基因工程技术原理及在农药中的应用

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1、1 第二章第二章 基因工程基因工程技术原理及在农药中的应用技术原理及在农药中的应用2本章，我们主要讨论本章，我们主要讨论4个问题：个问题：1.什么是基因工程什么是基因工程基因工程的概念。基因工程的概念。2.为什么能进行基因工程为什么能进行基因工程基因工程的原理和技基因工程的原理和技术。（包括术。（包括3大理论和大理论和3大技术准备）大技术准备）3.怎样进行基因工程怎样进行基因工程3大步骤（大步骤（DNA体外重组，体外重组，重组重组DNA导入宿主细胞后扩增和表达，基因工程后导入宿主细胞后扩增和表达，基因工程后处理）处理）4.基因工程的应用和前景基因工程的应用和前景对于医学来说即生产基对于医学来说

2、即生产基因工程产品、开展基因治疗等，在农药中的应用。因工程产品、开展基因治疗等，在农药中的应用。3第一节第一节 概概 述述一一.现代科学技术发展的现代科学技术发展的3个特点：个特点：（一）科学技术加速发展和急剧变革：（一）科学技术加速发展和急剧变革：1.当代科学发展成指数增长趋势，全世界发表科技论当代科学发展成指数增长趋势，全世界发表科技论文文60008000/天，平均天，平均1篇篇/10.8秒问世。秒问世。2.人类科技知识在人类科技知识在19世纪半衰期是世纪半衰期是50年，现在是年，现在是35年（终身教育学习）。年（终身教育学习）。3.1973年，年，Cohen Group第一次实现了细菌遗

3、传性状第一次实现了细菌遗传性状的转移的转移terr+nersrterrner，导致基因工程技术诞生，导致基因工程技术诞生，至至今不到今不到30年，人类已经拥有了克隆羊、猪等等的技术，年，人类已经拥有了克隆羊、猪等等的技术，可以复制一个生命体。（克隆羊多利可以复制一个生命体。（克隆羊多利19972003，体细，体细胞克隆，胚胎细胞克隆）胞克隆，胚胎细胞克隆）4PscloltetrRb-3nersrtetrner tetr nerOtetrne图图1 Cohen Group第一次实现了细菌遗传性状转移示意图第一次实现了细菌遗传性状转移示意图5 (二二)科学技术发展的综合化科学技术发展的综合化 1.

4、19世纪中叶，以科学技术是分离的，它们各有独自文化传统，世纪中叶，以科学技术是分离的，它们各有独自文化传统，它们的发展往往是脱节的。它们的发展往往是脱节的。2.科学回答科学回答“是什么是什么”“”“为什么为什么”，技术回答，技术回答“做什么做什么”“”“怎么怎么做做”。当今科技发展已经密不可分，科学里包含技术，技术里体现科。当今科技发展已经密不可分，科学里包含技术，技术里体现科学。学。3.当代科技发展有两种形式：一是突破，二是融合。突破是线性当代科技发展有两种形式：一是突破，二是融合。突破是线性的，即从研究开发新一代的科技成果取代原有一代科技成果。融合是的，即从研究开发新一代的科技成果取代原有

5、一代科技成果。融合是非线性的，即混合原有不同的科技领域，进而发展新产品，造成革命非线性的，即混合原有不同的科技领域，进而发展新产品，造成革命性市场，它们是互补和合作的结果。性市场，它们是互补和合作的结果。基因工程既是科学又是技术，既是突破，又是融合。她造成革命基因工程既是科学又是技术，既是突破，又是融合。她造成革命性市场（美国基因工程产品性市场（美国基因工程产品300亿美元亿美元/年，乙肝疫苗年，乙肝疫苗50美元美元/人）；人）；她是分子遗传学，生物化学，细胞学，细胞生物学，分子生物学相互她是分子遗传学，生物化学，细胞学，细胞生物学，分子生物学相互渗透，交叉融合、突破的结果。渗透，交叉融合、突

6、破的结果。6 (三三)科技发展必需和人文社会科学发展相结合：科技发展必需和人文社会科学发展相结合：1.当代各种全球性问题出现，从一定意义上来说是由于科学技术广泛当代各种全球性问题出现，从一定意义上来说是由于科学技术广泛应用于社会而引发的，如应用于社会而引发的，如TMD、NMD(布什对萨达姆布什对萨达姆)2.科学技术是第一生产力，而文化水平是人类把握科学技术的一个尺科学技术是第一生产力，而文化水平是人类把握科学技术的一个尺度。度。3.科学技术是一把双刃剑，原子核技术可以给人类带来光明，原子弹科学技术是一把双刃剑，原子核技术可以给人类带来光明，原子弹却可以把长崎、广岛夷为平地；克隆技术，基因工程技

7、术可以挽救濒临却可以把长崎、广岛夷为平地；克隆技术，基因工程技术可以挽救濒临灭绝的动物（国宝熊猫），也可以动摇人类以性爱为基础的生产方灭绝的动物（国宝熊猫），也可以动摇人类以性爱为基础的生产方式式（冷冰冰克隆人和自然人，情人节少了一个经济增长点；克隆战（冷冰冰克隆人和自然人，情人节少了一个经济增长点；克隆战争狂人和反战英雄；克隆争狂人和反战英雄；克隆idea孙悟空齐天大圣）。基因工程技术是当代孙悟空齐天大圣）。基因工程技术是当代科学技术重要的前沿。科学技术重要的前沿。7二基因工程的概念二基因工程的概念（一）基因（一）基因（gene）基因基因 从化学上来说，指的是一段从化学上来说，指的是一段DN

8、A或或RNA顺序，该顺序顺序，该顺序可以产生或影响某种表型（可以产生或影响某种表型（genotype，phenotype），可以由于），可以由于突变生成等位基因变异体（体细胞父源和母源；正常和突变基因）；突变生成等位基因变异体（体细胞父源和母源；正常和突变基因）；从遗传学上来说，基因代表一个遗传单位，一个功能单位，一个突从遗传学上来说，基因代表一个遗传单位，一个功能单位，一个突变单位。变单位。（二）基因工程（二）基因工程（genetic engineering）基因工程基因工程 在体外通过人工剪、接，将不同来源的在体外通过人工剪、接，将不同来源的DNA分子分子组成一个杂合组成一个杂合DNA分子

