“创新实验”顺铂和阿霉素的浓度对细胞增殖产生的影响

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1、创新实验论文探究抗肿瘤药物顺铂和阿霉素的浓度对人宫颈癌细胞HeLa 细胞增殖和凋亡产生的影响姓名：胡尔曼那力艾力胡加学号：201111202924年级： 2011 级 专业：生物科学探究抗肿瘤药物顺铂和阿霉素的浓度对人宫颈癌细胞 HeLa 细胞增殖和凋亡产生的影响 摘要：本实验主要探究抗肿瘤药物顺铂和阿霉素对 HeLa 细胞增殖及 凋亡的影响，HeLa细胞是一种癌细胞，增殖速度快，通过探究其药 物的浓度对癌细胞的抑制及其凋亡情况，可以利用药物有效地控制细 胞的增殖并使细胞致死。通过MTT比色法对HeLa细胞进行生长曲线 的测定，观察细胞的生长情况。在生长曲线上找出相应的 IC50 的值， 并且

2、比较不同浓度下的IC5的值，即可知道药物的浓度对细胞增殖所 造成的影响。通过流式细胞术实验方法测出细胞的凋亡比例及各个周 期时相的百分比即可知道不同药物对于HeLa细胞凋亡的影响。 前言：细胞增殖是生物体的重要生命特征，细胞以细胞分裂的方式进 行增殖。通过细胞分裂，可以将复制的遗传物质，平均地分配到两个 子细胞中去。可见，细胞增殖是生物体生长、发育、繁殖和遗传的基 础。细胞如果增殖异常如无限地增殖，将会导致生物体的正常生命功 能受阻，如肿瘤的发生。细胞死亡也是生物体的重要生命活动之一。 多细胞生物发育过程中，在细胞增殖和分化的同时一些细胞被选择性 地消除，以形成组织、器官和四肢，而且在整个生命

3、进程中，细胞的 死亡与新细胞的产生之间的动态平衡对于维持组织和器官的正常功 能具有重要作用。因此，细胞死亡调控的异常与帕金森症、自身免疫 性疾和癌症等疾病的发生和发展密切相关。癌症是威胁人类健康的最严重的疾病之一，并呈不断上升趋势。目 前用于癌症治疗的主要手段有手术、放疗、化疗和生物治疗。肿瘤化学治疗是应用一种或数种化学药物，通过口服或注射达到治疗肿瘤的 方法。不同肿瘤的化疗效果差别很大，手术前后的合理化疗，有助于 提高疗效。目前发现许多天然药物具有抗肿瘤作用。其中很多抗肿瘤 药物可以明显抑制肿瘤细胞的增殖，而对正常细胞的毒副作用较小。 如顺铂、阿霉素、喜树碱、顺铂、阿糖胞苷、放线菌酮、环磷酰

4、胺。 这些药物均可以抑制肿瘤细胞的增殖，并且目前有不错的效果。 关键词：顺铂 阿霉素 HeLa 细胞 细胞增殖 细胞凋亡1 实验原理1.1 HeLa 细胞HeLa细胞是源自一名美国妇女的子宫颈癌细胞的细胞。HeLa细胞株是由正 常子宫颈细胞被一种人类乳突状瘤病毒 （Human Papillomavirus 18 或 H PV18 ） 转型成癌细胞的 HeLa 细胞至今已被视为“不死的”，也就是说此细胞株（不同 于其他人类细胞）不会老死，而且可以不限次数的分裂下去，而且已培养出一个 不间断的系列。从1951年至今， H e La 细胞已经培养了50多年，分裂了18000 次以上仍然没有停止的迹象

5、。此细胞株即使和其他癌细胞相比，增殖依然异常迅 速。1.2 顺铂和阿霉素顺铂（顺氯氨铂，cisplatin,DDP）将所含之氯解离，然后与 DNA 上的核碱鸟嘌呤、腺嘌呤和胞嘧啶形成 DNA 单链内两点的交叉联结，也可能形成双链间的交叉联结，从而破坏DNA的结 构和功能。对 RNA 和蛋白质合品属细胞周期非特异性药物，具有细胞毒性， 可抑制癌细胞的DNA复制过程，并损伤其细胞膜上结构，有较强的广谱抗癌 作用。临床用于卵巢癌、癌前列腺癌、睾丸癌、肺癌、鼻咽癌、食道癌、恶 性淋巴瘤、头颈部鳞癌、甲状腺癌及成骨肉瘤等多种实体肿瘤均能显示疗效。 成的抑制作用较弱。属周期非特异性药物。阿霉素是一种抗肿瘤

