生物化学与分子生物学：第二十一章 DNA重组及重组DNA技术

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1、第二十一章第二十一章 DNADNA重组及重组重组及重组DNADNA技术技术第一节 自然界的DNA重组DNA RecombinationDNA重组的方式重组的方式转座重组转座重组(Transposition)同源重组同源重组(Homologous Recombination)特异位点重组特异位点重组(Site-specific Recombination)一、同源重组一、同源重组（Homologous Recombination）定义：指发生在定义：指发生在同源序列间同源序列间的重组，又称的重组，又称基本基本重组（重组（General Recombination）。）。是最基本的是最基本的DNA

2、重组方式，通过链的断裂和再连接，在两个重组方式，通过链的断裂和再连接，在两个DNA分分子同源序列间进行单链或双链片段的交换。子同源序列间进行单链或双链片段的交换。同源重组依赖于两序列间的同源性。同源重组依赖于两序列间的同源性。E.Coli的同源重组机制的同源重组机制RecBCD复合物复合物具有具有解螺旋酶解螺旋酶和和核酸酶活性。核酸酶活性。Chi位点：位点：序列为序列为5GCTGGTGG3，是目前发现，是目前发现的主要重组热点的主要重组热点RecA酶：酶：E.coli同源重组过程中同源重组过程中最重要的酶，有人又将它称为最重要的酶，有人又将它称为重重组酶组酶。可结合单链。可结合单链DNA，并将

3、此，并将此DNA插入双链插入双链DNA分子的同源分子的同源区，完成区，完成DNA分子间单链交换的分子间单链交换的重组过程。重组过程。RuvC酶：酶：切割切割Holliday中间体中间体ssDNA-RecA 复合物复合物 同源染色体排列整齐同源染色体排列整齐片段重组体片段重组体(Patch Recombinant)拼接重组体拼接重组体(Splice Recombinant)形成形成Holliday中间体中间体分支移动产生异源双链分支移动产生异源双链DNAHolliday中间体切开并修复中间体切开并修复片段重组体和拼接重组体片段重组体和拼接重组体电镜下观察到的电镜下观察到的Holliday中间体中

4、间体真核生物细胞减数分真核生物细胞减数分裂过程中的同源重组裂过程中的同源重组交换（同源）重组交换（同源）重组随机重组随机重组二、特异位点重组二、特异位点重组特异位点重组特异位点重组(Site-Specific Recombination)是是由由整合酶整合酶催化，在两个催化，在两个DNA序列的序列的特异位点特异位点间间发发生的整合。生的整合。插入（插入（Insertion）缺失（缺失（Deletion）倒位（倒位（Inversion）特异位点重组的三种类型特异位点重组的三种类型+ABXYBAXY+ABXYABXYA BX YA BX Y噬菌体噬菌体DNA的整合的整合（插入）（插入）细菌的特异位

5、点重组细菌的特异位点重组（倒位）（倒位）免疫球蛋白基因的重排免疫球蛋白基因的重排（缺失）（缺失）5 G C T T T T T A T A C T A A 35 G C T T T T T A T A C T A A 33 C G A A A A A T A T G A T T 53 C G A A A A A T A T G A T T 515bp噬菌体：噬菌体：att P（P O P）大肠杆菌：大肠杆菌：att B（BOB）att噬菌体噬菌体DNA的整合的整合5 GCTTTTTATAC TAA 33 CGAAAAATATGATT 5PP5 GCTTTTTATAC TAA 33 CGAAAA

6、ATATGATT 5BBPP5 GCTTT 35 TTATAC TAA 33 ATT 53 CGAAAAATATG 55 GCTTT 33 CGAAAAATATG 5B5 TTATAC TAA 33 ATT 5B5 GCTTTTTATAC TAA 33 CGAAAAATATGATT 5BPP5 GCTTTTTATAC TAA 33 CGAAAAATATGATT 5B噬菌体噬菌体DNA的整合的整合240bpInt、IHFInt、IHF、Xis鼠伤寒沙门氏菌有两相鼠伤寒沙门氏菌有两相:相：由H1基因表达产生H1鞭毛蛋白相：由H2基因表达产生H2鞭毛蛋白两相细菌在进行细胞两相细菌在进行细胞分裂时，以

7、大约分裂时，以大约1/1000的频率产生另一相的后的频率产生另一相的后代，此过程称为相变代，此过程称为相变（phase variation）。）。细菌的特异位点重组细菌的特异位点重组hinH2rH1H1PPP H2鞭毛鞭毛 阻遏蛋白阻遏蛋白Hin重组酶重组酶H2rH1H1P H1鞭毛鞭毛沙门氏菌沙门氏菌H片段倒位决定鞭毛相转变片段倒位决定鞭毛相转变hixhixhixhixPPhin细菌的特异位点重组细菌的特异位点重组自然界中存在着数以百万计的各种抗原自然界中存在着数以百万计的各种抗原物质，若一种抗体分子特异性识别和结合物质，若一种抗体分子特异性识别和结合一种抗原，体内如何产生这么多种类的抗一种