9、分子(DNA分子重组体分子重组体)，然后导入宿主细胞去复，然后导入宿主细胞去复制扩增或表达。因为通过人工设计制扩增或表达。因为通过人工设计,得到一定的设计方案，故称为得到一定的设计方案，故称为基因工程。由于整个操作在分子水平上进行，所以也称分子克隆。基因工程。由于整个操作在分子水平上进行，所以也称分子克隆。基因工程的基本特点是，分子水平操作，细胞水平表达。基因工程的基本特点是，分子水平操作，细胞水平表达。8 在这个过程中：在这个过程中：1.“基因剪刀基因剪刀”剪取剪取DNA的酶就像一把的酶就像一把“基因剪刀基因剪刀”2.“缝纫针缝纫针”连接不同来源连接不同来源DNA分子的酶就像一根分子的酶就像

10、一根“缝纫针缝纫针”，使二者连在一，使二者连在一起起 3.“交通工具交通工具”使用载体好比一辆车子使用载体好比一辆车子 4.“乘客乘客”有用基因如有用基因如IL2好比使乘客，车子把乘客送进理想天堂（宿主细胞）好比使乘客，车子把乘客送进理想天堂（宿主细胞）去繁衍生息，春华秋实，生产我们需要的产品或开展基因治疗去繁衍生息，春华秋实，生产我们需要的产品或开展基因治疗（IL2/LAK抗癌）。抗癌）。9 我们应该记住他们我们应该记住他们 1.第一个实现第一个实现DNA重组的人重组的人Berg 1972年，年，Berg用用E.coR切割切割SV40DNA和和phageDNA，经过，经过连接组成重组的连接组

11、成重组的DNA分子。分子。Berg是第一个实现是第一个实现DNA重组的人。重组的人。2.第一个取得基因工程成功的人第一个取得基因工程成功的人Cohen 1973年，年，Cohen Group将将E.coli的的tetr质粒质粒psclol和和nersrR6-3质质粒体外限制酶切割，连接成一个新的质粒，转化粒体外限制酶切割，连接成一个新的质粒，转化E.coli，在含四环，在含四环素和新霉素的平板上筛选出了素和新霉素的平板上筛选出了terrNer,实现了细菌遗传性状的转移。实现了细菌遗传性状的转移。这是基因工程史上的第一个克隆化并取得成功的例子，这一年被定这是基因工程史上的第一个克隆化并取得成功的

12、例子，这一年被定为基因工程诞生的元年。为基因工程诞生的元年。10三基因工程克隆技术三基因工程克隆技术人类对自然的干预人类对自然的干预 （一）遗传和变异是生物学的一对重要概念。（一）遗传和变异是生物学的一对重要概念。1.遗传赋予生物种的稳定，保证生物种的延绵不断（不能断香火）。遗传赋予生物种的稳定，保证生物种的延绵不断（不能断香火）。2.变异赋予生物种的进化，保证生物种对环境的适应。变异赋予生物种的进化，保证生物种对环境的适应。3.遗传和变异这一对矛盾在一个生物体内统一起来。遗传和变异这一对矛盾在一个生物体内统一起来。4.在生物演变的历史长河中，自然发生的变异是相当相当缓慢的。在生物演变的历史长

13、河中，自然发生的变异是相当相当缓慢的。5.随着生物科学的发展，尤其是基因工程技术的诞生，人类开始干预生随着生物科学的发展，尤其是基因工程技术的诞生，人类开始干预生物的变异（福耶祸耶？无法定论）物的变异（福耶祸耶？无法定论）6.经典的遗传学千百万年才能积累出现的有利的变异，通过基因工程手经典的遗传学千百万年才能积累出现的有利的变异，通过基因工程手段几十年乃至几年就可以实现。而时至今日，几乎一发不可收拾。段几十年乃至几年就可以实现。而时至今日，几乎一发不可收拾。11 (二二)多利多利 1997年年2月月23日，日，Nature杂志报道，英国爱丁斯堡罗斯林杂志报道，英国爱丁斯堡罗斯林研究所和研究所和

14、PPL生物技术公司已经成功克隆了一只名叫多利的生物技术公司已经成功克隆了一只名叫多利的绵羊（绵羊（19972003/7/12）。这一消息的公布，全世界震惊）。这一消息的公布，全世界震惊的程度不亚于原子弹在长崎和广岛的爆炸，在全球引起了轩的程度不亚于原子弹在长崎和广岛的爆炸，在全球引起了轩然大波，以至世人惊呼：不要让科学疯狂！然大波，以至世人惊呼：不要让科学疯狂！为什么以前胚胎克隆没有在世界上引起轩然大波呢为什么以前胚胎克隆没有在世界上引起轩然大波呢?原因原因是此克隆非彼克隆，多利取自功能彻底分化的成年动物乳腺是此克隆非彼克隆，多利取自功能彻底分化的成年动物乳腺细胞，即体细胞。它推翻了遗传学上一

15、条上百年的定律：体细胞，即体细胞。它推翻了遗传学上一条上百年的定律：体细胞功能高度分化，不可能重新发育成个体。细胞功能高度分化，不可能重新发育成个体。12 （三）多利诞生的过程（三）多利诞生的过程 为什么震惊和惊呼，我们先了解一下多利诞生的过程以及胚胎细胞为什么震惊和惊呼，我们先了解一下多利诞生的过程以及胚胎细胞克隆和体细胞克隆的区别这两个基本问题，对我们学习后面内容或许克隆和体细胞克隆的区别这两个基本问题，对我们学习后面内容或许有所帮助和启发。有所帮助和启发。多利诞生的过程：多利诞生的过程：1.取出第一只成年母羊乳腺的普通细胞，分离基因备用。取出第一只成年母羊乳腺的普通细胞，分离基因备用。2

16、.取出第二只母羊未受精的卵细胞，取出基因换上第一只羊乳腺细取出第二只母羊未受精的卵细胞，取出基因换上第一只羊乳腺细胞基因（胞基因（“掉包掉包”），放电激活该卵细胞，使之象正常受精卵一样进），放电激活该卵细胞，使之象正常受精卵一样进行细胞分裂，直至一定阶段，胚胎成熟。行细胞分裂，直至一定阶段，胚胎成熟。3.将成熟的胚胎移植到第三只母羊子宫中发育，妊娠（同正常一将成熟的胚胎移植到第三只母羊子宫中发育，妊娠（同正常一样），最后产下多利。样），最后产下多利。这样一只与第一只羊基因百分之百一样的复制品诞生了。这样一只与第一只羊基因百分之百一样的复制品诞生了。13（四）此克隆非彼克隆（四）此克隆非彼克隆

