭载体pGEM-T,pENTRpET28a(+),pGEX,pMAL pcDNA3.0,pEGFP-N3,pRK 根据用途分类根据用途分类8

4、质粒（原核载体）质粒（原核载体）910质粒（真核载体）质粒（真核载体）111.1.3 1.1.3 质粒提取一般步骤质粒提取一般步骤细菌培养物的生长细菌的收获和裂解质粒DNA的纯化12质粒提取的常用方法质粒提取的常用方法 碱解法、碱解法、煮沸法煮沸法（cDNA、pDNA变性、复性不同）苯酚抽提法苯酚抽提法（酸性、低离子强度时超螺旋在水相分布）CsClCsCl法法（EB插入造成DNA浮力密度不同）SDS SDS 裂解法裂解法（高盐浓度下大分子沉淀，质粒在上清）玻璃纤维膜法玻璃纤维膜法(试剂盒)1.1.3 1.1.3 质粒提取质粒提取13碱裂解法提取质粒碱裂解法提取质粒DNADNA 通过本实验学习和

5、掌握碱裂解法提取质粒的方法和技术。1.1.3 1.1.3 质粒提取质粒提取14 根据共价闭合环状质粒根据共价闭合环状质粒DNA和线性染色体和线性染色体DNA在在拓扑学上的差异来分离质粒拓扑学上的差异来分离质粒DNA。在pH12.0-12.5，线性的DNA双螺旋结构解开而被变性，尽管在这样的条件下，质粒DNA的氢键断裂，但两条互补链仍紧密结合。当加入pH4.8的KAc高盐缓冲液中和pH至中性时，共价闭合环状的质粒DNA复性迅速而准确，而线性的染色体DNA的两条互补链彼此已完全分开，复性慢，缠绕形成网状结构。通过离心，染色体DNA与RNA、蛋白质-SDS复合物等一起絮状沉淀下来而被除去。碱裂解法提

6、取质粒碱裂解法提取质粒DNADNA1.1.3 1.1.3 质粒提取质粒提取15实验操作实验操作Section 216含质粒载体（含质粒载体（pET28apET28a）和含目的基因质粒）和含目的基因质粒（pEGFP-N3pEGFP-N3）的大肠杆菌）的大肠杆菌DH5aDH5a溶液溶液I I 50 mmol/L 葡萄糖 5 mmol/L 三羟甲基氨基甲烷（Tris.HCl）（pH8.0）10 mmol/L 乙二胺四乙酸（EDTA）（pH8.0）溶液溶液IIII 0.4 mol/L NaOH，2%SDS（用前等体积混合）（用前等体积混合）溶液溶液IIIIII 5 mmol/L 乙酸钾，冰乙酸，H2O

7、 17 苯酚：氯仿苯酚：氯仿（2525：2424）氯仿：异戊醇氯仿：异戊醇(2424：1)1)无水乙醇，无水乙醇，70%70%乙醇乙醇(-20C保存)TETE缓冲液缓冲液:10mmol/L Tris.HCl,1 mmol/L EDTA(pH8.0)胰胰RNARNA酶酶 18任务分配：任务分配：A1A1和和B1B1提取提取pET28apET28a质粒质粒A2A2和和B2B2提取提取pEGFP-N3pEGFP-N3质粒质粒191 1、细菌培养和收集、细菌培养和收集将将3ml3ml含含KanKan的的LBLB液体培养基加入到试管中，液体培养基加入到试管中，接入含质粒的大肠杆菌，接入含质粒的大肠杆菌，

8、3737振荡培养过振荡培养过夜。（已完成）夜。（已完成）取取2.5mL2.5mL培养物倒入微量离心管（培养物倒入微量离心管（EPEP管）管）中中,10000rpm,10000rpm离心离心1min1min，吸去培养液。，吸去培养液。202 2、细菌裂解及质粒的提取、细菌裂解及质粒的提取将细胞沉淀悬浮于将细胞沉淀悬浮于100ul100ul溶液溶液I I中中,充分震荡混匀。充分震荡混匀。加加200ul200ul溶液溶液IIII(新鲜配制新鲜配制),),盖紧管盖盖紧管盖,轻轻混匀轻轻混匀内容物内容物,将离心管放将离心管放冰上冰上5min5min。加加150ul150ul溶液溶液III(III(冰上预

9、冷冰上预冷),),盖紧管口盖紧管口,轻轻颠轻轻颠倒倒数次使混匀。数次使混匀。冰上冰上放置放置5min5min。12000rpm12000rpm离心离心10min,10min,将上清转至另一将上清转至另一EPEP管管（作（作好标记）好标记）中。中。21l 向上清中加入向上清中加入等体积（等体积（450ul450ul）酚酚:氯仿氯仿(1:1)(1:1)（注意下层是有机相）（注意下层是有机相）,反复混匀。反复混匀。l 12000rpm,12000rpm,离心离心2 2分钟分钟,将上清将上清小心地小心地转移到另转移到另一离心管一离心管（标记！）（标记！）中中l 加入加入等体积（等体积（450ul450