8、抗原，体内如何产生这么多种类的抗体分子呢？体分子呢？抗体产生特异性免疫抗体产生特异性免疫应答的重要分子机制就应答的重要分子机制就是免疫球蛋白（是免疫球蛋白（IG）的）的基因重排。基因重排。免疫球蛋白的基因重排免疫球蛋白的基因重排Ig由两条轻链由两条轻链(L链链)和两条重链和两条重链(H链链)组成，组成，分别由三个独立的基分别由三个独立的基因族编码，其中两个因族编码，其中两个编码轻链编码轻链(和和)，一，一个编码重链。个编码重链。免疫球蛋白的基因重排免疫球蛋白的基因重排轻链轻链重链重链编码轻链的基因族上分别有编码轻链的基因族上分别有L、V、J、C四类片段；四类片段；编码重链的基因族上有编码重链的

9、基因族上有L、V、D、J、C五类。五类。BCR多样性：65276（405+304）=3.2106V1V2V3.V40J1 J2 J3 J4 J5CV3J3 J4CV3J3CVJC转录后RNA成熟mRNA前体多肽转录转录RNA剪切剪切翻译翻译BCR轻链轻链（基因座）基因座）生成过程生成过程基因座基因座人免疫球蛋白的基因重排人免疫球蛋白的基因重排B细胞DNAV2V3J3 J4CB细胞分化过程细胞分化过程中的中的DNA重排重排V1J3 J4CB细胞分化过程细胞分化过程中的中的DNA重排重排LLLLLLLAAAAAAAAAAAAAAAVLCL成熟轻链蛋白V1 V2.V65J1 J2 J3 J4 J5

10、J6 D1 D2.D27DNA重排重排转录转录RNA剪切剪切翻译翻译抗体蛋白重链生成过程抗体蛋白重链生成过程.V D J C免疫球蛋白的基因重排免疫球蛋白的基因重排C C C3 C1 C1 C2 C4 C C2重链重链(IgH)基因的基因的V-D-J重排和轻链重排和轻链(IgL)基因的基因的V-J重排均发生在重排均发生在特异位点特异位点上。在上。在V片段的下游，片段的下游，J片段片段的上游以及的上游以及D片段的两侧片段的两侧均存在均存在保守的重组信号序保守的重组信号序列列(Recombination Signal Sequence,RSS)。免疫球蛋白的基因重排免疫球蛋白的基因重排重排机制：重

11、排机制：重组酶：重组酶：RAG1：识别：识别9mer信号序列。信号序列。RAG2：结合：结合RAG1，并在，并在7mer序列处切割。序列处切割。重组发生在一对信重组发生在一对信号之间，其中一个号之间，其中一个有有12bp间隔区，一间隔区，一个有个有23bp间隔区。间隔区。Barbara McClintock(1902-1992),Biologist.Nobel Prize for discovering jumping genes in corn-then in bacteria and humans.Cold Spring Harbor Laboratory.三、转座重组三、转座重组概念：由

12、插入序列和转座子介导的基因移概念：由插入序列和转座子介导的基因移位或重排称为转座位或重排称为转座(Transposition)。指。指DNA从从一个位置移动到基因组上另一个位置。一个位置移动到基因组上另一个位置。特点：特点：不必借助同源序列就可移动的不必借助同源序列就可移动的DNA片段，片段，即转座作用与供体和受体之间的序列无关。即转座作用与供体和受体之间的序列无关。原核生物和真核生物均有转座子。原核生物和真核生物均有转座子。转座序列可沿染色体移动，甚至在不同转座序列可沿染色体移动，甚至在不同染色体间跳跃。染色体间跳跃。种类种类（1）两种类型：两种类型：A 简单转座子（简单转座子（simple

13、 transposon）或插入序列（或插入序列（insertion sequence IS）B 复合转座子（复合转座子（composite transposon）或转座子（或转座子（transposon，Tn）（一）插入序列（一）插入序列(Insertion Sequences,IS)只含有编码转座酶的基因，它的两端是反向重复序只含有编码转座酶的基因，它的两端是反向重复序列（列（Inverted Repeats，IR）。转座过程中由于靶位）。转座过程中由于靶位点复制，两端加上短的正向重复序列。点复制，两端加上短的正向重复序列。1 2 3 a b c d e ff e d c b a 1 2 3