17、胚胎细胞克隆胚胎细胞克隆 体体 细细 胞胞 克克 隆隆供体细胞供体细胞 胚胎细胞（核）胚胎细胞（核）体细胞（核）体细胞（核）受体细胞受体细胞 去核未受精的卵细胞去核未受精的卵细胞 去核未受精的卵细胞去核未受精的卵细胞发育场所发育场所 母体宫腔母体宫腔 母体宫腔母体宫腔关键区别关键区别 克隆的是子代（多生了一个）克隆的是子代（多生了一个）复制的是自己（复制了一个）复制的是自己（复制了一个）14（五）克隆是一把双刃剑（五）克隆是一把双刃剑 试想，有了克隆技术，有人在你毫不知晓的情况下复制一个试想，有了克隆技术，有人在你毫不知晓的情况下复制一个“你你”去去犯罪，怎么办？试想，有了克隆技术，一些极权的

18、政治野心家一下子克隆犯罪，怎么办？试想，有了克隆技术，一些极权的政治野心家一下子克隆出好几个战争狂人希特勒、墨索里尼，怎么办？还有，有了克隆技术，世出好几个战争狂人希特勒、墨索里尼，怎么办？还有，有了克隆技术，世界上同时生活着多个你、我、父母、兄弟、姐妹，按现行的社会伦理道德界上同时生活着多个你、我、父母、兄弟、姐妹，按现行的社会伦理道德很难为其很难为其“名份名份”定位，又该怎么办？因此说克隆对人类社会伦理道德提定位，又该怎么办？因此说克隆对人类社会伦理道德提出了一场非同寻常的挑战，平添一系列是我非我、是父非父、是妻非妻、出了一场非同寻常的挑战，平添一系列是我非我、是父非父、是妻非妻、是子非子

19、之类的麻烦事，绝非危言耸听。从社会伦理角度看，用克隆技术是子非子之类的麻烦事，绝非危言耸听。从社会伦理角度看，用克隆技术培育出的人，有其特定的生理性状，这对人类的自然发展和人种的自然构培育出的人，有其特定的生理性状，这对人类的自然发展和人种的自然构成无疑会产生极大的影响。成无疑会产生极大的影响。15 从从家庭伦理家庭伦理角度看，将克隆技术用于人体繁殖，会加剧家庭多元化角度看，将克隆技术用于人体繁殖，会加剧家庭多元化倾向，还会从根本上改变人的亲系关系，确定人类亲系关系的标准也将倾向，还会从根本上改变人的亲系关系，确定人类亲系关系的标准也将发生改变。发生改变。从从性伦理性伦理角度看，它完全改变了人

20、类自然的基于性爱的生育方式，角度看，它完全改变了人类自然的基于性爱的生育方式，使人口的生产与性爱分离，从而破坏男女之间基于性受而获得后代的情使人口的生产与性爱分离，从而破坏男女之间基于性受而获得后代的情感，并由此改变人类的基本性伦理关系。感，并由此改变人类的基本性伦理关系。从从遗传学遗传学上看，人本来是由两性细胞结合而产生的，这种结合有利上看，人本来是由两性细胞结合而产生的，这种结合有利于人种进化，而克隆使人的遗传基因成为单一的，势必导致人种退化。于人种进化，而克隆使人的遗传基因成为单一的，势必导致人种退化。从从哲学哲学上看，克隆还会使人们正常的生与死的概念发生动摇。上看，克隆还会使人们正常的

21、生与死的概念发生动摇。16四基因工程四基因工程3大理论，大理论，3大技术准备：大技术准备：（一）理论上的（一）理论上的3大发现：大发现：1.20世纪世纪40年代，年代，Avery发现了生物遗传物质的化学本质发现了生物遗传物质的化学本质是是DNA。超越时代的科学成就往往不易被人们接受，。超越时代的科学成就往往不易被人们接受，Avery当时并未赢得阵阵掌声，他的论文事隔当时并未赢得阵阵掌声，他的论文事隔10年以后年以后才公开发表。才公开发表。2.20世纪世纪50年代，年代，Watson-crick提出了提出了DNA结构的双螺结构的双螺旋结构模型旋结构模型，搞清楚了生物遗传物质的分子机制。，搞清楚了

22、生物遗传物质的分子机制。3.20世纪世纪60年代，确定了遗传信息的传递方式年代，确定了遗传信息的传递方式：DNARNAPr,破译了全部遗传密码，破译了全部遗传密码，43。17 （二）（二）技术上的技术上的3大发明：大发明：1“基因剪刀基因剪刀”限制性内切酶的发明限制性内切酶的发明 （1）20世纪世纪4060年代，科学家们就为基因工程设计了美好的蓝年代，科学家们就为基因工程设计了美好的蓝图，但是面对庞大的图，但是面对庞大的dsDNA（104，2.2*1011公里）束手无策，无从下公里）束手无策，无从下手把它切成单个基因片断。手把它切成单个基因片断。（2）当时的酶学知识已有相当的发展，但是没有一个

23、已发现的酶能）当时的酶学知识已有相当的发展，但是没有一个已发现的酶能完成这样的使命。完成这样的使命。（3）1970年，年，Smith和和Wilcox在流感嗜血杆菌（在流感嗜血杆菌（Haemophilus inffuenzae）分离纯化了）分离纯化了Hind，取得了突破，打破了基因工程的禁，取得了突破，打破了基因工程的禁锢，迎来了改造生物的春天，为基因工程奠定了最为重要的技术基础。锢，迎来了改造生物的春天，为基因工程奠定了最为重要的技术基础。18 2载体载体(“交通工具车子交通工具车子”)基因工程技术诞生的第二个技术准基因工程技术诞生的第二个技术准备备 （1）有了切割与缝合（有了切割与缝合（li

24、gase）基因）基因DNA的工具，还得有一的工具，还得有一个车子（富康）将重组个车子（富康）将重组DNA送到宿主细胞中去。送到宿主细胞中去。（2）1946年起，年起，Lederberg就研究细菌性因子（就研究细菌性因子（F因子）因子）.50-60年代相继发现了年代相继发现了R因子（抗药因子），因子（抗药因子），CoE(大肠杆菌因子大肠杆菌因子)等质等质粒。粒。（3）然而，直到）然而，直到1973年年Cohen才能将质粒作为基因工程载体才能将质粒作为基因工程载体使用（至今一直是基因工程最重要最广泛使用的载体）。这是基使用（至今一直是基因工程最重要最广泛使用的载体）。这是基因工程的第二个技术准备。

