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1、SELDI蛋白质芯片筛选差蛋白质芯片筛选差异蛋白分子的二级鉴定异蛋白分子的二级鉴定 主要内容：主要内容：n一、一、SELDI蛋白质芯片技术蛋白质芯片技术n二、差异蛋白质电泳方法二、差异蛋白质电泳方法n三、三、差异蛋白质的二级质谱鉴定差异蛋白质的二级质谱鉴定 n四、四、SELDI蛋白质芯片技术发展现状蛋白质芯片技术发展现状 n五、五、SELDI蛋白质芯片技术发展趋势探讨蛋白质芯片技术发展趋势探讨一、一、SELDI蛋白质芯片技术蛋白质芯片技术1、定义、定义SELDI蛋白质芯片技术，即表面增强激光解蛋白质芯片技术，即表面增强激光解吸离子化飞行时间质谱吸离子化飞行时间质谱(surface-enhanc
2、ed laser desorption/ionization-time of flight-mass spectrometry)，是蛋白质组，是蛋白质组学研究中的一项新兴技术，在识别特定蛋白学研究中的一项新兴技术，在识别特定蛋白质表达物、蛋自质差异分析、测定血清中小质表达物、蛋自质差异分析、测定血清中小分子物质含量方面提供了新的思路与方法分子物质含量方面提供了新的思路与方法。2、应用、应用该技术已经逐渐应用与临床，目前已见其应该技术已经逐渐应用与临床，目前已见其应用于传染病、肿瘤等疾病诊断筛选的临床报用于传染病、肿瘤等疾病诊断筛选的临床报道。道。SELDI蛋白质芯片技术与传统方法比较蛋白质芯片
3、技术与传统方法比较，SELDI技术对于技术对于5kDa以下的低分子量差以下的低分子量差异蛋白和低丰度的差异蛋白质的检出效果较异蛋白和低丰度的差异蛋白质的检出效果较佳，而且该技术具有高通量、上样量低和灵佳，而且该技术具有高通量、上样量低和灵敏度高等优势。但经敏度高等优势。但经SELDI技术检出的差异技术检出的差异蛋自质仅具有分子量特征，需进一步进行分蛋自质仅具有分子量特征，需进一步进行分离和准确鉴定。离和准确鉴定。二、差异蛋白质电泳方法二、差异蛋白质电泳方法1、Tricine-SDS-PAGE分离蛋白分离蛋白 Tricine-SDS-PAGE是用于分子量在是用于分子量在1-10kD的肽的肽类的方
4、法。根据蛋白质亚基分子量的不同就可以分开类的方法。根据蛋白质亚基分子量的不同就可以分开蛋白质。该技术最初由蛋白质。该技术最初由shapiro于于1967年建立，他们年建立，他们发现在样品介质和丙烯酰胺凝胶中加入离子去污剂和发现在样品介质和丙烯酰胺凝胶中加入离子去污剂和强还原剂后，蛋白质亚基的电泳迁移率主要取决于亚强还原剂后，蛋白质亚基的电泳迁移率主要取决于亚基分子量的大小（可以忽略电荷因素）。基分子量的大小（可以忽略电荷因素）。二、差异蛋白质电泳方法二、差异蛋白质电泳方法2、双向凝胶电泳分离蛋白、双向凝胶电泳分离蛋白 根据蛋白质等电点和分子量差异连续进行成根据蛋白质等电点和分子量差异连续进行成
5、垂直方向的两次电泳。第一向为等电聚焦电泳，垂直方向的两次电泳。第一向为等电聚焦电泳，其基本原理是利用蛋白质分子的等电点不同进行其基本原理是利用蛋白质分子的等电点不同进行蛋白质分离。第二向为十二烷基硫酸钠蛋白质分离。第二向为十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰聚丙烯酰胺凝胶电泳（胺凝胶电泳（SDS-PAGE），是按蛋白质分子量），是按蛋白质分子量的大小进行分离的，再用考马斯亮蓝或的大小进行分离的，再用考马斯亮蓝或P银进行银进行检验，最后进行结果对比，解析检验，最后进行结果对比，解析。三、差异蛋白质的二级质谱鉴定三、差异蛋白质的二级质谱鉴定 14 近年来，生命科学技术的创新和突破，尤其是质谱技近年来，生命科学