10、ul）氯仿氯仿:异戊醇异戊醇 (24:1),(24:1),反复混匀。反复混匀。l 12000rpm,12000rpm,离心离心2 2分钟，分钟，取上清液于新的取上清液于新的EPEP管管中。中。3 3、质、质 粒粒 的的 纯纯 化化224 4、质粒的浓缩、质粒的浓缩加入加入2 2倍体积（倍体积（900ul900ul）无水乙醇）无水乙醇,混匀后混匀后,室温放置室温放置10min10min。12000rpm12000rpm离心离心5 5分钟，分钟，倒去上清液倒去上清液,把离心把离心管倒扣在吸水纸上管倒扣在吸水纸上,吸干液体。吸干液体。用用1ml 1ml 70%70%乙醇乙醇洗涤质粒洗涤质粒DNADN

11、A沉淀沉淀,振荡并振荡并离心离心,12000rpm,12000rpm离心离心2 2分钟，倒去上清液分钟，倒去上清液,空气中干燥空气中干燥5 510min10min。235 5、质粒的溶解和保存、质粒的溶解和保存加加20ul TE20ul TE缓冲液缓冲液,其中含有其中含有100ug/ml100ug/ml的胰的胰RNARNA酶酶,使使DNADNA完全溶解。完全溶解。-20-20保存保存。24样品保存1A1 1A2 1B1 1B2 2A1 2A2 2B1 2B2 3A1 3A2 3B1 3B2 4 5 67 8 910 11 1213 14 15256 6、质粒、质粒DNADNA的电泳检测的电泳检

12、测（1 1）琼脂糖凝胶的制备）琼脂糖凝胶的制备每每4 4人人制备一块琼脂糖凝胶（制备一块琼脂糖凝胶（6 6个泳道）个泳道）0.20.2克琼脂糖克琼脂糖+20+20毫升毫升TAETAE缓冲液，电炉融缓冲液，电炉融胶（胶（充分溶解充分溶解），稍微冷却加），稍微冷却加2 2 lgoldviewnalgoldviewna显示液，倒在电泳胶槽中，显示液，倒在电泳胶槽中，使胶凝固使胶凝固(20min)(20min)。26（2 2）每人每人1 1个样品，个样品，pET28apET28a或或pEGFP-N3pEGFP-N3。取取3 3 l l（记住自己（记住自己点样位置）点样位置）。接通电泳仪和电泳槽的电源接

13、通电泳仪和电泳槽的电源(注意正负极注意正负极)（+）恒压恒压150V,150V,电泳电泳10-2010-20分钟分钟紫外灯下观察并记录结果紫外灯下观察并记录结果(对面实验室拍照片对面实验室拍照片)分析结果。分析结果。27负极负极正极正极1A11A21B11B22A12A22B12B2MarkerMarker28l溶液溶液I I加入后充分悬浮加入后充分悬浮l溶液溶液IIII一次性加入后轻柔地颠倒混匀一次性加入后轻柔地颠倒混匀l溶液溶液IIIIII加入后轻柔地颠倒混匀加入后轻柔地颠倒混匀l酚抽提后小心吸取上清酚抽提后小心吸取上清l无水乙醇和无水乙醇和70%70%乙醇不要弄混乙醇不要弄混l微量加样器

14、的正确使用微量加样器的正确使用29移液器（排气式和排液式）移液器（排气式和排液式）1 1选择一支量程合适的移液器选择一支量程合适的移液器2 2设置移液量设置移液量3 3装枪头装枪头4 4检验移液量检验移液量5 5吸取一定体积的液体吸取一定体积的液体6 6目测吸入枪头的液体体积是否合理目测吸入枪头的液体体积是否合理7 7释放液体释放液体8 8退下枪头退下枪头30实验要求：实验要求：每人提取质粒每人提取质粒2 2份（份（pET28apET28a和和pEGFP-N3pEGFP-N3各各一份）一份）溶液每大组一套溶液每大组一套 枪每枪每2 2人一套人一套 Tips 2Tips 2人一套（人一套（3 3

15、盒）盒）31思思 考考 题题分子生物学实验常用的载体有哪些？它们的分子生物学实验常用的载体有哪些？它们的特点是什么？特点是什么？分离基因组分离基因组DNADNA和质粒和质粒DNADNA有哪些不同之处？有哪些不同之处？核酸分离过程中，酚、氯仿、异戊醇的作用核酸分离过程中，酚、氯仿、异戊醇的作用是什么？是什么？在在TETE缓冲液中为什么要加入缓冲液中为什么要加入EDTAEDTA？纯化的核酸如有酚和蛋白质的污染的话，对纯化的核酸如有酚和蛋白质的污染的话，对它的后期操作有何影响？它的后期操作有何影响？有哪些因素影响核酸的沉淀？有哪些因素影响核酸的沉淀？32下下 次次 实实 验验质粒质粒DNADNA的酶切鉴定的酶切鉴定及电泳检测及电泳检测33开始工作吧！开始工作吧！LETS BEGIN NOW！