25、因工程的第二个技术准备。19 3逆转录酶逆转录酶1970年年Baltimove和和Temin等同时各自发现了逆转录酶，等同时各自发现了逆转录酶，打破了遗传学（生物学）中心法则，使真核基因的制备成为可能。打破了遗传学（生物学）中心法则，使真核基因的制备成为可能。（原因如下）（原因如下）(1)真核基因组庞大而复杂，不易制得基因图谱。真核基因组庞大而复杂，不易制得基因图谱。HGP2005年完成，年完成，2.8万个基因，万个基因，13kb/基因，基因，104，2.2*1011公里。公里。（2）即使有了基因图谱，因为真核基因有内含子，不能在原核表）即使有了基因图谱，因为真核基因有内含子，不能在原核表达系

26、统剪接出达系统剪接出mRNA，没有成熟的，没有成熟的mRNA就不能得到相应得产物。就不能得到相应得产物。（3）经过逆转录）经过逆转录mRNAcDNA(complementory DNA)文库要比基文库要比基因组文库小得多，所以筛选阳性克隆就方便得多。因组文库小得多，所以筛选阳性克隆就方便得多。有了这些理论核技术的武装，基因工程的临盆降生指日可待，有了这些理论核技术的武装，基因工程的临盆降生指日可待，Berg和和Cohen两位科学的两位科学的“助产士助产士”，把基因工程接到了人间。，把基因工程接到了人间。20五与基因工程相关的概念：五与基因工程相关的概念：（一）克隆（一）克隆（clone,clo

27、ning）：1.原意是指单细胞纯系无性繁殖。原意是指单细胞纯系无性繁殖。2.现代概念是将实验得到的人们所需的微量基因结构，引入适当的宿主细胞中现代概念是将实验得到的人们所需的微量基因结构，引入适当的宿主细胞中去。在合适的生理环境中进行无性繁殖，从而利用宿主的生理机制繁衍人们所需要去。在合适的生理环境中进行无性繁殖，从而利用宿主的生理机制繁衍人们所需要的基因结构，并进行表达。由于整个操作在分子水平上进行，所以称为分子克隆的基因结构，并进行表达。由于整个操作在分子水平上进行，所以称为分子克隆（molecular cloning）。）。3.这个术语的几种含义：这个术语的几种含义：（1）作为名词）作为

28、名词 带有相同插入顺序的重组带有相同插入顺序的重组DNA分子的分子的1个群体。个群体。基因型（基因型（genetypegenetype）相同的细胞或生物体的一个群体。）相同的细胞或生物体的一个群体。最常用的是描述一个微生物的一个菌落，这些微生物带有插入了特定最常用的是描述一个微生物的一个菌落，这些微生物带有插入了特定DNADNA片片断的载体分子断的载体分子。（2 2）作为动词，是）作为动词，是“去克隆去克隆”，即利用体外即利用体外DNADNA重组技术将一个特定的基因或重组技术将一个特定的基因或DNADNA顺序插入一个载体分子。顺序插入一个载体分子。21 （二）重组（二）重组DNADNA技术技术

29、(DNA recombination technique)(DNA recombination technique)是用酶学的方法将不同来源的是用酶学的方法将不同来源的DNA在体外切割，连接组成一个杂合的在体外切割，连接组成一个杂合的DNA分子的技术。基因工程包括分子的技术。基因工程包括DNA重组技术，现将相关的概念关系列表重组技术，现将相关的概念关系列表如下。如下。（三）生物工程（三）生物工程（Biologic engineering）：是更大范围内生产及产品的工）：是更大范围内生产及产品的工程技术，是现代生物学中一切工程技术的总称，包括：程技术，是现代生物学中一切工程技术的总称，包括：1.

30、遗传工程遗传工程（genetic engineering）比较基因工程有更广泛的内容，比较基因工程有更广泛的内容，包括基因工程，但基因工程不等于遗传工程，凡是人工改造遗传性状的技包括基因工程，但基因工程不等于遗传工程，凡是人工改造遗传性状的技术都称之遗传工程，有个体的，细胞的，分子水平的。术都称之遗传工程，有个体的，细胞的，分子水平的。（1）基因工程：）基因工程：DNA重组；重组；DNA体外诱变；体外诱变；体外基因操作；体外基因操作；基因化学合成等。基因化学合成等。（2）物理化学诱变；）物理化学诱变；（3）细胞融合）细胞融合 （4）花粉培育）花粉培育 （5）有性杂交等。）有性杂交等。2发酵工程

31、发酵工程3酶学工程酶学工程4细胞工程细胞工程5农业工程农业工程6希望工程希望工程22第二节第二节 工工 具具 酶酶常用的工具酶（常用的工具酶（tool enzymes）有）有：1.限制性核酸内切酶（限制性核酸内切酶（resriction enzymes,restriction endonadease)2.DNA连接酶（连接酶（DNA ligase,ligase)3.逆转录酶逆转录酶(reverse transcriptase)4.DNA聚合酶聚合酶(DNA polymerase,DNA pol)5.核酸酶核酸酶(nuclease)6.末端转移酶末端转移酶(terminal transferas

32、e)7.碱性磷酸酶碱性磷酸酶(BAP或或CIP)以以1.和和2.最为常用，最为重要。工具酶现已商品化。最为常用，最为重要。工具酶现已商品化。23一限制性核酸内切酶一限制性核酸内切酶 （一）限制酶的概念（定义，分类，命名，限制与修饰辨正关系）（一）限制酶的概念（定义，分类，命名，限制与修饰辨正关系）1.定义定义 限制酶（限制酶（restriction endonuclease,restrction enzymes）是一类专门是一类专门切割切割DNA的酶，它们能特异结合一段被称为限制酶识别顺序的特殊的酶，它们能特异结合一段被称为限制酶识别顺序的特殊DNA序列。序列。并切割并切割dsDNA。所谓限制

33、（。所谓限制（restriction）=切割（切割（clearage）=水解（水解（hydrolysis）该部位的核苷键（磷酸二酯键）该部位的核苷键（磷酸二酯键）2.分类分类 限制酶都是从原核生物中发现的（限制酶都是从原核生物中发现的（400多种多种E/350M）。所有的限制）。所有的限制酶可分成酶可分成3类。类。（1）、型，兼具限制与修饰活性，它们识别与切割顺序不在一个地方，型，兼具限制与修饰活性，它们识别与切割顺序不在一个地方，不产生特异性的不产生特异性的DNA片段，与基因工程意义不大（有说片段，与基因工程意义不大（有说型识别核切割的位点型识别核切割的位点一致，但罕见）。一致，但罕见）。（