14、 1 2 3 a b c d e ff e d c b a 1 2 3 转座酶基因转座酶基因Transposase GeneIRIRIS插入序列结构简单，是细菌染色体、质粒和插入序列结构简单，是细菌染色体、质粒和某些噬菌体的正常组分，其命名：某些噬菌体的正常组分，其命名：IS编编号，号，长度长度 7002000bp（二）转座子（二）转座子(Transposons)表示法：通常以表示法：通常以Tn和后面加上数码表示，和后面加上数码表示，如如Tn903。结构结构:a.除有转座酶基因外还有其它表型基因，除有转座酶基因外还有其它表型基因，如：抗药基因，使宿主具表性效应。如：抗药基因，使宿主具表性效应。

15、b.两侧有重复序列。两侧有重复序列。c.有的转座子的重复顺序就是有的转座子的重复顺序就是IS。转座子组成：反向重复序列转座子组成：反向重复序列(IR)/插入序列插入序列(IS)、转座酶编码、转座酶编码基因、抗生素抗性等有用的基因。长度基因、抗生素抗性等有用的基因。长度 2.5 kb20 kbTransposase Gene有用基因有用基因Transposase Gene有用基因有用基因IRIRISIS两端重复序列为两端重复序列为IS的转座子的转座子两端含有两端含有IR的转座子的转座子 转座的一般模式转座的一般模式保守性转座保守性转座(conservative transposition)转座的

16、两种形式复制性转座复制性转座(duplicative transposition)(duplicative transposition)复制性转座四、原核生物基因转移与重组四、原核生物基因转移与重组1.接合作用接合作用(Conjugation)2.转化作用转化作用(Transformation)3.转导作用转导作用(Transduction)（一）接合作用（一）接合作用当细胞与细胞、或细菌通过菌毛相互接触时，当细胞与细胞、或细菌通过菌毛相互接触时，质粒质粒DNA从一个细胞（细菌）转移至另一细胞从一个细胞（细菌）转移至另一细胞（细 菌）的（细 菌）的 D N A 转 移 称 为 接 合 作 用转

17、 移 称 为 接 合 作 用(Conjugation)。质粒质粒 细菌染色体外的小型环状双链细菌染色体外的小型环状双链DNA分分子，子，可接合质粒如可接合质粒如 F 因子因子(F factor)细菌接合（二）转化作用（二）转化作用通过自动获取或人为地供给外源通过自动获取或人为地供给外源DNA，使细胞或培养的受体细胞使细胞或培养的受体细胞获得新的遗传表型，获得新的遗传表型，称为转化作用称为转化作用(Transformation)。例：溶菌时，裂解的例：溶菌时，裂解的DNA片段被另一细菌摄取。片段被另一细菌摄取。（三）转导作用（三）转导作用当病毒从被感染的（供体）细胞释当病毒从被感染的（供体）细胞

18、释放出来、再次感染另一（受体）细胞放出来、再次感染另一（受体）细胞时，发生在供体细胞与受体细胞之间时，发生在供体细胞与受体细胞之间的的DNA转移及基因重组即为转导作用转移及基因重组即为转导作用(Transduction)。细菌的转导过程以噬菌体为媒介细菌的转导过程以噬菌体为媒介：溶源菌生长途径（：溶源菌生长途径（Lysogenic Pathway）切除切除噬菌体的繁殖方式噬菌体的繁殖方式：溶菌生长途径（：溶菌生长途径（Lytic Pathway）第第 二二 节节 重组重组DNA技术技术DNA Recombination Technique 1971年，史密斯（年，史密斯（Smith H.O.）

19、等人从细菌中分离出的一种）等人从细菌中分离出的一种限制性酶酶切病毒限制性酶酶切病毒DNA分子，标志着分子，标志着DNA重组时代的开始。重组时代的开始。1972年伯格（年伯格（Berg P.）等用限制性酶分别酶切猿猴病毒和）等用限制性酶分别酶切猿猴病毒和噬菌体噬菌体DNA，将两种，将两种DNA分子用连接酶连接起来分子用连接酶连接起来 得到新的得到新的DNA分子。分子。1973年，科恩（年，科恩（Cohen S.）等进一步将酶切）等进一步将酶切DNA分子与质分子与质DNA连接起来，并将重组质粒转入连接起来，并将重组质粒转入E.cloi细胞中。细胞中。基因工程发展史基因工程发展史Paul Berg

20、Herbert Boyer Stanley N.Cohen in 1973,Stanley Cohen,Paul Berg and Herbert Boyer made the first genetic engineering experiments1982年，美国食品卫生和医药管理局批准，年，美国食品卫生和医药管理局批准，用基因工程在细菌中生产人的胰岛素投放市用基因工程在细菌中生产人的胰岛素投放市场。场。1985年，转基因植物获得成功。年，转基因植物获得成功。1994年，延熟保鲜的转基因番茄商品生产。年，延熟保鲜的转基因番茄商品生产。1997年，克隆羊年，克隆羊“多莉多莉”诞生（苏格兰科学