6、抗生素，通过抑制癌细胞遗传物质核酸的合成来杀灭癌细胞。 盐酸阿霉素对机体产生广泛的生物化学效应。具有强烈的细胞毒性作用。其作用 机制主要是阿霉分子嵌入DNA而抑制核酸的合成。1.3 PI 和 Ho33342pi （碘化丙啶）：双链核酸标记物，亲水性，不能通过完整细胞膜，激发光谱和 发射光谱分别为535nm和617nm,激发光波长范围较宽，从紫光到绿光均可作 为激发光。Ho.33342:特异结合AT区的DNA标记物，亲脂性，激发光谱和发射光谱分别 为 350nm 和 461nm细胞类型膜完整性染色质凝集程 度凋亡小体的形 成PI染色Ho.33342正常细胞完整不凝集无无法透过蓝色凋亡细胞完整高度

7、凝集有无法透过蓝色坏死细胞破损一定程度的凝 集无橘红色蓝色（同时染PI 被橘红色遮掩）1.4 MTT 比色法MTT 比色法，是一种检测细胞存活和生长的方法。其检测原理为活细胞线粒体中 的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒（Formaza n） 并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。二甲基亚砜（DMSO ）能溶解细胞中的甲 瓒，用酶联免疫检测仪在 490nm 波长处测定其光吸收值，可间接反映活细胞数 量。在一定细胞数范围内，MTT结晶形成的量与细胞数成正比。1.5 IC50曲50是指细胞被抑制一半时抑制剂的浓度，这里的反应可以是酶催化反应，抗 原抗体反应等。在凋亡方面，可以理

8、解为一定浓度的某种药物诱导肿瘤细胞凋亡 50%，该浓度称为 50%抑制浓度，即凋亡细胞与全部细胞数之比等于 50%时所对 应的浓度， IC50 值可以用来衡量药物诱导凋亡的能力，即诱导能力越强，该数值 越低，当然也可以反向说明某种细胞对药物的耐受程度。2 . 实验步骤2.1 利用 MTT 法检测细胞增殖1、取对数生长期的细胞，用胰酶消化计数,配制细胞悬液浓度为4x104/mL,取 细胞接种到96孔板，每孔200L，8000细胞/孔。2 、加药处理:（1）24小时后，待细胞贴壁后吸取培养基200L,弃除，调零孔 不作处理。 （ 2）设置药物浓度分别为 1x10-3 g/ L、 2x10-3 g/

9、 L、 4x10-3 g/L、6x10-3g/L、8x10-3g/L,对应按每列分别加入Cc1、C2、C4、 C6、C8（顺铂组），Cd1、D2、D4、D6、D8 （阿霉素组）列中。96孔板上药 物分布如表1所示： （ 3）配置浓度梯度及加药方法： 药物母液浓度为5mg/mL，即5g/L,顺铂溶于DMSO,盐酸 阿霉素溶于水。分别取0.4mL顺铂/阿霉素，加入1.6mLDMSO/水，混合均 匀，得到1p g/p L的顺铂及阿霉素溶液。顺铂与阿霉素的浓度梯度配置 方法相同。 取药物2/4/8/1716L,对应加入14/12W）LDMSO/水（药物为顺 铂即加DMSO,药物为阿霉素即加水），各加入

10、2mL培养基，即配制出浓 度分别为为 1x10A-3p g/p L、2x10A-3p g/p L、4x10A-3p g/p L、6x10A-3 p g/p L、8x10A-3p g/p L的药物。两种药物不同浓度分别相应加入Cc1、 C2、C4、C6、C8（顺铂组），Cd1、D2、D4、D6、D8 邙阿霉素组）列中，每 孔 200p L。取培养基2mL，分别加入16p LDMSO/水，混合均匀，加入到对照对照 2 列中，每孔 200p L。3、测定：取测定孔，弃去培养基，加100 p L新鲜的培养基，加12 p L MTT,4 小时后加 100 p L 裂解液。过夜后，用酶标仪测定 OD 值。

11、4、根据测得OD值，用SPSS软件进行分析，求出以对照组吸光度OD值 减少一半所需的药物浓度IC50，即半数抑制浓度。2.2 细胞的形态学观察 1 、取生长到80-90%融汇度，对数生长期的细胞，按1：4比例传代。取 1 瓶细胞传到 4 瓶 。 2、按求得的顺铂及阿霉素浓度在传代的第二天，向培养基中加入药物或 对照溶液。弃除细胞培养瓶中原培养液，加入 5mL 新培养基。分别取浓 度为5mg/mL的顺铂及阿霉素母液，其中顺铂7p L,阿霉素4p L各加入 细胞培养瓶中。对照组分别取DMSO7p L,水p L各加入细胞培养瓶中。3、48-72 小时后，收集培养液，用胰酶适度消化细胞， 用收集的培液