6、技术的创新和突破，尤其是质谱技术的革新，对蛋白质组学研究起到了关键的推动作用。质术的革新，对蛋白质组学研究起到了关键的推动作用。质谱的数据结果是蛋白质组与序列数据库联系的桥梁。谱的数据结果是蛋白质组与序列数据库联系的桥梁。质谱（质谱（mass spectrometry，MS）的基本原理是在）的基本原理是在样品离子化后，根据不同离子质荷比的不同进行分离并确样品离子化后，根据不同离子质荷比的不同进行分离并确定分子量。质谱鉴定蛋白的方法具有灵敏度高，准确度高定分子量。质谱鉴定蛋白的方法具有灵敏度高，准确度高，易于实现自动化等优点。，易于实现自动化等优点。三、差异蛋白质的二级质谱鉴定三、差异蛋白质的二
7、级质谱鉴定80年代末，随着两种适合蛋白质研究的软电离方式的出现年代末，随着两种适合蛋白质研究的软电离方式的出现即电喷雾离子化（即电喷雾离子化（ESI）和基质辅助的激光解析离子化）和基质辅助的激光解析离子化（MALDI），使得质谱应用于生物大分子的鉴定成为可能。），使得质谱应用于生物大分子的鉴定成为可能。如今，质谱已成为蛋白研究中最重要的鉴定技术，是后基如今，质谱已成为蛋白研究中最重要的鉴定技术，是后基因组时代的关键核心技术。这种技术的应用范围已经从细因组时代的关键核心技术。这种技术的应用范围已经从细胞，组织以及整个有机体中蛋白质的表达到蛋白质翻译后胞，组织以及整个有机体中蛋白质的表达到蛋白质翻
8、译后修饰等多个方面。包括蛋白消化、上样打点操作、上机检修饰等多个方面。包括蛋白消化、上样打点操作、上机检测及质谱数据库检索。测及质谱数据库检索。四、四、SELDI蛋白质芯片技术发展现状蛋白质芯片技术发展现状 SELDI蛋白质芯片技术，蛋白质芯片技术，是用于蛋白质组学研究的是用于蛋白质组学研究的一项新技术，它是在一项新技术，它是在MALDI 基础上改进后实基础上改进后实行表面增强的飞行质谱。行表面增强的飞行质谱。SELDI蛋白质芯片技术的蛋白质芯片技术的出现为蛋白质差异分析提出现为蛋白质差异分析提供了新的有力工具，目前供了新的有力工具，目前已应用于如多种传染病及已应用于如多种传染病及恶性肿瘤标志
9、物检测中恶性肿瘤标志物检测中。Schagger等用等用Tris-Tricine体系代替体系代替Tris-glycine体系后可很好地体系后可很好地分离分子量在分离分子量在1100 kDa的蛋白质。该方法降的蛋白质。该方法降低了分离胶的低了分离胶的pH值值(pH 8.45)，使蛋自质的移动，使蛋自质的移动速度变慢，提高了电泳分速度变慢，提高了电泳分辨率；其次，解除短肽辨率；其次，解除短肽-SDS复合物与复合物与SDS颗粒的颗粒的共迁移效应，改善小分子共迁移效应，改善小分子量短肽的电泳效果。量短肽的电泳效果。仉红刚等研究考察该方法仉红刚等研究考察该方法的灵敏度与分辨率，结果的灵敏度与分辨率，结果发
10、现大致在发现大致在35-70kDa范范围的蛋白围的蛋白(例如例如53kDa的的微管蛋白微管蛋白-3)在在Tricine-SDS-PAGE中肉眼即能观中肉眼即能观察到清晰的分离条带察到清晰的分离条带-且且重复性较理想。重复性较理想。五、五、SELDI蛋白质芯片技术发展趋势探讨蛋白质芯片技术发展趋势探讨 近年来随着质谱技术的不断进步，质谱分辨率越来越高，蛋近年来随着质谱技术的不断进步，质谱分辨率越来越高，蛋白鉴定的电喷雾傅立叶变换离子回旋共振高分辨质谱也采用的是一白鉴定的电喷雾傅立叶变换离子回旋共振高分辨质谱也采用的是一种具有超高质量分辨能力的新型质谱仪，它将电喷雾离子化种具有超高质量分辨能力的新