21、诞生（苏格兰科学家利用家利用6岁成年母羊乳腺细胞）。岁成年母羊乳腺细胞）。1998年，美国夏威夷大学用一只实验鼠的细年，美国夏威夷大学用一只实验鼠的细胞克隆了胞克隆了3代共代共50只实验鼠。只实验鼠。2000年，美国用无性繁殖技术克隆猴年，美国用无性繁殖技术克隆猴“泰特泰特拉拉”，意味克隆人体已无技术障碍。，意味克隆人体已无技术障碍。2001年，美国宣布首次克隆成功处于早期阶段的人体胚胎。年，美国宣布首次克隆成功处于早期阶段的人体胚胎。2002年，年，12月法国研究者宣布克隆出第一个女婴，但一直未获得证实。月法国研究者宣布克隆出第一个女婴，但一直未获得证实。2003年，年，5月意大利宣布克隆成

22、功克隆马月意大利宣布克隆成功克隆马“普罗梅泰亚普罗梅泰亚”（世界上（世界上首次由哺乳动物生下自己的克隆体，即是母女、又是姐妹关系）首次由哺乳动物生下自己的克隆体，即是母女、又是姐妹关系）。2003年，年，12月美国德州农业机械大学宣布克隆成功白尾鹿。月美国德州农业机械大学宣布克隆成功白尾鹿。2005年，年，12月韩国克隆狗斯努皮月韩国克隆狗斯努皮Snuppy。转基因技术发展迅速：转基因技术发展迅速：1983年世界首例转基因烟草培育成功（Calgene公司），标志着人类利用转基因技术改良农作物的开始；1986年5种转基因材料进入田间试验；1994年美国批准耐储藏转基因番茄进入市场；现已有许多转基

23、因产品被批准在生产上使用。转基因植物转基因植物 Global genetic manipulation of plants 人类生长激素转基因猪人类生长激素转基因猪 人类生长激素转基因鼠人类生长激素转基因鼠 可分泌人类生长因子可分泌人类生长因子的转基因羊的转基因羊“Polly”基因工程药物基因工程药物“farm in the future”-Alexis Rockman DNA克隆（重组）的一般过程克隆（重组）的一般过程一、工具酶一、工具酶基因工程中的许多工作都涉及对基因工程中的许多工作都涉及对DNA进行进行的切割和重新连接，以及修饰等，由于是在体的切割和重新连接，以及修饰等，由于是在体外进行

24、，因此必须需要酶的参与，称为外进行，因此必须需要酶的参与，称为。其中，最重要的是其中，最重要的是限制性内切核酸酶限制性内切核酸酶。（1）定义：是识别定义：是识别DNA的特异序列的特异序列,并在识别位点或其并在识别位点或其周围切割双链周围切割双链DNA的一类内切酶，简称限制酶。的一类内切酶，简称限制酶。GGATCCCCTAGGGCCTAGGATCC G1.限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶(Restriction Endonuclease,RE)RE最早在细菌中发现最早在细菌中发现？限制酶与细限制酶与细菌的甲基化酶构菌的甲基化酶构成成限制修饰体限制修饰体系。系。（2）限制酶的分类）限制酶的分类:类

25、、类、类类、类类（3）限制酶的命名）限制酶的命名 EcoR E：代表细菌的属名代表细菌的属名co：代表细菌的种名代表细菌的种名R：代表菌株代表菌株：发现次序：发现次序 在基因重组中，只有在基因重组中，只有类酶有实际意义类酶有实际意义代表了它的来源代表了它的来源（4）限制酶的特点）限制酶的特点识别序列：回文结构，识别序列：回文结构，或二元旋转对称或二元旋转对称如如 EcoR的识别位点：的识别位点：5-GAATTC-3 3-CTTAAG-5不同碱基个数的识别序列在基因组中的不同碱基个数的识别序列在基因组中的出现频率：出现频率：四：四：256bp 六：六：4kb 八：八：65kb切割方式：粘性末端、

26、平末端切割方式：粘性末端、平末端 Bam HHindGTCCAG平末端（钝性末端）平末端（钝性末端）GACCTGCCTAGGGATCCGPstGCTGCAGACGTC33突出粘性末端突出粘性末端55突出粘性末端突出粘性末端粘性末端在基因克隆中非常有用粘性末端在基因克隆中非常有用Enzyme 来源来源识别序列和切割方式识别序列和切割方式EcoREscherichia coli RY135 GAA|TTC 33 CTT|AAG 5BamHBacillus amyloliquefaciens H5 GGA|TC C 33 C TT|AGG 5 BglBacillus globigii5 AGA|TC

