hIGF1基因在退变椎间盘中的表达

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1、hIGF1基因在退变椎间盘中的表达 探讨hIGF1基因在退变椎间盘中的表达。方法参考文献13制备出椎间盘退变（intervertebral disk degeneration，IVDD）动物模型24只，随机分为AdCMVhIGF1、hIGF1生长因子及PBS组，每组有新西兰大白兔8只。L4、5、L5、6椎间盘中分别注射第2代AdCMVhIGF1（8108 PFU）、hIGF1生长因子（100 g/L）、PBS 25 L。注射后1、2、4、8周，Western blot检测椎间盘中hIGF1蛋白表达。结果hIGF1蛋白带出现在7 539.96 。AdCMVhIGF1、hIGF1蛋白表达持续达4周

2、以上，hIGF1组表达持续约2周；PBS注射组无hIGF1蛋白表达。结论hIGF1基因能够在退变椎间盘中表达；hIGF1基因转染表达的持续时间长于单纯hIGF1生长因子直接注射。椎间盘 退变 hIGF1Abstract：ObjectiveTo study hIGF1 gene expression on intervertebral disk degeneration.MethodTwentyfour male NewZealand rabbits IVDD models were made according to reference and randomly divided into Ad

3、CMVhIGF1,hIGF1 growth factor and PBS group.Twenty five microlitre the second generation AdCMVhIGF1（T=80109 PFU/L）,hIGF1 growth factor（100 g/L）and PBS were respectively injected into L4、5,L5、6 intervertebral disk under fluoroscopic guidance.One,two,four and eight weeks postoperation,rabbits were sacr

4、ificed,intervertebral disk samples were harvested.Total proteins of equal mass intervertebral disks were extracted,isolated in SDSpolyacrylamide gel electrophoresis（SDSPAGE）and transferred to polyvinylidene difluoride（PVDF）Millipore.The hIGF1 growth factor expression were indentified with Western bl

5、ot.ResultThe hIGF1 interest protein existed at 7.6 kiloDalton.At one week after injection,its expression quantities were almost equal between AdCMVhIGF1 and hIGF1 growth factor group.At two week after injection,it obviously declined in hIGF1 growth factor group.At four week after injection,it still

6、expressed in AdCMVhIGF1 group.At eight week after injection,it did not express in three groups.ConclusionAdCMVhIGF1 successfully infects degenerative intervertebral disk.In AdCMVhIGF1 group,the hIGF1 gene expression lasts longer than that in hIGF1 growth factor group.Key words:intervertebral disk;de

7、generation;insulinlike growth factor1椎间盘退变（intervertebral disk degenergion，IVDD）的确切分子生物学机制尚不明确，多数学者认为IVDD为多因素协同作用的结果，与椎间盘中细胞营养下降、力学及遗传等因素有关。但细胞因子减少及致炎因子增多等分子生物学改变在发病中起主要作用4。1991年，Thompson等5检测了多种细胞因子能够促进犬椎间盘细胞分泌细胞外基质，开始了生长因子应用于椎间盘的体外实验研究，而后相继出现了多篇文献报道6。但椎间盘细胞的体外培养条件与体内椎间盘细胞所处的内环境有明显差异；生长因子维持作用短暂；发挥作用

8、需要多次或者连续给药，造成给药途径引发感染等；另外生长因子的费用亦不菲。转基因技术的发展为解决生长因子持续作用于椎间盘带来便捷之道。Nishida等7、8以腺病毒为载体，将LacZ基因、TGF1基因转染到正常成年兔椎间盘获得成功。但与正常椎间盘有明显区别的是，椎间盘发生退变后，其细胞数量减少，功能不活跃，在生物学特性方面与正常细胞存在明显差异。退变的椎间盘细胞在椎间盘退变的生物学环境中能否被转染仍是未知。即便能够转染，转染后基因表达水平如何，能否起到修复IVDD的作用，均需进一步研究。本研究将自行构建的AdCMVhIGF1载体9直接注入新西兰大白兔IVDD模型13，观察hIGF1表达水平情况。

