临床微生物学检验：分枝杆菌属检验

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1、分枝杆菌属分枝杆菌属（MycobacteriumMycobacterium)第一节 结核分枝杆菌复合群第二节 非结核分枝杆菌第三节 麻风分枝杆菌 缓慢生长菌缓慢生长菌 迅速生长菌迅速生长菌 不能培养菌不能培养菌麻风分枝杆菌麻风分枝杆菌龟脓肿分枝杆菌群龟脓肿分枝杆菌群偶发分枝杆菌偶发分枝杆菌分枝杆菌属分枝杆菌属结核分枝杆菌结核分枝杆菌牛分枝杆菌牛分枝杆菌非洲分枝杆菌非洲分枝杆菌坎纳分枝杆菌坎纳分枝杆菌田鼠分枝杆菌田鼠分枝杆菌卡介苗卡介苗鸟分枝杆菌复合群鸟分枝杆菌复合群堪萨斯分枝杆菌堪萨斯分枝杆菌戈登分枝杆菌戈登分枝杆菌非非结结核核分分枝枝杆杆菌菌结核结核分枝分枝杆菌杆菌复合群复合群培养培养7 7

2、天内长天内长出菌落者出菌落者培养培养7 7天以上天以上长出菌落者长出菌落者分枝杆菌属分类 是一类直或微弯曲的杆菌，有分枝生长趋势，抗酸染色阳性。细胞壁脂质含量高，耐酸碱,对氧和营养要求高，生长慢。不产生毒素和侵袭酶类，多为菌体成分致病，感染为慢性。分枝杆菌属特点第一节 结核分枝杆菌复合群（Mycobacterium tuberculosis complex，MTBC)内容 分类 临床意义 生物学特性 微生物学检验一、分类一、分类结核分枝杆菌牛分枝杆菌非洲分枝杆菌坎纳分枝杆菌田鼠分枝杆菌卡介苗结核结核分枝分枝杆菌杆菌复合群复合群结核分枝杆菌复合群中结核分枝杆菌感染的发病率最高，约占90%。全球三

3、大传染疾病二、临床意义二、临床意义爱滋病（AIDS）结核病（TB）疟疾（Malaria）结核病近年来发病成上升趋势，已成为危胁人类健康的严重的全球性重大公共卫生问题。1.致病物质荚膜脂质：索状因子索状因子 磷脂 硫酸脑苷酯蜡质蛋白质尚未发现产生内外毒素及侵袭性酶，主要由细菌繁殖产生的炎症、炎症、菌体成分菌体成分和代谢物质的毒和代谢物质的毒性、以及免疫损伤性、以及免疫损伤引起病变。主要致病物质二、临床意义二、临床意义抑制呼吸，慢性肉芽肿抑制呼吸，慢性肉芽肿结核结节形成结核结节形成细胞内存活细胞内存活佐剂、超敏反应佐剂、超敏反应超敏反应超敏反应2.所致疾病 结核分枝杆菌通过呼吸道、消化道和破损的皮

4、肤粘膜进入机体，侵犯多种组织器官，引起相应器官感染，其中以肺结核最常见。二、临床意义二、临床意义脊柱结核脊柱结核继发性肺结核继发性肺结核皮肤结核皮肤结核脑结核脑结核脊椎结核导致脊椎畸形患者脊椎结核导致脊椎畸形患者 Bacteria coughedup in sputum Inhalation of bacteriaBacteria reach lungs,enter macrophagesBacteria reproducein macrophagesLesion begins to form(caseous necrosis)ActivatedmacrophagesBacteria ceas

5、e togrow;lesion calcifiesImmunesuppressionReactivationLesionliquefiesDeadphagocytes,necrosisM.tuberculosisPhagocytes,T cells,andB cellstrying tokill bacteriaDeathSpread toblood organs结核病的预防二、临床意义二、临床意义3.免疫性 TB菌的感染率很高，发病率却较低。抗结核的 免疫称为有菌免疫。抗体无保护作用，临床辅助诊断有意义。细胞 免疫发挥重要抗感染作用。可产生迟发性超敏反应 结核菌素试验二、临床意义二、临床意义