27、 T 33 T CT|AGA 5 HindHaemophilus influenzae5 AAG|CT T 33 T TC|GAA 5 Tag Thermus aquaticus5 TC|G A 33 A G|CT 5.一些常见的核酸内切酶一些常见的核酸内切酶有些限制性内切酶虽然识别序列不完全相同，有些限制性内切酶虽然识别序列不完全相同，但切割但切割DNA后，产生相同的粘性末端，称为后，产生相同的粘性末端，称为同尾酶。同尾酶。这两个相同的粘性末端称为这两个相同的粘性末端称为配伍未端配伍未端(compatible end)。GGATCC CCTAGG AGATCT TCTAGAGCCTAG GA

28、TCC GATCTAG GATCT A2.其它工具酶其它工具酶 工工 具具 酶酶功功 能能DNA连接酶连接酶催化催化DNA中相邻的中相邻的5 磷酸基和磷酸基和3 羟基末端之间形成磷酸二酯键，羟基末端之间形成磷酸二酯键，使使DNA切口封合或使两个切口封合或使两个DNA分子或片段连接分子或片段连接DNA聚合酶聚合酶合成双链合成双链cDNA分子或片段连接分子或片段连接缺口平移制作高比活探针缺口平移制作高比活探针DNA序列分析序列分析填补填补3 末端末端Klenow片段片段又名又名DNA聚合酶聚合酶I大片段，具有完整大片段，具有完整DNA聚合酶聚合酶I的的53 聚合、聚合、35 外切活性，而无外切活性

29、，而无53 外切活性。常用于外切活性。常用于cDNA第二链合成，第二链合成，双链双链DNA 3 末端标记等末端标记等反转录酶反转录酶合成合成cDNA替代替代DNA聚合酶聚合酶I进行填补，标记或进行填补，标记或DNA序列分析序列分析多聚核苷酸激酶多聚核苷酸激酶催化多聚核苷酸催化多聚核苷酸5 羟基末端磷酸化，或标记探针羟基末端磷酸化，或标记探针末端转移酶末端转移酶在在3 羟基末端进行同质多聚物加尾羟基末端进行同质多聚物加尾碱性磷酸酶碱性磷酸酶切除末端磷酸基切除末端磷酸基二、重组二、重组DNA技术中常用的载体技术中常用的载体 能在宿主细胞内独立复制。能在宿主细胞内独立复制。有供选择的遗传标记，便于检

30、测。有供选择的遗传标记，便于检测。有合适的限制性内切酶切割位点。有合适的限制性内切酶切割位点。作为载体必须满足以下共性：作为载体必须满足以下共性：克隆载体克隆载体(cloning vector)为使插入的外源为使插入的外源DNA序列被扩增而特意序列被扩增而特意设计的载体称为克隆载体。设计的载体称为克隆载体。表达载体表达载体(expression vector)为使插入的外源为使插入的外源DNA序列可转录翻译成序列可转录翻译成多肽链而特意设计的载体称为表达载体。多肽链而特意设计的载体称为表达载体。（一）克隆载体（一）克隆载体质粒（质粒（plasmid）噬菌体（噬菌体（phage）其它载体其它载体

31、 1.1.质粒质粒 (plasmid)特点特点 能在宿主细胞内独立自主复制；带有某些遗传信息能在宿主细胞内独立自主复制；带有某些遗传信息,会赋予会赋予宿主细胞一些遗传性状。宿主细胞一些遗传性状。大小适宜，拷贝数多。易于从一大小适宜，拷贝数多。易于从一个细菌转移到另一个细菌。有利于筛选。质粒上常带有一个或个细菌转移到另一个细菌。有利于筛选。质粒上常带有一个或两三个抗药基因。有限制性内切酶的切口。两三个抗药基因。有限制性内切酶的切口。细菌染色体 质粒 噬菌体噬菌体DNA改造系统改造系统 gt系列（插入型，适用系列（插入型，适用cDNA克隆）克隆）EMBL系列（置换型，适用基因组克隆）系列（置换型，

32、适用基因组克隆）2.噬菌体噬菌体(phage)M13噬菌体噬菌体DNA改造系统（改造系统（含含lacZ基因基因）M13mp系列（由野生型系列（由野生型M13基因改造）基因改造）pUC系列（由系列（由pBR322改造）改造）噬菌体噬菌体DNA的结构48502bpEcoR插入型载体-gt系列R=EcoR B=BamH S=SalRBS SBR 用EcoR,BamH,Sal其中的任意一个切割置换型载体-EMBL系列M13噬菌体载体系统噬菌体载体系统M13噬菌体生活史A typical M13 vectorMutiple Cloning Site6.5kb片段pUC系列载体（pBR322+lacZ）互

