遗传学课件：第18章 基因组学与后基因组学

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1、第18章 基因组学与后基因组学主要讲授：1 人类基因组计划与基因组学2 基因组测序与序列组装3 基因组图谱构建与应用4 比较基因组学和功能基因组学研究5 基因组的进化18.1人类基因组计划与基因组学基因组学（genomics）：它是研究基因组的组成、结构和功能的学科结构基因组学（structural genomics）：是着重研究基因组的结构并构建高分辨的遗传图、物理图、序列图和转录图以及研究蛋白质组成与结构的学科；功能基因组学（functional genomics）：主要是利用结构基因组学研究所得到的各种信息在基因组水平上研究编码序列及非编码序列生物学功能的学科。18.1.1人类基因组计划

2、美国能源部和国立卫生研究院（NIH）合作于1990年正式启动人类基因组计划。主要目标是计划拨款30亿美元，用15年时间完成人类基因组30亿bp全部序列的测定，在2001年完成全部染色体的“工作草图”。经过参加该项目的1000多名各国科学家的通力合作，人类基因组的工作草图于2000年6月26日胜利绘制完成，该工作草图包含人体90以上碱基对的位置信息。2000年6月26日，六国科学家公布人类基因组工作框架图2001 年2月12日，人类基因组图谱及初步分析结果首次公布2001 年8月26日，中国提前两年完成1人类基因组测序任务2003年4月15日，六个国家共同宣布人类基因组序列图完成(美、英、德、日

3、、法、中)已经完成的人类基因组图谱(序列)来自不同人种的5个个体，是一个参考图谱。2004年10月，国际人类基因组测序联合体在Nature周刊上发表了人类基因组常染色质全序列测定的论文宣布人类基因组由31.647亿个碱基对组成，拥有编码蛋白质的基因数目大约在2万到2.5万个之间。18.1.2人类基因组的结构特点图181 人类基因组的组织组成18.1.3遗传标记遗传学中曾将可识别的等位基因称为遗传标记（geneticmarker）。现代遗传学将可示踪染色体、染色体片段、基因等传递轨迹的遗传特性也称为遗传标记。1.形 态 标记：是指那些能够明确显示遗传多态的外观性状，如株高、粒色等的相对差异2.细

4、胞学标记：是指能够明确显示遗传多态的细胞学特征。如染色体结构上和数量上的遗传多态性等。3.蛋白质标记：非酶蛋白质和酶蛋白质在非酶蛋白质中，用得较多的是种子贮藏蛋白；酶蛋白质主要是同功酶。4.DNA 标 记：也称DNA多态性标记、DNA分子标记，是 DNA水平上遗传多态性的直接反映。这里仅介绍遗传的分子标记中的几种DNA分子标记:RFLP、VNTRs、AFLP、RAPD、SSR、STS和SNP（1）RFLP标记(restriction fragment length polymorphism)：同一物种的亚种、品系或个体间基因组DNA 受到同一种限制性内切酶作用而形成不同的酶切图谱的现象，称为限

5、制性片段长度多态性（RFLP)。这是由于基因组DNA某一位点上的变异有可能引起该位点特异性的限制性内切酶识别位点的改变，包括原有位点的消失或出现新的酶切位点，致使酶切片段长度随之发生变化而产生。对RFLP的检测主要是用Southern杂交的方法进行基本流程：组织或细胞基因组DNA限制性内切酶消化琼脂糖凝胶电泳印迹转移至滤膜预杂交加入探针杂交洗膜放射自显影。RFLP标记的主要特点是：（1）遍布于整个基因组，低拷贝序列；（2）无表型效应，不受发育阶段及器官特异性限制；（3）共显性，可区分纯合子和杂合子；（4）结果稳定、可靠；（5）DNA需要量大，检测技术繁杂，难以用于大规模的育种实践中。用途：RF

6、LP主要用于群体水平和系统发育研究上进行：个体识别；绘制遗传图谱；目的基因定位；检测群体内或群体间序列差异程度；辅助育种等（2）VNTRs标记一般将真核生物基因组长16100个核苷酸为基本单元的串联重复序列称为小卫星，而将以2 6个核苷酸为基本单元的简单串联重复序列，例如（CA）n、（GAG）n、（GACA）n 等，称为微卫星或简单序列重复（simplesequence repeats，SSR）。小卫星和微卫星其多态性来源于重复序列的核苷酸组成和重复的次数不同。一般又将小卫星和微卫星称作可变数目串联重复（variable number oftandem repeats，VNTRs）。VNTRs