9、1材料与方法1.1主要实验材料、仪器及设备蛋白质检测试剂盒（BioRad公司，美国）；鼠抗人IGF1单克隆抗体（RD Systems Inc，美国）；辣根过氧化物酶结合的抗鼠IgG（Santacruz Biotechnology,英国）；预染蛋白质分子量Marker（New England BioLabs Inc，英国）；PVDF膜（Millipore，美国）；丙烯酰胺，抑蛋白酶肽，苯甲基磺酰氟及N，N亚甲双丙烯酰胺（Amresco，美国）；N，N，N，N四甲基乙二胺（Sigma，美国）；恒压恒流水平电泳仪及垂直电泳电转移槽（BioRad，美国）；XW80漩涡振荡器及振动摇床（上海跃进医疗器械

10、厂，中国）。1.2hIGF1生长因子、第2代AdCMVhIGF1载体溶液的配制将hIGF1生长因子用PBS溶液稀释，分装入EP管中，每管2.510-3g，-70 保持。使用前加PBS至25 L，每个椎间盘注入的剂量为2.510-3g。参考文献10合成的第2代AdCMVhIGF1载体稀释到每25 L含有2106 PFU。每个椎间盘注入的腺病毒总量为2106 PFU。1.3腰IVDD动物模型制备、给药及标本制备参考文献13制备出腰IVDD动物模型24只，随机分为AdCMVhIGF1、hIGF1生长因子及PBS组，每组有新西兰大白兔8只。实验动物用氯氨酮针3550 mgkg、氯丙嗪针1025 mgk

11、g联合肌肉注射，动物麻醉成功后，右侧卧位于手术台（本研究组设计定做）。在X线透视下，用硬脊膜穿刺针穿刺L4、5、L5、6椎间盘，穿刺成功后，拔出硬脊膜穿刺针内塞，放入腰麻针。用100 L微量移液器依动物分组各注射携带hIGF1基因的腺病毒载体（滴度为80109 PFUL）、hIGF1生长因子（100 gL）、PBS，注入容量均为25 L。分别于注射后1、2、4、8周，各组实验动物均取2只，动物麻醉后，穿刺耳缘静脉注入10 ml空气致死。迅速切取腰椎全段，切除椎板及附着肌肉，分别切取L4、5、L5、6椎间盘，去除上下软骨终板；仅保留完整的纤维环、髓核组织。1.4Western blot检测hIG

12、F1蛋白表达1.4.1组织总蛋白质提取及浓度测定（1）组织剪碎：于0 以PBS充分洗涤组织碎片，4 3 000 r/min离心5 min，估算离心管底部沉淀物体积；吸出上清液；（2）以5倍体积预冷的悬浮缓冲液分散组织碎片，尽快加入等体积的2SDS凝胶加样缓冲液；（3）将样品置于沸水浴中加热10 min，采用带有浸入尖头或能在冷却杯中同时处理多个样品的超声处理仪对DNA进行剪切；（4）于室温以10 000 r/min将样品离心10 min，将上清液移于另一管中，弃去沉淀物；（5）按BioRad蛋白质检测试剂盒说明检测样品蛋白浓度。1.4.2Westernblot检测hIGF1蛋白表达（1）制备S

13、DS聚丙烯酰胺分离胶（8 ml）、12的SDS聚丙烯酰胺浓缩胶（3 ml）；（2）加样：每样本各取总蛋白50 g，加等体积2SDS上样缓冲液（约10 L）混匀，另一管加预染蛋白Marker（用于考马斯亮蓝染色）或辣根过氧化物酶结合的生物素化蛋白Marker（用于Westernblot）20 L，瞬时离心使溶液沉于管底，标本和蛋白Marker均于沸水中煮沸35 min，按顺序用微量加样器将每管样本中的全部溶液或蛋白Marker加入样品孔中；（3）电泳：于120V恒压条件下电泳，当溴芬蓝染料进入分离胶后，电泳条件改为恒压220 V，继续电泳直至染料达到胶底；（4）考马斯亮蓝染色：取出电泳玻板，小心取出凝胶，将疑胶放入一培养皿中，倒入0.25考马斯亮蓝染色液，放在摇动的脱色摇床上于室温染色40 min。然后倒出并回收染色液，加入脱色液，平缓摇动，直到出现明显的蓝色的蛋白条带；（5）半干式电印迹转膜，Western Blot检测hIGF1生长因子表达：用封闭液封闭PVDF膜；用0.1 molL PBST洗涤PVDF膜5 min1次；用一抗孵育PVDF膜，4 过夜；用0.1 molL PBST振荡洗涤PVDF膜5 min2次；37 用1200的二抗孵育PVDF膜1 h；用0.1 molL PBST振荡洗涤PVDF膜5 min4次；DAB显色。