33、补（alpha complementation）酵母人工染色体酵母人工染色体(yeast artificial chromosome,YAC)细菌人工染色体细菌人工染色体(bacterial artificial chromosome,BAC)动物病毒动物病毒DNA改造的载体改造的载体（如腺病毒，腺病毒相关病毒，逆转录病毒）（如腺病毒，腺病毒相关病毒，逆转录病毒）其他其他克隆容量：克隆容量：质粒：质粒：10kb 噬菌体噬菌体23kb M13噬菌体噬菌体1kb 粘粒：粘粒：40-50kb BAC:300kb YAC：0.5-2Mb粘性质粒粘性质粒(cosmid)也叫柯斯质粒也叫柯斯质粒三、重组三

34、、重组DNA技术基本原理技术基本原理目的基因的获取目的基因的获取克隆载体的选择和构建克隆载体的选择和构建外源基因与载体的连接外源基因与载体的连接重组重组DNA导入受体菌导入受体菌重组体的筛选与扩增重组体的筛选与扩增克隆基因的表达克隆基因的表达 基因工程的基本过程基因工程的基本过程（一）目的基因的获取（一）目的基因的获取1.化学合成法化学合成法2.基因组基因组DNA文库文库(genomic DNA library)3.cDNA文库文库(cDNA library)4.聚合酶链反应聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)1.化学合成法获取目的基因化学合成法获取目的基

35、因由已知氨基酸序列推测可能的由已知氨基酸序列推测可能的DNA序列序列2.基因组基因组DNA文库（文库（gDNA library）提取组织或细胞染色体全部提取组织或细胞染色体全部DNA基因片断基因片断克隆载体克隆载体重组重组DNA分子分子含重组分子的转化菌含重组分子的转化菌限制性内切酶限制性内切酶受体菌受体菌gDNA文库的构建文库的构建限制酶切位点限制酶切位点限制酶消化限制酶消化 除去中间片段除去中间片段cos LR coscos L左臂左臂R cos右臂右臂真核生物染真核生物染色体色体DNA限制酶限制酶部分消化部分消化 外源外源DNA与载体与载体DNA混合混合 连接反应连接反应 体外包装体外包

36、装 用重组噬菌体用重组噬菌体感染大肠杆菌感染大肠杆菌 20 Kb DNA 片段片段 cos LR cos20 Kb 外源外源 DNA 片段片段 基因文库基因文库提取组织或细胞中的全部提取组织或细胞中的全部mRNA cDNA 双链双链cDNA 重组重组DNA分子分子 cDNA文库文库 反转录酶反转录酶 载体载体 受体菌受体菌 复制复制3.cDNA文库（文库（cDNA library）cDNA文库的构建过程文库的构建过程4.4.利用聚合酶链反应利用聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)(polymerase chain reaction,PCR)获获 取目的基因

37、取目的基因（二）克隆载体的选择和构建（二）克隆载体的选择和构建克隆目的克隆目的宿主细胞类型宿主细胞类型载体的克隆容量载体的克隆容量（三）外源基因与载体的连接（三）外源基因与载体的连接1.1.粘性末端连接粘性末端连接方式：方式：(1)同一限制酶切位点连接同一限制酶切位点连接 (2)不同限制酶切位点连接（配伍末端连接）不同限制酶切位点连接（配伍末端连接）T4 DNA连接酶连接酶目的基因用目的基因用 Bam H切割切割GCCTAGGCCTAGGCCTAGGCCTAGGATCCGGATCCGGATCCGGATCCG载体载体DNA用用Bam H切割切割GCCTAGGCCTAGGCCTAGGCCTAGGA

38、TCCGGATCCGGATCCGGATCCG重组体重组体2.平端连接平端连接适用于：限制性内切酶切割产生的平端适用于：限制性内切酶切割产生的平端粘端补齐或切平形成的平端粘端补齐或切平形成的平端优点：使用范围广优点：使用范围广缺点：连接效率较低缺点：连接效率较低 T4 DNA ligase3.特殊连接方式特殊连接方式（2）同聚物加尾连接同聚物加尾连接(Homopolymer tailing)（1 1）人工接头连接）人工接头连接(linker)这两者都可以看成是粘性末端连接这两者都可以看成是粘性末端连接的特殊形式。的特殊形式。Eco REco REco REco RCCGAATTCG GGCTTA

39、AGC人工接头及其应用人工接头及其应用一个典型的人工接头一个典型的人工接头同聚物加尾连接同聚物加尾连接受体菌条件受体菌条件安全宿主菌安全宿主菌 限制酶和重组酶缺陷限制酶和重组酶缺陷处于感受态处于感受态(competent state)（四）重组（四）重组DNA导入受体菌导入受体菌导入方式导入方式转化转化(transformation)感染感染(infection)转染转染(transfection)宿主菌细胞经适当的理化处理，处于最适于接受重组体的状态，称感受宿主菌细胞经适当的理化处理，处于最适于接受重组体的状态，称感受态细胞。比如大肠杆菌在低温下处于态细胞。比如大肠杆菌在低温下处于CaCl2

