饲料中巴氯芬的测定

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1、饲料中巴氯芬的测定一一高效液相色谱法作者：易建希任凤莲来源：湖南饲料2015年第4期易建希任凤莲（1，湖南省兽药饲料监察所，湖南长沙410006： 2,中南大学化学化工学院，湖南长沙 410083）摘要：试验建立了饲料中巴氯芬的高效液相色谱测定方法。饲料中的巴氯芬用偏磷酸溶液 提取，混合型阳离子固相萃取柱净化，氨化甲醇溶液洗脱，0.1%磷酸水溶液：乙腈（89:11）作为 流动相，C18色谱柱进行分离，检测波长为220 nm，结果表明，在0.055.Og/mL浓度范围 内线性关系良好，r=0.999。该方法的检测限为0.5 mg/kg。本法操作简单，结果准确，可用于 饲料中巴氯芬的测定。关键词：

2、巴氯芬：饲料：高效液相色谱法巴氯芬为骨骼肌松弛药，机制尚不明，为有毒物品。巴氯芬能激活GABA-p受体，降低脊髓 单突触或多突触的反射电位及脊髓后根与后根间的反射电位，产生骨骼肌松弛作用。本品为选 择性B2受体激动剂的一种，具有营养再分配作用的氯丙那林具有相似的分子量与结构，属 于神经系统药物。巴氯芬可引起日间镇静、嗜睡、恶心、调节紊乱等症状，还可能会降低惊厥 阈，并引起惊厥发作，对癫痫患者危害非常大。某些病人可显反常的反应而表现为痉挛状态加 重，可能会出现肌张力过低，使病人难于行走或照料自已，这严重的危害到人民的食品安全与 生命安全。在农业部第1519号公告“禁止在饲料和动物饮水中使用的物质

3、”中，其功效及分子 结构类似药物“氯丙那林”已经被禁止用于饲料中。为防止不法分子将巴氯芬替代氯丙那林做 非法添加，确保人民的身体健康，有效打击饲料中非法添加的行为，建立简便、快速、准确的 检测饲料中巴氯芬的方法显得尤为重要。因此本文建立了高效液相色谱方法对饲料中的非法添 加巴氯芬进行测定。1材料与方法1.1试剂与材料除另有说明外，所用试剂均为分析纯，水为符合GB/T 6682规定的一级水。甲醇：色谱纯; 乙腈：色谱纯；磷酸：色谱纯；偏磷酸；氨水；提取液：称取11.43g偏磷酸用水溶解，并稀释 至800mL，与200mL甲醇混匀：4%氨水一甲醇溶液：将4mL氨水与96mL甲醇混合均匀：标准品:

4、巴氯芬（纯度398%）:标准储备液：精确称取标准品lOmg（精确到O.lmg），用甲醇定容于 50mL容量瓶中，该溶液浓度为0.2mg/mL；标准工作液：准确移取适量标准储备液，用流动相配 成0.05、0.1、0.2、0.5、1、2、5pg/mL；微孔滤膜；混合型阳离子固相萃取柱（60 mg/3 mL）。1.2仪器与设备高效液相色谱仪（配有紫外检测器）；分析天平：感量0.00001g和0.001 g；固相萃取装 置；旋涡混匀器：离心机：恒温振荡器：氮吹仪。1.3液相色谱条件检测波长：220nm；色谱柱：C18柱，5pm，250mm*4.6mm;流动相：ImL磷酸用水稀释至1uL，并按89:11

5、的比例和乙睛混合，用前超声脱气5min；流速：1.0 mL/min，进样量：20pL。1.4样品前处理准确称取试样2.OOg，置于lOOmL具塞锥形瓶中，准确加入50.OOmL提取液，超声提取 lOmin，振荡摇床振荡20 min。取上层液于8000r/rmn离心5 min，取上清液备用。用5mL甲醇、 5mL水活化固相萃取柱，准确移取5.OOmL备用液过柱，用SmL水、5mL甲醇淋洗，真空抽干。 SmL氨水一甲醇溶液洗脱，收集洗脱液，于50C下氮气吹干。准确移取1.00 mL流动相溶解残 留物，涡旋混合1 min，过微孔滤膜后，供高效液相色谱分析。1.5标准曲线的绘制将分别配制为0.05、O