7、 标记也呈共显性遗传，符合孟德尔遗传传递规律，因此可以用来进行遗传分析和作图（图183）。而且VNTRs在基因组中有广泛的分布，可检出的多态更丰富，出现的频率更高。图183人VNTRs的系谱分析（引自H artl等，2001）人类系谱分析表明VNTR等位基因的分离。在系谱中出现6个等位基因（A1 A6），但是任何一个个体仅可能有一个等位基因（纯合子）或两个等位基因（杂合子）（基于PCR的DNA标记：随机引物PCR标记）（3）RAPD（random amplified polymorphic DNA）标记：随机扩增多态性DNA，用随机短引物（人工合成的核苷酸）进行DNA的PCR扩增。所扩增的DN

8、A区段是事先未知的，具有随机性和任意性，因此随机引物PCR标记技术可用于对任何未知基因组的研究。（RAPD 原理）（基于PCR的DNA标记：特异引物PCR标记）（3）SSR（simple sequence repeats)标记:简单重复序列多态性，又称微卫星DNA多态性，即由二核苷酸，三核苷酸或四核苷酸串联重复的拷贝数目不等而出现的多态现象。SSR典型的孟德尔式遗传；共显性（两个亲本的性状在一个个体中同时出现，没有显隐关系）。同源染色体等位基因同源染色体等位基因子代同源染色体等位基因同源染色体等位基因同源染色体等位基因SSR技术的优点是：（1）在基因组中随机分布，检测的多态性频率高；（2）PC

9、R特异引物，重复性好；（3）共显性，操作相对简单。问题是：（1）SSR需要测序和设计引物，因而需要大量的人力、物力和时间；（2）另外其种属特异性强，开发所需的费用高昂，因此一些实验室进行了合作，共同开发微卫星引物Simple Sequence Repeats（SSR）=RepeatUnique flanking regions结构不同个体间单元重复数高度可变设计与侧翼区域配对的引物()扩增重复区域SSR标记的基因变异来源于基因组DNA复制时的滑动显然，利用SSR标记的关键是引物的设计。对于已经进行基因组全序列测定的生物或遗传学研究比较经典的生物，可以直接从其基因组进行查找和利用有关程序进行引物

10、的设计或利用别人已经发表的引物来进行实验；而对于没有基因组序列信息的生物，就需要进行有关引物的设计工作。SSR标记应用：现已证明微卫星DNA 存在于绝大多数真核生物基因组中，因此已广泛应用于遗传图谱构建、品种指纹图谱绘制、品种纯度检测及目标性状分子标记筛选、遗传多样性分析、重要性状基因的定位等（4）、AFLP技术的原理和应用荷兰Keygene公司Zabeau等（1992）、Zabeau和Vos等（1993）发展了一种检测DNA多态性的新方法AFLP（Amplified fragment length polymorphism）：RFLP接头引物PCR AFLPAFLP既是进行酶切位点分析又要对

11、酶切片段进行选择性扩增，因此它既具备RFLP的准确性又具有PCR的高效性，综合了两者的优点，并于1993年获得欧洲专利局专利。AFLP原理图酶切引物接头引物接头引物连接PCR扩增引物引物1引物2引物3AFLP：扩增片段长度多态性通过对基因组DNA酶切片段的选择性扩增来检测DNA酶切片段长度的多态性。AFLP揭示的DNA多态性是酶切位点和其后的选择性碱基的变异。为了对扩增片段的大小进行灵活的调节，一般采用两个限制性内切酶。一个是切点多的酶，如具有4bp识别位点的Mse，它产生较小的DNA片段；另一个是切点少的酶，如具有6bp识别位点的EcoR，它产生较大的DNA片段。（1）酶切所需DNA量少（仅

12、需50300ng）,也可以作用于mitDNA；（2）多态性检测能力高，既能检测酶切位点不同造成的多态性，又能检测随机选择 碱基造成的多态性；（3）简单高效，一次选择扩增就能比较几十甚至上百个位点；（4）分辨率高，扩增片段短，片段多态性检出率高；（5）可靠性与重复性好。AFLP由于是特定引物扩增，退火温度高，因而假阳性低，重复性好。AFLP集RFLP、PCR和RAPD的优点于一身，并且克服了RFLP和RAPD的缺点。AFLP技术的优点：AFLP技术的不足：（1）AFLP技术受到专利保护，试剂盒昂贵，成本较高；（2）对DNA的纯度和内切酶的质量要求较高，技术要求高。现在一般都采用银染和荧光标记的方

13、法来代替放射性同位素标记，因而避免了辐射伤害。（3）操作繁琐。AFLP的应用（1）分子进化研究：分析同种植物DNA的差异和亲缘关系；鉴定分类关系（2）分析生物发育不同时期基因的表达差异情况：cDNA-AFLP；（3）构建遗传图谱；（4）遗传多样性分析；（5）植物雄性不育系与保持系关系的研究等三系杂交水稻AFLP分析（5）STS标记:序列标签位点（sequencetagged site，STS）是在染色体上定位的、序列已知的单拷贝DNA短片段，一般长200500bp。STS标记的原理：是根据单拷贝的DNA 片段两端的序列，设计一对特异引物，经PCR扩增基因组DNA而产生的一段长度为几百bp的特异