40、溶液中一段时间，其膜通透性增加溶液中一段时间，其膜通透性增加处于感受态。处于感受态。E.Coli感受态细胞的制备4BamH 1.直接选择法直接选择法 (1)抗药性标记选择抗药性标记选择(插入失活法插入失活法)（五）重组体的筛选（五）重组体的筛选抗药性标记选择抗药性标记选择筛选过程筛选过程APrTCrTcr当宿主细胞存在某种基因及其表达产物的缺陷当宿主细胞存在某种基因及其表达产物的缺陷时，可采用此方法筛选重组体。即在载体时，可采用此方法筛选重组体。即在载体DNA分子分子中插入相应的缺陷基因，如宿主细胞重新获得缺陷中插入相应的缺陷基因，如宿主细胞重新获得缺陷基因的表达产物，则说明该细胞中带有重组体

41、。基因的表达产物，则说明该细胞中带有重组体。(2)(2)标志补救标志补救(marker rescue)组氨酸缺陷组氨酸缺陷型大肠杆菌型大肠杆菌无组氨酸无组氨酸的培养基的培养基酵母咪唑甘油磷酸酵母咪唑甘油磷酸脱水酶基因脱水酶基因促进细菌组氨酸合成促进细菌组氨酸合成 DNADNA重组体重组体标志补救标志补救(marker rescue)互补也是一种标志补救标志补救互补（蓝白筛选）重组重组DNADNA技术操作过程可形象归纳为技术操作过程可形象归纳为 小小 结结分分分离目的基因分离目的基因 选选载体的选择与构建载体的选择与构建接接拼接重组体拼接重组体 转转转入受体菌转入受体菌 筛筛筛选重组体筛选重组体

42、 载体载体质粒质粒噬菌体噬菌体病毒病毒目的基因（外源基因）目的基因（外源基因）基因组基因组DNA cDNA 人工合成人工合成PCR产物产物限制酶消化限制酶消化开环载体开环载体DNA目的基目的基因因连接酶连接酶重组体重组体转化转化体外包装，转染体外包装，转染受体菌扩增受体菌扩增筛选筛选重组体大量扩增重组体大量扩增表达体系的建立表达体系的建立表达载体的构建表达载体的构建受体细胞的建立受体细胞的建立表达产物的分离纯化表达产物的分离纯化（六）克隆基因的表达（六）克隆基因的表达1.原核表达体系原核表达体系（E.coli表达体系最为常用）表达体系最为常用）表达载体：表达载体：适宜的选择标志适宜的选择标志强

43、的启动序列强的启动序列翻译控制序列等翻译控制序列等多克隆位点多克隆位点E.coli表达体系的不足表达体系的不足：不宜表达真核基因组不宜表达真核基因组DNA（缺乏转录后加工机制缺乏转录后加工机制）不能加工表达的真核蛋白质（不能加工表达的真核蛋白质（缺乏翻译后加工机制缺乏翻译后加工机制）表达的蛋白质常形成不溶性的包涵体表达的蛋白质常形成不溶性的包涵体包涵体包涵体(inclusion body)优点：可表达克隆的优点：可表达克隆的cDNA及真核基因组及真核基因组DNA 可适当修饰表达的蛋白质可适当修饰表达的蛋白质 表达产物分区域积累表达产物分区域积累缺点：操作技术难、费时、不经济缺点：操作技术难、费

44、时、不经济2.真核表达体系：酵母、昆虫、哺乳类动物细胞真核表达体系：酵母、昆虫、哺乳类动物细胞转染转染(Transfection)将表达载体导入真核细胞的过程将表达载体导入真核细胞的过程方法：方法：磷酸钙转染磷酸钙转染 DEAE葡聚糖介导转染葡聚糖介导转染 脂质体转染脂质体转染 显微注射显微注射 电穿孔电穿孔磷酸钙转染磷酸钙转染显微注射显微注射真核表达载体多是穿梭载体真核表达载体多是穿梭载体（一）疾病基因的发现与克隆（一）疾病基因的发现与克隆根据基因定位克隆之并研究其性质，而认根据基因定位克隆之并研究其性质，而认识疾病的分子机制。识疾病的分子机制。三、重组技术与医学的关系三、重组技术与医学的关