34、2）型型 基因工程说到的限制酶是基因工程说到的限制酶是型酶，具有此类酶的微生物限制修型酶，具有此类酶的微生物限制修饰系统分别由限制酶核甲基化酶来完成。饰系统分别由限制酶核甲基化酶来完成。型酶分子量小，仅需型酶分子量小，仅需Mg2作为催化作为催化反应的辅因子，识别与切割位点相同，产生特异的反应的辅因子，识别与切割位点相同，产生特异的DNA片段片段。243.3.命名（命名（1973年年Smith 原则、原则、型酶）型酶）根据分离此酶微生物的学名，一般取根据分离此酶微生物的学名，一般取3 3个字母。个字母。第一个字母大写第一个字母大写 该微生物属名前的第一个字母该微生物属名前的第一个字母第二、三个字

35、母小写第二、三个字母小写 该微生物种名前的该微生物种名前的2 2个字母个字母第四个字母大写第四个字母大写 有变种或品系的第一个字母有变种或品系的第一个字母罗马字母罗马字母、从一种微生物中发现了几种限从一种微生物中发现了几种限 制酶，按发现顺序排列制酶，按发现顺序排列 如如EcoREcoR是指从大肠杆菌（是指从大肠杆菌（Escherichia coliEscherichia coli）R R株分离得到株分离得到的第一种限制酶。的第一种限制酶。25(二二)限制酶的识别位点限制酶的识别位点 1 1 一般特征（一般特征（4 4点）：点）：（1 1）型酶型酶识别的特殊识别的特殊DNADNA序列序列称为限

36、制酶的识别位点（或切割位点）。称为限制酶的识别位点（或切割位点）。（2 2）它能）它能识别识别dsDNAdsDNA的的4 46bp6bp的回文序列并水解该部分的核苷键。的回文序列并水解该部分的核苷键。一般一般来说是来说是4 46bp6bp，有，有6 6个以上的，但没有个以上的，但没有4 4个以下的。个以下的。（3 3）识别顺序呈二重对称，即识别顺序呈二重对称，即1801800 0旋转对称。旋转对称。如：如：GC CG GTNAC GAA TTCGC CG GTNAC GAA TTC Hha CG GC Mae CANTG EcoR Hha CG GC Mae CANTG EcoR CTT AA

37、G CTT AAG (4)(4)酶靶顺序大小是很重要的，它决定产生特定酶靶顺序大小是很重要的，它决定产生特定DNA中段的大小。中段的大小。若若DNADNA碱基组成是均一的，限制酶切点是随机的，那么对于：碱基组成是均一的，限制酶切点是随机的，那么对于：要求要求4bp4bp靶序列如靶序列如Hpa,MboHpa,Mbo等在庞大等在庞大DNADNA链上平均链上平均44核苷酸即可遇核苷酸即可遇到一个靶序列，即到一个靶序列，即1/2561/256 同理，要求同理，要求6bp6bp的酶，则平均的酶，则平均46遇到一个靶序列，即遇到一个靶序列，即1/40961/4096。26 2.识别简并序列识别简并序列;简

38、并序列简并序列 是指序列中有核苷酸位可以是不同的核苷酸。如：是指序列中有核苷酸位可以是不同的核苷酸。如：GTYRAC Y=C或或T R=G或或A YR=CG或或CA或或TG或或TA Hin 实际上可以识别实际上可以识别4个特定序列。个特定序列。3.识别位点与切割位点不同，但二者距离是一定的识别位点与切割位点不同，但二者距离是一定的(某些酶识别位某些酶识别位点在切割位点附近点在切割位点附近),即产生特定的即产生特定的DNA片段，这是与片段，这是与型酶的区型酶的区别之一。别之一。Hga 识别位点识别位点GACGC5/10(核苷酸距离核苷酸距离)dsDNA上切割上切割 5 GACGC NNNNN N

39、NNNN 3 3 CTGCG NNNNN NNNNN 5 先识别（搞清楚）滑行一段距离再切，此称为先识别（搞清楚）滑行一段距离再切，此称为Distant cleavage 27(三三)限制酶的切割位点：限制酶的切割位点：限制性对限制性对dsDNAdsDNA 2 2条链同时切割（其具体切割点，即磷酸二酯键条链同时切割（其具体切割点，即磷酸二酯键断开的位点，相对二重对称轴的位置而异）产生断开的位点，相对二重对称轴的位置而异）产生3 3种不同切口：种不同切口：1 1 形成平头末端（形成平头末端（flushflush或或bluntendbluntend）如）如 TCGA-smabsuRTCGA-sma

40、bsuR or TC3 or TC3+5+5GA-GA-AG CT-AluAG CT-Alu -AG5 -AG5+3+3CT-CT-2.2.形成形成55粘性末端粘性末端 （55cohesive endcohesive end即即33延伸末端）延伸末端）5-GAATTC3EcoR 5-G AATTC-35-GAATTC3EcoR 5-G AATTC-3 +3-CTTAAG5 3-CTTAA G-5 3-CTTAAG5 3-CTTAA G-53.3.形成形成33粘性末端（粘性末端（33cohesive endcohesive end）5 5CTGCAG 3 pstCTGCAG 3 pst G-3

41、5-CTGCA G-3 5-CTGCA +3GACGTC 5 ACGTC-5 3-G 3GACGTC 5 ACGTC-5 3-G 粘性末端（粘性末端（sticky endsticky end）限制酶切割产生限制酶切割产生2 2个突出的末端称之，作个突出的末端称之，作用是放在一起自发形成双链。用是放在一起自发形成双链。2829常用限制酶的种类及切割方式30 （四）（四）同裂酶同裂酶(isoschizomers)通常不同的酶识别不同的顺序，然而有许多不同源限制酶产生相同通常不同的酶识别不同的顺序，然而有许多不同源限制酶产生相同的末端，此即同裂酶。的末端，此即同裂酶。1异源同工酶异源同工酶（Isos

