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1、不同剂量的重组腺相关病毒载体介导的人血管抑素对糖尿病肾病大鼠 目的 探讨不同剂量的重组腺相关病毒载体介导的人血管抑素(recombinant adeno-associated virus carrying human angiostatin gene, rAAV-AS)对糖尿病肾病(diabetic nephropathy, DN)大鼠肾功能的影响。方法 60只清洁级雄性SD大鼠随机抽取10只作为正常对照组(NC组)，其余造模为糖尿病大鼠。大鼠空腹12 h腹腔注射链尿佐菌素(STZ)60 mg/kg，72 h后尾静脉测血糖大于16.7 mmol/L记为造模成功，适应性喂养1周后，把糖尿病大鼠随
2、机分为DN组(n=10)，rAAV-0组(n=10), AS1组(n=10, 11012 VG/kg)，AS2组(n=10, 21012 VG/kg)，AS3组(n=10, 41012 VG/kg)。AS1组、AS2组和AS3组3组大鼠尾静脉注射rAAV-AS, NC组和DN组分别注射同等剂量的生理盐水，rAAV-0组注射同等剂量rAAV-0空载体;从第2周起，整个实验过程共持续8周。8周后检测各组大鼠的体重(body weight, BW)、肾重(kidney weight, KW)，计算肾指数(kidney index, KI)，检测血糖(blood glucose, BG)、糖化血红蛋白
3、(hemoglobin A1c, HbA1c)、尿素氮(blood urea nitrogen, BUN)、血肌酐(serum creatinine, SCr)、尿微量白蛋白(miscroalbunminuria, MAU)。结果 与NC组相比，DN、rAAV-0、AS1组的KI、MAU、BUN、SCr、BG、HbA1c明显增高(P糖尿病肾病;腺相关病毒载体介导的血管抑素;基因治疗Abstract:Objective To investigate the effect of different doses of recombinant adeno-associated virus carryi
4、ng human angiostatin gene (rAAV-AS) on the renal function in rats with diabetic nephropathy. Methods 10 out of 60 male SD rats of clean grade were randomly allotted as the normal control group, while the others were used to establish models of diabetic rats. Streptozotocin (STZ) 60 mg/kg was intrape
5、ritoneally injected in rats at the end of 12 h of fasting to induce diabetic model. 72 h later, the blood glucose level of caudal vein was above 16.7 mmol/L, and the diabetic model was marked as successful. After a week of adaptation, diabetic rats were randomized into 5 groups (n=10): group DN, gro
6、up rAAV-0, group AS1 (11012 VG/kg), group AS2 (21012 VG/kg), group AS3 (41012 VG/kg). Different doses of rAAV-AS were injected into groups AS1, AS2 and AS3 from the caudal vein, and the corresponding doses of normal saline were injected in group NC and corresponding doses of rAAV-0 idler injected in
7、 group DN. At the end of the 8th weeks, their body weight (BW) and kidney weight (KW) were measured to calculate kidney index (KI). The blood glucose (BG), glycosylated hemoglobin (HbA1c), miscroalbunminuria (MAU), blood urea nitrogen (BUN) and serum creatinine (SCr) were determined.Results Compared
8、 with group NC, the levels of KI, BG, HbA1c, MAU, BUN and SCr increased significantly in DN, rAAV-0 and AS1 groups (PKey words： diabetic nephropathy; recombinant adeno-associated virus carrying human angiostatin gene; gene therapy糖尿病肾病(diabetic nephropathy， DN)是糖尿病最常见的慢性微血管并发症之一,在1型糖尿病中发病率约33%44%,在2
9、型糖尿病中约15%60%,并是造成终末期肾病(end-stage renal disease，ESRD)的重要原因之一。但目前临床应用的药物尚不能有效地逆转DN的进程，因此找到一种可靠的方法预防和治疗糖尿病肾病迫在眉睫。血管抑素(angiostatin, AS)具有抑制血管生成、抗纤维化等生物学活性，研究表明AS能降低DN的蛋白尿1，但是由于注射AS在体内活性不稳定、表达效率差，因此我们使用不同剂量重组腺相关病毒载体介导的人血管抑素(recombinant adeno-associated virus carrying human angiostatin gene, rAAV-AS)治疗DN大
10、鼠，观察其对DN大鼠尿微量蛋白和肾功能的影响，以明确不同剂量rAAV-AS对早期DN大鼠的作用。1 材料和方法1.1 实验动物和试剂 雄性SD大鼠，体重160180 g,8周龄，由徐州医学院实验动物中心提供。链脲佐菌素(STZ)购自美国Sigma公司,rAAV-AS由本元正阳公司构建。1.2 实验分组和模型制备 60只清洁级雄性SD大鼠适应性喂养标准大鼠饲料1周后，从中随机抽取10只作为正常对照组(NC组)，其余造模为糖尿病大鼠。大鼠空腹12 h腹腔注射STZ 60 mg/kg，NC组仅注射柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液。72 h后尾静脉测血糖大于16.7 mmol/L记为造模成功，适应性喂养1周后，
11、把糖尿病大鼠随机分为DN组(n=10)，腺相关病毒空载体组(rAAV-0，n=10), rAAV-AS低剂量治疗组(AS1组, n=10, 11012 VG/kg)， rAAV-AS中剂量治疗组(AS2组, n=10, 21012 VG/kg)，rAAV-AS高剂量治疗组(AS3组, n=10, 41012 VG/kg)。rAAV-AS各剂量组大鼠尾静脉注射rAAV-AS, NC组和DN组分别注射同等剂量的生理盐水，rAAV-0组注射同等剂量rAAV-0空载体;从第2周起，整个实验过程共持续8周。1.3 标本收集 各组大鼠于8周末测量体重(BW)，尾静脉取血测定血糖，用代谢笼收集24 h尿液、
12、离心，保存于-40冰箱中，以待测尿白蛋白。大鼠隔夜空腹，1%的戊巴比妥钠(50 mg/kg 腹腔注射)麻醉下心脏采血、离心、取上清，-40冰箱保存，以备测定糖化血红蛋白(HbA1c)、尿素氮(BUN)、血肌酐(SCr)。然后，取大鼠双肾，除去包膜后测量肾重(KW)，计算肾指数(KI)，公式：KI=KW(g)/BW(kg)。1.4 生化指标检测 胶体金双抗体夹心法检测尿微量白蛋白(MAU)，葡萄糖氧化酶法检测血糖(BG)，分析法检测HbA1c，日立7600 型全自动生化分析仪检测BUN、SCr。1.5 统计学处理 实验数据以s表示，采用SPSS 13.0统计软件，两组间比较采用t检验，多组间比较采用完全随机设计方差分析法(ANOVA), P
不同剂量的重组腺相关病毒载体介导的人血管抑素对糖尿病肾病大鼠