45、系 （二）生物制药：重组（二）生物制药：重组DNA医药产品医药产品产产 品品功功 能能组织胞浆素原激活剂组织胞浆素原激活剂抗凝抗凝血液因子血液因子VIII促进凝血促进凝血颗粒细胞颗粒细胞-巨噬细胞集落剌激因子巨噬细胞集落剌激因子剌激白细胞生成剌激白细胞生成促红细胞生成素促红细胞生成素剌激白细胞生成剌激白细胞生成生长因子生长因子(bFGF,EGF)刺激细胞生长与分化刺激细胞生长与分化生长素生长素治疗侏儒症治疗侏儒症胰岛素胰岛素治疗糖尿病治疗糖尿病干扰素干扰素(1b,2a,2b,)抗病毒感染及某些肿瘤抗病毒感染及某些肿瘤白细胞介素白细胞介素激活、剌激各类白细胞激活、剌激各类白细胞超氧化物歧化酶超氧

46、化物歧化酶抗组织损伤抗组织损伤单克隆抗体单克隆抗体利用其结合特异性进行诊断试验、肿瘤利用其结合特异性进行诊断试验、肿瘤导向治疗导向治疗乙肝疫苗乙肝疫苗(CHO,酵母酵母)预防乙肝预防乙肝口服重组口服重组B亚单位菌体霍乱菌苗亚单位菌体霍乱菌苗预防霍乱预防霍乱基因诊断基因诊断(Genetic Diagnosis)是利用分子利用分子生物学及分子遗传的技术和原理，在生物学及分子遗传的技术和原理，在DNA水水平分析、鉴定遗传疾病所涉及基因的置换、缺平分析、鉴定遗传疾病所涉及基因的置换、缺失或插入等突变。失或插入等突变。（三）基因诊断（三）基因诊断基本过程基本过程区分或鉴定区分或鉴定DNA的异常的异常分离

47、、扩增待测的分离、扩增待测的DNA片断片断标准标准.能正确扩增靶基因；能正确扩增靶基因；.能准确区分单个碱基的差别；能准确区分单个碱基的差别；.本底或噪声低，不干扰本底或噪声低，不干扰DNA的鉴定的鉴定;.便于完全自动化操作，适合大面积、便于完全自动化操作，适合大面积、大人群普查。大人群普查。（四）基因治疗（四）基因治疗定义定义基因治疗基因治疗(gene therapy)是向有功能缺陷是向有功能缺陷的细胞补充相应功能的基因，以纠正或补偿的细胞补充相应功能的基因，以纠正或补偿其基因的缺陷，从而达到治疗的目的。其基因的缺陷，从而达到治疗的目的。方式方式体细胞基因治疗体细胞基因治疗(somatic

48、cell gene therapy)性细胞基因治疗性细胞基因治疗(germ line gene therapy)1.产前诊断产前诊断2.携带者测试携带者测试3.症候前诊断症候前诊断4.遗传病易感性遗传病易感性（五）遗传疾病的预防（五）遗传疾病的预防重组DNA技术基本操作步骤；限制性核酸内切酶；自然界基因重组的方式；DNA克隆的概念；基因组DNA文库、cDNA文库概念；同源重组、接合、转化、转导作用概念；特异位点重组、转座重组机制；抗药性标记选择、互补筛选机制。1.关于同源重组不正确的是：关于同源重组不正确的是：A同源重组不需要特异的同源重组不需要特异的DNA序列序列 B同源重组要求两同源重组要

49、求两分子间序列必须相同分子间序列必须相同CRecBCD具有内切酶和解旋酶活性具有内切酶和解旋酶活性 DHolliday中中间体的形成，是同源重组的重要步骤间体的形成，是同源重组的重要步骤2.下列那种方式保证了免疫球蛋白的多样性？下列那种方式保证了免疫球蛋白的多样性？A转化转化 B转染转染 C基因重排基因重排 D转导转导 E接合接合3.F-细胞与细胞与F+细胞混合培养，产生细胞混合培养，产生F+细胞的过程为：细胞的过程为：A转化转化 B转导转导 C接合接合 D突变突变 E转位转位思考题：思考题：4.实验室内常用的连接外源性实验室内常用的连接外源性DNA和载体和载体DNA的酶是：的酶是：ADNA连

50、接酶连接酶 BDNA聚合酶聚合酶 CDNA聚合酶聚合酶 DDNA聚合酶聚合酶 E反转录酶反转录酶5.下列那项不是重组下列那项不是重组DNA技术中常用的工具酶：技术中常用的工具酶：A限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶 BDNA连接酶连接酶 CDNA聚聚合酶合酶 DRNA聚合酶聚合酶 E反转录酶反转录酶6.互补筛选属于：互补筛选属于：A抗药性标志筛选抗药性标志筛选 B酶联免疫筛选酶联免疫筛选 C标志补标志补救筛选救筛选 D原位杂交筛选原位杂交筛选 E免疫化学筛选免疫化学筛选7.什么叫基因克隆？简述基因克隆的步骤？什么叫基因克隆？简述基因克隆的步骤？8.简述简述互补筛选重组体质粒细菌的原理互补筛选重组体质粒细菌的原理