6、三、生物学特性1.形态结构菌体细长略弯曲，有时可见分枝，抗酸染色呈红色；呈单、成堆或成束排列；可出现多形性，在陈旧的病灶和培养物中，形态常不典型。萋尼抗酸性染色法染萋尼抗酸性染色法染色，菌体染成色，菌体染成红色红色荧光染料金胺荧光染料金胺O染色，在染色，在荧光下菌体呈荧光下菌体呈橘黄色橘黄色2.培养特性馋:专性需氧,营养要求高（L-J培养基）懒:生长温度35,生长缓慢,18小时繁殖一代丑:液体培养基呈粗糙皱纹状菌膜生长,固体培 养基（L-J)上形成形似菜花样典型菌落。三、生物学特性典型形态多形性R型菌落S型菌落有毒无毒（卡介苗）抗结核药敏感耐药3.变异性三、生物学特性卡介苗卡介苗：是有毒力的牛

7、型结核分枝杆菌在甘油、胆汁和马铃薯的培养基中经13年230次传代而获得的减毒变异株对某些理化因子的抵抗力较强：耐干燥 耐酸碱 耐一定浓度的孔雀绿 湿热 紫外线 酒精4.抵抗力“三耐三耐三不耐三不耐”不耐受三、生物学特性 临床标本涂片检查 分离培养HPLC分子鉴定免疫学鉴定直接涂片集菌涂片处理标本或无污染标本 染色液体培养基 固体培养基动物试验（L-J培养基）抗酸.金胺O.35 涂片镜检仪器培养 7天生长7天生长快速生长菌慢生长菌 初步鉴定抗酸染色菌落特点鉴定试验药敏试验四、微生物学检验检验程序（一）标本采集据感染部位的不同采集不同的标本 疑肺结核：收集清晨第一口痰，清洁干燥的容器内送检。疑泌尿

8、系结核：清晨第一次中段尿15ml送检，必要时作无菌导尿送检。采集脓液应直接从溃疡处取脓汁或分泌物,深部脓肿用无菌注射器抽取送检 其他：无菌抽取脑脊液、胸水、腹水及关节液等盛无菌试管送检。脑脊液标本静置后，表面可有细薄凝块，取凝块作涂片或接种培养。常见标本：痰、尿、胸腹水等直接涂片或浓缩集菌涂片，使涂片面积大约为2cm1cm大小，然后进行金胺O荧光染色和抗酸染色。（二）直接涂片检查结核分枝杆菌金胺结核分枝杆菌金胺O染色，在染色，在荧光下菌体呈荧光下菌体呈橘黄色橘黄色结核分枝杆菌痰涂片抗酸染色结核分枝杆菌痰涂片抗酸染色（1000）荧光染色（450）结果报告 0 70视野 1270视野 21850视

9、野 2 43610视野 3 436每个视野 4 36每个视野抗酸染色（1000）结果报告 0300视野 12条300视野 19条/100视野 2 19条/10视野 3 19条/每个视野 4 9/每个视野（三）分离培养与鉴定（三）分离培养与鉴定1.标本前处理：痰液标本的前处理：标本加等量的加等量的4%NaOH4%NaOH 強力振荡混匀约 50 秒 室温静置 3030 分分钟钟 加等量无菌磷酸盐缓冲液中和 离心 3000g 约 15 分钟 倒掉上清液，加无菌磷酸盐缓冲液重悬2.分离培养（1）传统培养方法培养基：处理过的标本接种于-培养基培养条件：含5%-10%CO2大气环境，最适生长温度35-37

10、，黑暗高湿度环境培养6-8周。（2）结核分枝杆菌的自动化快速培养系统（四）分离培养与鉴定（四）分离培养与鉴定 3.生物学鉴定（1）初步鉴定：依据抗酸染色性、菌落特征、生长速度、色素产生等作出初步鉴定（2）生化试验鉴定 烟酸累积试验（+）、硝酸盐还原（+）触酶（+）、耐热触酶（-）能被NAP抑制 不被T2H抑制、吡嗪酰胺酶（+）结结核核分分枝枝杆杆菌菌（四）分离培养与鉴定（四）分离培养与鉴定 4.免疫学鉴定（1）结核菌素试验：迟发型超敏反应。（2）结核分枝杆菌抗原检测（3）抗PPDIgG检测（四）分离培养与鉴定（四）分离培养与鉴定结核菌素试验结核菌素试验纯蛋白衍生物纯蛋白衍生物(PPD)(PPD