42、chizomers:来源不同，识别顺序相同，切割方式可同可不同：来源不同，识别顺序相同，切割方式可同可不同：(1)识别顺序与切割方式同，如：识别顺序与切割方式同，如：Mbo 5和和SauS 3（NNGATCNN-3）-NNCTAGNN-5 (2)识别顺序同，切割位点不同，如：识别顺序同，切割位点不同，如：Sma和和Xma CCCGGG CCCGGG (3)识别与切割相同，但其中一酶可以切识别与切割相同，但其中一酶可以切“修饰修饰”（甲基化（甲基化*），另一酶不能。如：），另一酶不能。如：HpaCCGG MspCCG*G MboGATC Sau 3AGA*TC 2.一个位点包含在另一个位点之中一

43、个位点包含在另一个位点之中（称（称subsets-识别与切割相互有关的酶称之。）识别与切割相互有关的酶称之。）Hpa CCGG Sma的的6个个bp含含Hpa的的4个个bp顺序，所以顺序，所以Hpa Sma CCCGGG 能识别与切割能识别与切割Sma的的6个个bp，但含有，但含有Hpa的的ccgg其它其它6核苷酸核苷酸 顺序顺序都不能被都不能被Sma切割。切割。3同尾酶（同尾酶（isoaudumers-识别顺序不同，产生粘性末端相同的酶称之。）识别顺序不同，产生粘性末端相同的酶称之。）BamH GGATCC 由此产生的由此产生的DNA片段可借粘性末端相互连接，片段可借粘性末端相互连接，Sau

44、 3A NGATCN 在在DNA重组时具有更大的灵活性。重组时具有更大的灵活性。31(五五)限制酶得正常识别切割能力是限制酶得正常识别切割能力是bufferbuffer的或几个因子的函数（的或几个因子的函数（1 18 8等）等）1.1.酶浓度酶浓度 2.2.酶的专一性酶的专一性 3.3.离子浓度离子浓度 4.pH 5.4.pH 5.温度温度 6.6.底物浓度、底物浓度、纯度纯度 7.27.2价离子：价离子：MgMg2+2+、MnMn2+2+、CoCo2+2+、ZnZn2 2 8.8.保护剂：甘油、保护剂：甘油、DMSODMSO、甲酰、甲酰胺胺 PoliskyPolisky证明，证明，MgclM

45、gcl2 2从从5mM5mM下降至下降至2mM2mM，pHpH值上升到值上升到8.58.5，EcoRIEcoRI专一性专一性从从6bp6bp下降至下降至4bp4bp即即NAATN,NAATN,这种识别这种识别AATTAATT的的EcoRIEcoRI称称EcoRIEcoRI*。一种限制酶可能。一种限制酶可能被它识别位点的甲基所抑制，这对于组建被它识别位点的甲基所抑制，这对于组建DNADNA甲基化图谱是很重要的，是研甲基化图谱是很重要的，是研究一个动向。对于限制反应机制，尽管书上列出究一个动向。对于限制反应机制，尽管书上列出1 1，2 2步反应，但人们更关步反应，但人们更关注他的应用。所以这方面资

46、料极少（全球注他的应用。所以这方面资料极少（全球1 12 2人）。人）。（六）限制酶的应用：（六）限制酶的应用：1 1DNADNA重组重组 2.2.分子杂交受体体段分子杂交受体体段DNA 3.DNA DNA 3.DNA 序列分析序列分析 4.4.制备制备DNADNA指指针针 5.5.基因定位基因定位,DNA 7.DNA,DNA 7.DNA甲基化碱基的识别和切割甲基化碱基的识别和切割 8.8.组建新质粒组建新质粒32 DNA物理图谱物理图谱标明限制酶在标明限制酶在DNA分子上的限制位点数，分子上的限制位点数，限制性片段的大小及排列顺序的图谱称之或称限制性图谱。组限制性片段的大小及排列顺序的图谱称

47、之或称限制性图谱。组建图谱是基因工程的第一步工作（很难，拿来主义多，受惠赠，建图谱是基因工程的第一步工作（很难，拿来主义多，受惠赠，千万注意要图谱，不要受骗），与基因定位，转录，消化，分千万注意要图谱，不要受骗），与基因定位，转录，消化，分离，分子杂交，克隆转化有直接的关系。离，分子杂交，克隆转化有直接的关系。33二二DNA连接酶：连接酶：DNA连接酶是基因工程第二位重要的工具酶，常用连接酶是基因工程第二位重要的工具酶，常用T4DNA ligase.（一）功能：（一）功能：催化有互补顺序的两个催化有互补顺序的两个dsDNA分子的粘性末端或平头末端分子的粘性末端或平头末端3OH、5P连接作用。连

48、接作用。（二）来源（二）来源噬菌体噬菌体T4感染感染Ecoli分离的一种单链多肽酶、分离的一种单链多肽酶、MW.68KD。（三）催化反应：（三）催化反应：（1）需要）需要ATP、Mg2+作辅助因子；作辅助因子；（2）缺刻（）缺刻（Nick）DNA也可作该酶的底物。也可作该酶的底物。（3）对粘性末端催化活性大于平头末端（酶量）对粘性末端催化活性大于平头末端（酶量1：100）34三、逆转录酶三、逆转录酶（一）概述（一）概述 逆转录酶也称反转录酶或逆转录酶也称反转录酶或RNA依赖的依赖的DNA聚合酶（聚合酶（RNA dependent DNA polymerase,RDDP）。是由）。是由Balti

49、move从鼠白血病病从鼠白血病病毒（毒（murine leukemia virus,MLV）和）和Mizutan从劳氏肉瘤病毒从劳氏肉瘤病毒(Rous sarcoma virus,RSV)中，于中，于1970年分别各自发现的，这两个小组论文年分别各自发现的，这两个小组论文同时在同一期同时在同一期Nature上，可见其意义。该酶在逆转录病毒（上，可见其意义。该酶在逆转录病毒（retro virus）生产循环中起主宰作用。）生产循环中起主宰作用。（二）功 能（二）功 能 基 因 工 程 中 主 要 用 于 逆 转 录基 因 工 程 中 主 要 用 于 逆 转 录 m R N A c D N A（c

50、omplementory DNA）。）。（三）商品化逆转录酶有两种（三）商品化逆转录酶有两种 AMV（禽成髓细胞瘤）（禽成髓细胞瘤）Mc-MLV(鼠鼠白血病病毒白血病病毒)。35（四）酶的活性（四）酶的活性 由 于 尚 不 完 全 清 楚 原 因，由 于 尚 不 完 全 清 楚 原 因，s s c D N A 能 形 成 发 夹 结 构，引 导能 形 成 发 夹 结 构，引 导 E c o l i DNApolkelnow片段或录酶合成片段或录酶合成cDNA第二条链，（多年来除了自身引导合成第二条链，（多年来除了自身引导合成cDNA第二条链外别无它法）。第二条链外别无它法）。逆转录酶是一种多功