12、吹打细胞， 将分散成单个的细胞悬液收集至10mL离心管中，1000rpm,离心15 min去上清， 用 0.2 毫升 PBS 重悬细胞 4、取 200 p l PBS 细胞悬液，加入 PI 20 p L（终浓度 100 p g/ml ）,Ho.33342 2p L （终浓度10p g/ml），混匀，37度温箱中避光标记15min。（带手套操 作） 5、 1000rpm，离心 10min，弃上清，加 10-50 p L PBS 重悬，取 10 p L 滴于载玻片上，盖片（不能有气泡或漂起），保存于暗处。6、荧光显微镜观察拍照（紫外激发）。3实验结果3.1MTT 法实验结果顺铂的实验结果：1246

13、8（调零）1.2170.5610.6280.2531.3591.0250.7170.610.2561.6160.9830.8870.5850.2791.7011.0210.8420.4950.2491.7820.8880.5590.2811.8040.9710.5450.3420.860.610.1980.6011.6524数据不可 用1.06150.751750.5703333330.26542857对照1.65241.65241.65241.65241.6524数据不可 用0.6423989350.454944320.3451545230.16063215抑制率0.35770.54520.

14、65500.8394顺钳浓度12468抑制率0.35770.54520.65500.8394由 MTT 实验结果可看出，可能会出现波动较大的数据，计算 IC50 时应将 这些数据舍去。根据所测 OD 值可算出顺铂对 BGC-823 细胞的 IC50 值为 5.698 左右。但数值波动较大，实验结果不稳定，综合全班实验可知顺铂 的添加浓度约为 7。阿霉素的实验结果阿霉素7890.9610.8250.6660.9440.830.5071.260.7480.621.1920.750.5751.1120.6431.2581.2641.1415714290.788250.60221.4834285711

15、.4834285711.4834285710.7695493070.5313703780.4059514640.23060.46870.594051011120.4450.110.360.2431.5080.3980.2121.4530.2760.1731.440.460.1541.3850.4120.1371.3930.3790.291.3381.8670.390.1884285711.4834285711.4834285711.483428571对照0.2629044680.1270223420.73710.8730抑制率阿霉素浓度12468抑制率0.23060.46870.594050.

16、73710.8730分析：由 MTT 实验结果可看出，可能会出现波动较大的数据，计算 IC50 时应将这些数 据舍去。根据所测OD值可算出顺铂对BGC-823细胞的IC50值为3.054左右。但 数值波动较大，实验结果不稳定，综合全班实验可知顺铂的添加浓度约为 4。3.2顺铂和阿霉素对人宫颈癌细胞HeLa细胞凋亡的影响的形态学观察图一为Ho.333422和PI染料双染HeLa细胞得到的细胞核形态图。从图中观察 可以看到有呈蓝色的细胞，也有呈红色的细胞。图一中的 A、B 代表未加 顺铂和阿霉素的空白对照。C为加入顺铂的HeLa细胞的细胞核形态图，D 为加入阿霉素的HeLa细胞的细胞核形态图。CD

17、图一 HO.333422-PI双染观察凋亡细胞的形态从图一中可以看出，对照组A、B的细胞数目要明显多于实验组C、D的细胞数 目。 C、 D 实验组加入了顺铂和阿霉素，由此说明顺铂和阿霉素确实对于细胞 的生长具有抑制作用。当比较 A、 C 两组的时候发现，对照组基本上没有出 现凋亡细胞；分别观察两个视野可以发现，加药组出现了部分凋亡细胞。从 细胞凋亡形态观察结果可看到，视野中的坏死细胞较多，可能因为实验操作 不够轻柔，从而导致细胞坏死；也可能是在用胰酶消化细胞消化过度而引起 的细胞坏死。因此实验时要注意以上两点。当 BD 两组相比较可发现对照组 基本上没有出现凋亡细胞；分别观察两个视野可以发现，

18、加药组出现了部分 凋亡细胞（一个视野中有 4 个，另一个视野中有2 个）。从细胞凋亡形态观察 结果可看到，视野中有少量坏死细胞，可能因为实验操作不够轻柔，从而导 致细胞坏死；也可能是在用胰酶消化细胞消化过度而引起的细胞坏死。因此 实验时要注意以上两点。有上述的比较还可以知道，顺铂和阿霉素可以促进 细胞的凋亡。4. 实验总结综合上面所述的三个结果分析，顺铂和阿霉素都对 HeLa 细胞的增殖具有一 定的抑制作用。5. 实验注意事项1、整个实验期间注意无菌操作，注意细胞保种，发现细胞污染时要及早采取补 救措施2、做 MTT 时，加药顺序和处理时间要标记清楚不能弄混。3、每天加 MTT 和裂解液时，要在调零用的孔中进行相同操作。 4、细胞传代要每天观察，及时传代。5、每天操作时，要在显微镜下观察细胞生长状态，看是否有污染。6、染色要避光染色。6. 实验思考题肿瘤细胞和正常细胞在增殖调控上有什么区别？参考文献1 百度百科2 老师编的实验指导书3老师的 PPT