11、)，是用三氯醋酸沉淀结核分枝杆菌培，是用三氯醋酸沉淀结核分枝杆菌培养滤液后的纯化物。养滤液后的纯化物。注入皮内注入皮内后如受试者已感染结核，后如受试者已感染结核，则结核菌素与致敏淋巴细胞特异性结合，形成迟发型超则结核菌素与致敏淋巴细胞特异性结合，形成迟发型超敏反应性炎症。敏反应性炎症。根据注射部位是否出现红肿判断结果根据注射部位是否出现红肿判断结果 10mm为阴性为阴性 10mm为阳性为阳性48小时后（4）T-SPOT.TB检测 利用外周抗凝全血标本，通过检测结核感染后T淋巴细胞分泌的特异性细胞因子干扰素，来诊断是否存在结核感染。5.分子生物学鉴定 各种PCR方法检测结核分枝杆菌DNA。6.高

12、效液相色谱（HPLC)分析鉴定 由于不同种的分枝杆菌细胞壁中的分枝菌酸不同，利用HPLC检测分枝菌酸可鉴定菌种。（四）分离培养与鉴定（四）分离培养与鉴定根据CLSI 文件M24-2A推荐：结核分枝杆菌药敏试验选择的药物主要是抗结核一线药物如异烟肼、利福平、乙胺丁醇和比嗪酰胺等。五、药敏试验的药物选择第二节 非结核分枝杆菌（nontuberculosisnontuberculosis mycobacteriamycobacteria,NTMNTM）本节主要内容 NTM的概述 临床上重要的NTM NTM的微生物学检验 NTMNTM指结核分枝杆菌复合群和麻风分枝杆菌以外的分枝杆菌，具有抗酸性，不是分

13、类学上的名称。广泛分布于水和土壤中。条件致病，引起类似于结核分枝杆菌感染的慢性肺部疾病以及皮肤感染。感染不会通过人与人之间进行传播。概 述1.不产色菌 本群细菌在光照和暗处均不产生色素。慢生长群（1）鸟分枝杆菌复合群（2）隐藏分枝杆菌临床上重要的NTM 快生长群（1）龟分枝杆菌-脓肿分枝杆菌群（2）偶发分枝杆菌群偶发分枝杆菌引起的注射后感染偶发分枝杆菌引起的注射后感染脓肿分枝杆菌引脓肿分枝杆菌引起的注射后感染起的注射后感染NTM感染后难感染后难于愈合的伤口于愈合的伤口2.光产色菌 均属慢生长菌，其特点是菌落在暗处为奶油色，曝光1h后变为黄色或橘黄色。（1）堪萨斯分枝杆菌（2）海分枝杆菌临床上重

14、要的NTM3.暗产色菌（慢生长群和快生长群）这类细菌无论在有光或无光条件下均可产生色素，色素为黄色或橘黄色。与人类疾病有关的均是慢生长菌。（1）戈登分枝杆菌（2）瘰疬分枝杆菌（3）苏加分枝杆菌临床上重要的NTM1.标本采集 与结核分枝杆菌类似2.涂片抗酸染色 NTM为抗酸杆菌，但较结核分枝杆菌短而粗，大小约1-8m0.3-0.5m，抗酸染色着色均匀，呈束状或团状排列。NTM的微生物学检验NTM纯培养抗酸染色（纯培养抗酸染色（1000）3.分离培养与鉴定 NTM的鉴定可跟据细菌生长速度、色素等表型特征进行初步鉴定，再进行分子鉴定，后者应用越来越广泛。NTM快速生长菌培养快速生长菌培养72小时菌落