51、能酶，它的酶活性有：逆转录酶是一种多功能酶，它的酶活性有：1.逆转录酶逆转录酶 以以mRNA为模板合成为模板合成cDNA 2.DNA依赖依赖DNApol 以以ssDNA为模板，为模板，3OHDNA片段为引物，按片段为引物，按53合成合成DNA链。链。3.RnaseH 外切外切RNA酶活性，底物是酶活性，底物是RNADNA杂交分子杂交分子RNA链，有两种：链，有两种：53外切外切RNA，称，称53外切外切RNA酶；酶；35外切外切RNA酶，称酶，称35外切外切RNA酶，也称酶，也称RnaseH。4.DNA内核酸酶内核酸酶 Mn2存在时，逆转录酶能切存在时，逆转录酶能切cccDNA，此活性，此活性

52、 无专一位点，无专一位点，对热不稳定。对热不稳定。5.DNA解旋酶解旋酶 类似类似unwinding。36四、四、DNA聚合酶：聚合酶：DNA聚合酶以聚合酶以DNA为模板合成为模板合成DNA，基因工程常用的酶有：，基因工程常用的酶有：（一）大肠杆菌（一）大肠杆菌DNA聚合酶聚合酶（E.coli DNA pol）1956年，年，A.kornberg首先从首先从E.coli中分离得到。是由中分离得到。是由1条多肽链组成的球蛋条多肽链组成的球蛋白直径白直径65，MW109KD，并以蛋白敏感的多肽接头折叠成两个区域含，并以蛋白敏感的多肽接头折叠成两个区域含1945螺旋结构，分子中有单链巯基，每分子含螺

53、旋结构，分子中有单链巯基，每分子含1个个Zn2原子，还不能证明原子，还不能证明Zn2参参加了催化反应，酶活性中心有加了催化反应，酶活性中心有3个密切相连的结合位点即个密切相连的结合位点即DNA核模，核苷磷核模，核苷磷酸（估计引物，生长链痘结合在这里）和酸（估计引物，生长链痘结合在这里）和dNTP结合位点。结合位点。1E.coli DNA pol由大小两亚基组成，具有由大小两亚基组成，具有3种酶活性，即大亚基种酶活性，即大亚基53DNA聚合酶，聚合酶，35外切酶及小亚基的外切酶及小亚基的53外切酶活性：外切酶活性：（1）53DNA聚合酶活性聚合酶活性 以以ssDNA为模板，沿引物为模板，沿引物3

54、OH方向，按模方向，按模板顺序从板顺序从53延伸。延伸。5CCGATAOH E.coli DNA pol 5CCGATAGCCT 3 3GGCTATCGGA5 Mg2dDNP 3GGCTCGGA 5 37四、四、DNA聚合酶：聚合酶：DNA聚合酶以聚合酶以DNA为模板合成为模板合成DNA，基因工程常用的酶有：，基因工程常用的酶有：（一）大肠杆菌（一）大肠杆菌DNA聚合酶聚合酶（E.coli DNA pol）（2）35外切酶活性外切酶活性 即从游离的即从游离的3OH末端降解末端降解ssDNA或或dsDNA，其意义在于识别和消除不配对的核酸，保证其意义在于识别和消除不配对的核酸，保证DNA复制的忠

55、实性。其复制的忠实性。其dsDNA外外切活性可被切活性可被53聚合活性所抑制。聚合活性所抑制。5CGCATCG-OH 3 E.coli DNA pol 5CGC 3 GCG Mg2 3 GCG dAdTdCdG 其其dsDNA外切酶活性可被外切酶活性可被53DNA聚合酶活性所抑制。聚合酶活性所抑制。（3）53外切酶活性：外切酶活性：从游离的从游离的5端降解端降解dsDNA成单核苷酸或寡核苷成单核苷酸或寡核苷酸，也降解酸，也降解DNA:RNA杂交体杂交体RNA成分（具有成分（具有RnaseH活性活性）5CTCATTAG3 E.coli DNA pol 5CATTAG3GCGTAATC5 Mg2

56、3GCGTAATC +pC,pG382.E.coli DNA pol(DNA pol)在基因工程的应用：在基因工程的应用：（1）制备高比活性的探针）制备高比活性的探针 DNA pol可催化可催化DNA缺口移位反应（缺口移位反应（Nick translation），为基因工程制备高比活性放射性探针（放标，非放标，），为基因工程制备高比活性放射性探针（放标，非放标，32P，地高，地高辛辛6400.00/盒）盒）53 35 dsDNA Mg2 DNA酶酶 5 3 （35）32P dNTP,DNA pol（全酶）（全酶）（2）用于分子克隆（填充缺口利于重组）用于分子克隆（填充缺口利于重组）DNA po

57、l能填充能填充DNA的小缺口区（的小缺口区（Gapped region）以便有效在体外用于以便有效在体外用于DNA分子重组，如：分子重组，如：切割切割cccdsDNA分子作载体时分子作载体时 插入一段不具粘性末端的插入一段不具粘性末端的DNA片段或加入片段或加入1个同源顺序个同源顺序ssDNA片段片段 此时用此时用DNA pol填充这个缺口填充这个缺口 再用再用ligase(3-OH,P-5)连接，组成重组连接，组成重组DNA分子。分子。39（3 3）DNADNA序列分析序列分析 DNA pol是是3种测测序法（种测测序法（Sanger双脱氧法（测序自动化原理同双脱氧法（测序自动化原理同Sau

58、ger双脱氧法），化学降解法和加减法）中的关键试剂双脱氧法），化学降解法和加减法）中的关键试剂每个方法的成败都取决每个方法的成败都取决于于DNA pol从融合引物复制的从融合引物复制的ssDNA的能力（详参的能力（详参DNA的序列测定），这的序列测定），这里仅作简介。里仅作简介。Sauger双脱氧法双脱氧法 DNA pol参入了参入了23双脱氧核苷酸到相应的融合了的引物中，从而双脱氧核苷酸到相应的融合了的引物中，从而终止了链的进一步延伸，这样每个大小不同片段都带有终止了链的进一步延伸，这样每个大小不同片段都带有ddNTP。经过。经过PAGE测出测出DNA顺序。顺序。化学降解法化学降解法 当当M