6、.l、0.2、0.5、1、2、5p,g/mL的标准工作液，分别注入色谱仪，测 定各浓度工作液的峰面积，以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。1.6灵敏度的测定分别称取3份5.00 g空白配合饲料，按样品处理方法测定，测得基线噪音值，按10倍信 噪比计算，求得该方法的定量限。1.7回收率的测定称取5.00 g空白配合饲料，分别添加一定量的标准工作液，使得添加浓度分别为I.O， 2.0，5.0 mg/kg，每一浓度的样品设置5个重复，按样品处理方法测定，用外标法根据峰面积 计算其含量和添加回收率，2结果与分析空白饲料、阳性添加饲料、巴氯芬标准品溶液的液相色谱见图1图3。2.1标准曲线图月芝

7、01埼迁5月哄余国坐猪怖梢萱化国无用小m标推品色洁图IHM皿的眦蛔e斓麻携是甄史I,翻.成QI1仰嫩r昌源T = dthU购Wi b-3.W024e-WIIHI SJ陂皿湖ISI E翌林踱菲般腿” hhlLct 日 Jrpri-iJtU(hptH mM吟京2.2方法的定量限该方法测定巴氯芬的定量限为1.0 mg/kgo2.3准确度和精密度 添加浓度为1.0, 2.0, 5.Omg/kg时，测得巴氯芬的平均回收率分别 为 81.8%, 85.7%, 93.1%，变异系数分别为 6.05%, 4.210/0, 3.71%。3讨论3.1提取溶剂的选择巴氯芬溶于热水，几乎不溶于乙醇、乙醚、丙酮及其他有

8、机溶剂，易溶于酸性、碱性水溶 液。试验中采用O.lmol/L盐酸水溶液：甲醇（4： 1）； 0.5%偏磷酸水溶液：甲醇（4： 1）；三水乙 酸钠+冰乙酸水溶液，等提取溶液提取，通过试验比较各种溶液的回收率，0.5%偏磷酸水溶液： 甲醇（4： 1）提取液能较好的提取饲料中的巴氯芬，并且减少杂质对目标物的影响。3.2净化条件的选择巴氯芬为碱性化合物，难溶于其他有机溶剂，通过比较HLB、C18、PCX、Aluminum N、scx、 MCX、MAX等固相萃取小柱的回收率和净化效果，最终确定选择回收率高，净化效果好的混合型 阳离子固相萃取柱进行净化，3.3流动相的选择巴氯芬呈弱碱性，具有较强的极性，其

9、在反相色谱上保留时间比较好控制。甲醇的洗脱能 力低于乙腈，因此选择乙腈作为有机相。巴氯芬极性大，采用反相色谱时有机相的比例对巴氯 芬的保留影响比较大，选择合适比例的有机溶剂是很必要的。随着流动相中乙腈比例的加大， 巴氯芬的保留时间降低。为了避开样品中杂质的干扰峰，试验比较了 5%、8%、11%、14%、17% 五种乙腈浓度的色谱图，结果发现采用5%乙腈浓度，无法有效从色谱柱洗脱巴氯芬：采用11% 和14%乙腈浓度可有效洗脱巴氯芬：采用17%乙腈浓度时保留时间太短。从综合效率考虑乙腈浓 度选择11%为最佳。3.4波长的选择由巴氯芬在分光光度计的扫描图可知，巴氯芬最佳吸收波长为199nm,其响应值

10、最高，另一 略低吸收峰为220nm。而波长在220nm时，波长较大，受到其他杂质吸收干扰小，基线平且能 满足试验检测限的需要，因此确定最佳波长为220nm。4结论采用高效液相色谱检测技术测定饲料中巴氯芬含量的检测方法，在饲料中添加浓度为1.0， 2.0，5.Omg/kg时，测得巴氯芬的平均回收率范围分别为77.3%89.1%. 82.8% 91.7% ,90.7%96.2%，变异系数范围为 5.54%。7.47%，3.60%5.63%，2.49%3.75%，定量限 为l.Omg/kg。方法具有较好的灵敏度、准确度和精密度，定量限符合相关规定。高效液相色谱法有“高压、高速、高效、高灵敏度、应用范围广”的特点，县一级基层实 验室均可满足本方法的实验条件，具有很高的推广价值。但由于紫外检测器本身的局限性，导 致在检测的过程中，可能存在假阳性的问题，就需要使用更高级的质谱或者串接质谱检测器来 做精确辨别。