15、小时菌落戈登分枝杆菌在戈登分枝杆菌在L-J培养基上菌落培养基上菌落4.其他鉴定方法 NTM非培养方法的鉴定与结核分枝杆菌类似，可参考结核杆菌部分。第三节 麻风分枝杆菌（MycobacteriumMycobacterium LepraeLeprae）主要内容 临床意义 生物学特性 微生物学检验一、临床意义 麻风分枝杆菌是麻风病的病原菌，麻风是一种慢性传染病，主要表现为皮肤、粘膜和神经末梢的损害。晚期可侵犯深部组织和器官，形成肉芽肿。传染源：麻风患者 传播途径：直接接触、飞沫传播 易感人群：多为免疫缺陷个体。根据临床表现、免疫病理变化和细菌检查结果等将麻风分为瘤型、结核样型瘤型、结核样型两种病型。

16、结核样型麻风患者手部病变体征瘤型麻风的瘤型麻风的“狮面狮面”外观外观 抗酸杆菌，呈束状或团状排列，革兰阳性无鞭毛、荚膜和芽胞。用药后细菌可断裂为颗粒状、链杆状等，着色不均匀。细胞内寄生菌，可形成麻风细胞（即有麻风杆菌存在、呈泡沫状的细胞）。目前不能人工培养。二、生物学特性 标本涂片抗酸染色是诊断麻风的主要依据 PCR检测麻风菌基因、运用新发现抗原血清学与T细胞试验可以对麻风病进行早期诊断。动物实验：将患者活检组织材料接种到小鼠足垫中，然后观察小鼠发病情况。三、微生物学检验临床病例学习这是一株分离自一患者局部脓肿标本中的分这是一株分离自一患者局部脓肿标本中的分枝杆菌枝杆菌患者的脓肿同时做了需氧、

17、厌氧的培养，均患者的脓肿同时做了需氧、厌氧的培养，均没有培养出细菌没有培养出细菌根据临床症状根据临床症状(患者局部脓肿反复发作，常患者局部脓肿反复发作，常用抗生素治疗无效，用抗生素治疗无效，发病于局部肌肉注射后，发病于局部肌肉注射后，局部针眼形成溃疡孔局部针眼形成溃疡孔，已有近，已有近3个月的病史。个月的病史。)进行分枝杆菌培养，才检出细菌进行分枝杆菌培养，才检出细菌这是刚采集的脓标本（明显是感染标本）这是刚采集的脓标本（明显是感染标本）但标本涂片后进行革兰染色、瑞氏染色、抗酸染色均阴性但标本涂片后进行革兰染色、瑞氏染色、抗酸染色均阴性标本接种肉汤标本接种肉汤37培养培养2天，肉汤混浊。但天，

18、肉汤混浊。但转种转种BAP/MAC/CA分别于需氧和厌氧环境培分别于需氧和厌氧环境培养，都不生长。养，都不生长。肉汤涂片革兰染色：隐隐约约见到有形的细菌形态肉汤涂片革兰染色：隐隐约约见到有形的细菌形态肉汤继续培养肉汤继续培养5天后涂片革兰染色：看见明显细菌，且有分枝状，天后涂片革兰染色：看见明显细菌，且有分枝状，但因为但因为BAP、MAC、CA培养阴性，不敢确认细菌培养阴性，不敢确认细菌 与临床沟通与临床沟通，了解到患者的情况：患，了解到患者的情况：患者局部脓肿反复发作，常用抗生素治者局部脓肿反复发作，常用抗生素治疗无效，疾病发生于局部肌肉注射后，疗无效，疾病发生于局部肌肉注射后，局部针眼形成

19、溃疡孔，已有近局部针眼形成溃疡孔，已有近3个月的个月的病史。病史。遂将标本接种于罗氏培养基遂将标本接种于罗氏培养基培养培养1515天后可见到小菌落，上图是培养天后可见到小菌落，上图是培养1919天的结果天的结果罗氏培养基上的菌落抗酸染色结果罗氏培养基上的菌落抗酸染色结果该菌接种到血平板上培养半个月后开始有菌生长半个月后开始有菌生长，继续培养长出有皱褶的淡黄色菌落，经抗酸染色为阳性抗酸染色为阳性，其形态更接近液体增菌培养基里的细菌形态，由于抗酸菌难着色，所以革兰染色染成了阴性革兰染色染成了阴性的。血平板培养血平板培养1515天后菌落涂片抗酸染色结果天后菌落涂片抗酸染色结果结合生化鉴定，最后确定为：结合生化鉴定，最后确定为：溃疡分枝杆菌溃疡分枝杆菌