59、g2被被Mn2取代时，取代时，DNA pol有参与相应有参与相应NTP取代取代dNTP的能力，的能力，参与的这个参与的这个NTP可以作为可以作为1个特殊切割位点而被降解，得到带有个特殊切割位点而被降解，得到带有NTP末端的末端的DNA片段，这是化学法测序的主要原理。片段，这是化学法测序的主要原理。40（3 3）DNADNA序列分析序列分析 加减法加减法 主要原理是在限制使用主要原理是在限制使用dNTP条件下加入条件下加入DNA pol和和T4诱导的诱导的DNA pol同时反应。在减法反应中从同时反应。在减法反应中从4个反应混合物中每个反应混合物中每4个个dNTP中减去中减去1个。生长链沿着引个

60、。生长链沿着引物延伸至缺少的那个物延伸至缺少的那个dNTP为止。在加法反应中所用的为止。在加法反应中所用的dNTP只有只有1种，如种，如dATP，通过，通过DNA pol 35外切酶活性使链终止在带有外切酶活性使链终止在带有A的的3末端用其末端用其它它3种种dNTP进行类似反应，这样通过加或减法进行类似反应，这样通过加或减法8个混合个混合物的电泳结果即可推出物的电泳结果即可推出DNA链的顺序。链的顺序。41（二）大肠杆菌（二）大肠杆菌DNA聚合酶聚合酶的大片段的大片段Klenow片段酶片段酶 基因工程很多情况下，基因工程很多情况下，E.coli DNA pol可用它的可用它的1个大片段个大片段

61、Klenow片段酶片段酶代替。该酶是枯草杆菌蛋白酶或胰蛋白酶降解代替。该酶是枯草杆菌蛋白酶或胰蛋白酶降解E.coli DNA pol所得到的。所得到的。1.Klenow大片段是一条多肽链，大片段是一条多肽链，MW76KD，保留，保留了了E.coli pol 的的53DNA聚合酶，聚合酶，35外切酶活性外切酶活性。2.Klenow在基因工程用于：在基因工程用于：(1)补平用限制酶消化补平用限制酶消化dsDNA得到的得到的5粘性末端（即粘性末端（即3延伸末端）延伸末端）5G-OH Klenow,Mg2 5GAATT 3CTTAA Dntp 3CTTAA (2)同（同（1），填平过程中，用），填平过

62、程中，用32p dNTP标记标记DNA片段片段3末端。末端。(3)cDNA克隆了中，用于合成克隆了中，用于合成cDNA的第二条链。的第二条链。(4)在在Sanger双脱氧法双脱氧法 ddNTP系统进行序列分析。系统进行序列分析。42（三）（三）T7T7噬菌体噬菌体DNADNA聚合酶及测序酶聚合酶及测序酶:1.1.T7噬菌体噬菌体DNA聚合酶聚合酶 （1 1）来源）来源 T7T7噬菌体感染的噬菌体感染的E.coliE.coli诱生的诱生的DNApolDNApol是两种蛋白的复合是两种蛋白的复合物（物（T7T7噬菌体基因蛋白和宿主硫氧还原蛋白的紧密复合体）。噬菌体基因蛋白和宿主硫氧还原蛋白的紧密复

63、合体）。（2 2）酶的活性酶的活性 与与KlenowKlenow片段（酶）相似，有片段（酶）相似，有5533聚合活性以聚合活性以及及3355外切酶活性，无外切酶活性，无5533外切酶活性。外切酶活性。5533聚合活性聚合活性 其其5533聚合能力和合成聚合能力和合成DNADNA平均长度较目平均长度较目前已知的其它任何前已知的其它任何DNA polDNA pol 都强（持续聚合能力强）。可用于拷贝长都强（持续聚合能力强）。可用于拷贝长段模板的引物延伸反应。段模板的引物延伸反应。3355外切酶活性外切酶活性 较较KlenowKlenow酶强酶强10001000倍，其用途与倍，其用途与KlenowK

64、lenow酶一酶一致，不同的是在于可对致，不同的是在于可对33突出端的突出端的DNADNA分子进行末端标记。分子进行末端标记。2测序酶测序酶 是经过基因工程改造是经过基因工程改造的的T7噬菌体噬菌体DNA pol，它完全丧失了外切酶，它完全丧失了外切酶的活性，故该酶是的活性，故该酶是SangerSanger双脱氧法对长片段双脱氧法对长片段DNADNA进行序列分析的理想进行序列分析的理想用酶（商品名即测序酶）。用酶（商品名即测序酶）。43 （四）（四）TaqDNA聚合酶聚合酶(Taq DNA pol，Taq pol）该酶是一种耐热的依赖于该酶是一种耐热的依赖于DNA的的DNA聚合酶，具有聚合酶，

65、具有53聚合活性以聚合活性以及依赖及依赖53聚合酶作用的外切酶活性，聚合酶的最适反应温度是聚合酶作用的外切酶活性，聚合酶的最适反应温度是7580,37,37 活性有活性有1010。该酶的主要用途是进行。该酶的主要用途是进行PCRPCR反应（详参聚合酶反应（详参聚合酶链，链，polymerase chain reactionpolymerase chain reaction）1.1.来源来源 19691969年在美国黄石公园温泉分离出一种嗜热真菌，即水生年在美国黄石公园温泉分离出一种嗜热真菌，即水生栖热菌株（栖热菌株（thermus aquaticusthermus aquaticus stra

66、in,TYC strain,TYC），该菌能在），该菌能在70707575生生长，已经克隆化该菌的基因，长，已经克隆化该菌的基因，cetuscetus公司首次分离纯化了该酶，商品名为公司首次分离纯化了该酶，商品名为TaqTaq DNA polymerase DNA polymerase，分子量，分子量94KD94KD，2020至少可贮存至少可贮存6 6个月，由于个月，由于TaqTaq DNA polymeraseDNA polymerase能抵抗链分离所需要的高温（能抵抗链分离所需要的高温（94949595）的反复处理，）的反复处理，故只需在第一次热变性后，加一次酶，即可以进行故只需在第一次热变性后，加一次酶，即可以进行30304040次循环，简化次循环，简化加快了操作程序，实现了加快了操作程序，实现了PCRPCR的自动化，耐热酶还有的自动化，耐热酶还有VENTVENT、sacsac等，以等，以TaqTaq应用最广。应用最广。44 2.使用使用Taq pol主要考虑下述主要考虑下述5个参数（个参数（PCR）（1）热稳定性）热稳定性 PCR cycle中，中，DNA变性处理通常变性处理通