14、序列。由于不同的STS序列在基因组中往往只出现一次，从而能够界定基因组的特异位点。用STS进行物理作图，可通过PCR或杂交途径来完成。STS标记可以作为比较遗传图谱和物理图谱的共同界标，因此在基因组作图上具有非常重要的作用。（单核苷酸多态性的DNA标记）（6）SNP（single nucleotide polymorphism）标记:单核苷酸多态性。同一物种不同个体基因组DNA的等位序列上单个核苷酸存在差别的现象。或者説不同个体基因组DNA序列同一位置上的单个核苷酸的差别。其比较的不是DNA的片段长度，而是相同序列长度里的单个碱基的差别。(SNP_)SNP是指基因组内特定位置上存在两种不同的碱

15、基，是二等位多态性，其中最少一种在群体中的频率不小于1；如果出现频率低于1，则视作点突变。SNP只涉及单个碱基的变异，这种变异可以由单个碱基的转换（包括C与T互换，在其互补链上则为G与A互换），或颠换（包括C与A、G与T、C与G、A与T互换）引起，也可以由碱基的插入或缺失所致。但是，通常所说的SNP并不包括后两种情况。根据SNP在基因中的位置，SNP可分为：基因编码区SNP（coding SNP,cSNP）基因周边SNP（peripheral SNP,pSNP）基因间SNP（intronic SNP,iSNP）从对生物的遗传性状的影响，cSNP又可分为两种：1.同义cSNP(synonymou

16、s cSNP):SNP引起的编码序列的改变并不影响其翻译的蛋白质的氨基酸序列，突变碱基与未突变碱基的含有相同;2.非同义cSNP（non-synonymous cSNP）:指碱基序列的改变可使以其为蓝本翻译的蛋白质序列发生改变，从而影响了蛋白质的功能，这种改变常是导致生物性状改变的直接原因。尽管单一的SNP所提供的信息量远小于现在常用的分子标记，但SNP的数量极其丰富，并且可以自动化检验，因此其具有广泛的应用前景。例如：如果假定1/1000的碱基是多态的话，那么人类30亿碱基当中有约300万SNP位点。由此可见，SNP数量比微卫星标记数要高出几个数量级。例如：34个SNP这种相邻的界标构成的单

17、体型（haplotype）就可以有816种：+123456783个SNP可以形成的单倍型8种Haplotype:又称“单倍型”，“单元型”。一条同源染色体上的等位基因或遗传标记所构成的组合。（9）主要类型的DNA分子标记的技术特点比较18.1.4遗传图谱(1)经典的遗传学图谱:主要用来确定生物体的基因在染色体上的排列，只能标明基因之间的相对位置，无法指明基因在染色体上的具体位置，因此无法按图直接克隆分离基因。在人类基因组计划中显然利用价值不大。(2)现代 遗传学图谱：其概念是David Botstein等 于1980年提出来的，当时由于DNA限制性内切酶和连接酶的应用，RFLP成为一种崭新的D

18、NA多态性标记。他们提出来利用RFLP作为标记去构建多态性基因与这些标记连锁关系，进而确定多态性基因的位置。其精髓在于将单纯的表型研究深入到DNA分子的本质上去。即：表型多样性对应于DNA分子的多样性将单纯的表现多态性的界标改变为以DNA序列的多态作为作图界标。这些界标包括：RFLP、VNTR和STR等。18.1.5物理图谱物理图谱是指各遗传标记之间或DNA序列两点之间，以物理距离来表示其在DNA分子上的位置而构成的位置图，以实际的碱基对或千碱基对或百万碱基对长度来度量其物理距离。最早的物理图谱是细胞遗传学图谱，通过原位杂交将基因定位在染色体各区带上。而现在在HGP中以YAC 或BAC为载体构

19、建的连续克隆系覆盖人的每条染色体的大片段DNA。以YAC叠连群或BAC 叠连群作为大尺度物理图谱，同时寻找分布于人类整个基因组的序列标签位点STS。STS是物理作图通用语言，最新制作的物理图包含了52 000个STS位标。以STS为基础的图谱最大的优点是：适合于大规模测序，并很容易在染色体上定位。物理图的类型 染色体组型/带型 (粗略的物理图)限制酶切图谱 大尺度限制酶切图谱:将YAC DNA用稀切点限制酶 (如sfi,Not等)酶解后经脉冲凝胶电泳(pulsedfield gelelectrophoresis)分离DNA片段,经特异人DNA(如Alu顺序)探针杂交后绘制出图谱 YAC-STS

20、物理图谱:有足够多的STS位标并在染色体上的分布达到足够密度,根据每个YAC所含有的STS把各YAC排在染色体上,得到一个相互重叠排列的染色体的YAC图谱(96)辐射杂种图谱(RH图谱,Radiation hybrid)用辐射方法产生的杂种细胞是含有全部小鼠染色体背景的细胞内同时含有唯一的人类染色体的一个片段。这样得到一系列细胞株，每个细胞株分别含有不同的人类染色体片段。其所含的染色体片段可以用已知的STS或特定的DNA探针，用PCR或FISH方法进行鉴定 核苷酸顺序图：(100)7.物理图与遗传图的关系:两者之间既有联系又有差异(100)遗传学图、细胞学图和物理图之间的相互关系如图18-6图

21、186三种图谱之间的相互关系在现代分子标记图谱中，遗传图和物理图所表示的基因（和分子标记位点）在序列上基本相同，但在距离上是不相同的。这是由于遗传图确定的是基因或DNA 标记在染色体上的相对位置与遗传距离。物理图是指以物理距离来表示其在DNA 分子上的位置而构成的位置图。8.“位点”的概念：在经典的定义中对于“位点”的概念是基因即遗传位点。而目前基因组研究中通常染色体位点不仅是指基因，还包括客观物组成的染色体上的位点。在物理图谱中，位点是指一系列的客观物：包括探针位点、限制性内切酶酶切位点、克隆位点、基因位点、中间粒及端粒位点等。位点染色体上任何可以区分的染色体位置。18.2基因组测序与序列组

22、装18.2.1基因组测序策略基因组序列的测定是一种大规模的序列测定，选择适当的测序策略是很重要的。主要有两种测序策略，一种是自上而下（top-down mapping）或由长到短作图策略；另一种是全基因组鸟枪法（whole-genome shotgun method）作图策略，也称自下而上（Bottom-up approach mapping）或由短到长作图策略（图18-7）。(1).Physical mapping（测序策略）By the clone contig approach(60)建立连续重叠克隆系（overlapping clones)/重叠群(Contig)，对单个重叠群,采用鸟

23、枪法对其中的克隆逐个进行测序,最后在重叠群内进行拼接,拼接出全长序列。这种方法也称为 Top-down mapping ：“自上而下”或由长到短作图:先构建大DNA克隆(100Kb-10000Kb),并把克隆依染色体排列-染色体的克隆图。当把每个克隆测序完成后，就可以拼装出整个染色体的DNA序列。(99)注：重叠群：相互间存在重叠顺序的一组克隆，根据重叠顺序的相对位置将各个克隆首尾连接，构成连续顺序图。By the whole-genome shotgun method(60)直接将基因组DNA随机切成 2Kb 左右的小片段（BAC克隆）,随机末端测序,再以基因组的分子标记为起点进行DNA片段

24、拚接，其余过程辅以少量大片段(约10Kb),计算机分析串连得全序列.这是一种“自下而上”或由短到长作图Bottom-up approach/mapping:谢谢！关于遗传学复习考试1、全面复习：基本概念、基本作图方法、基本运算公式、基本解题方法2、要求掌握：1）、概率2）、二项式展开3）、AaBa x AaBaF2表型比例、基因型比例4）、多倍体配子（三倍体，四倍体）的产生及其比例5）、重组频率重组合/(亲组合重组合)100重组作图6）、四分子分析：判断依据 PDNPD 连锁基因与着丝粒的重组率=或 F(着丝粒基因)=1007）、共转化频率的计算：Number of a+b+cotransfo

25、rmants 100total number of a+transformants8）、细菌：内基因子、外基因子，相反的重组子不成在Ra-b(1/2T+NPD)/(PD+NPD+T)100第二次分裂分离子囊数（或交换型子囊数）子囊总数1/2100M1/2M+M重组型（）和（）Rf=亲本型（）重组型9）、共转化频率与图距的相互关系的数学表达式：X=(1d/L)310)、Hardy-Weinberg平衡：（p+q）2 p2+2pq +q2以及基因频率和基因型频率的估算11）、近交系数的估算12）、孟德尔遗传定理、连锁互换定理的运用13）、Vp=VA+VD+VE+VI广义遗传率（力）和狭义遗传率 （p522）14)、核外遗传与核内遗传的特点、关系15）、遗传作图：请总结各种作图方法3、题型：1)、名词解释20 分(10个名词，每个2分)2）、简答题30分（5个简答题，每个6分）3）、计算、分析作图题50分（4个题：第1、2题各10分，第3、4题每题15分）