11、型质谱仪，它将电喷雾离子化(ESI)技术结合于傅立叶变换离子回旋共振质谱仪技术结合于傅立叶变换离子回旋共振质谱仪(FTICR-MS)。在离子。在离子源的电离技术上和质量分析器上有着各自的优缺点。源的电离技术上和质量分析器上有着各自的优缺点。12 ESI技术与传统的电子轰击技术与传统的电子轰击(EI)电离、化学电离电离、化学电离(CI)、场解析、场解析(FD)离子化技术及快原子轰击离子化技术及快原子轰击(FAB)离离子化技术相比，具有更适于离子性极性化合物、质荷子化技术相比，具有更适于离子性极性化合物、质荷比小于比小于4000、化学噪音低、容易获得碎片离子信息、化学噪音低、容易获得碎片离子信息、
12、所鉴定蛋白质分子量可达所鉴定蛋白质分子量可达1，000，000Da等优点，等优点，但其离子源结构复杂，易受但其离子源结构复杂，易受Na+、K+等金属离子干等金属离子干扰，且不能用于分析非极性化合物的缺点仍难以避免。扰，且不能用于分析非极性化合物的缺点仍难以避免。五、五、SELDI蛋白质芯片技术发展趋势探讨蛋白质芯片技术发展趋势探讨 在质量分析器上在质量分析器上 23 与磁质谱仪、四极质量过滤器质谱仪、离子肼质谱与磁质谱仪、四极质量过滤器质谱仪、离子肼质谱仪相比，仪相比，FTICR-MS具有较扫描型质谱具有较扫描型质谱(磁质谱、四极磁质谱、四极杆等杆等)高得多的灵敏度；且其感应电流检测离子的方式
13、高得多的灵敏度；且其感应电流检测离子的方式是非破坏性的，离子可继续被储存、分析，从而实现是非破坏性的，离子可继续被储存、分析，从而实现多级质谱分析；具有超高分辨能力和质量精确度多级质谱分析；具有超高分辨能力和质量精确度(很容很容易实现几十甚至上百万的分辨率，无需内标就能达到易实现几十甚至上百万的分辨率，无需内标就能达到小于小于2ppm的质量准确度，是现有分辨率最高且质量的质量准确度，是现有分辨率最高且质量稳定性较好的目前蛋白质和肽段测序中的顶端质谱仪。稳定性较好的目前蛋白质和肽段测序中的顶端质谱仪。五、五、SELDI蛋白质芯片技术发展趋势探讨蛋白质芯片技术发展趋势探讨1 蛋白质芯片技术探讨蛋白
14、质芯片技术探讨3 仉红刚研究中所选两种目标蛋白均为分子量均大于仉红刚研究中所选两种目标蛋白均为分子量均大于50kDa的极性分子，因而仅从各电离技术适用的质量范围的极性分子，因而仅从各电离技术适用的质量范围上即可首先对排除上即可首先对排除EI(小于小于1000Da)、CI(小于小于1000Da)、FD(小于小于2000Da)、FAB(200-6000Da)等的选择，而选等的选择，而选用所鉴定蛋白质分子量可达用所鉴定蛋白质分子量可达1,000，000Da且尤其适于离且尤其适于离子性极性化合物的子性极性化合物的ESI技术。技术。五、五、SELDI蛋白质芯片技术发展趋势探讨蛋白质芯片技术发展趋势探讨在
15、质量分析器的选择上，磁质谱仪虽堪称经典，但在质量分析器的选择上，磁质谱仪虽堪称经典，但不能较好地与离子化技术连用、且体积大造价高；不能较好地与离子化技术连用、且体积大造价高；四极质量过滤器质谱仪虽体积小造价低且重复性好四极质量过滤器质谱仪虽体积小造价低且重复性好，但分辨率较低；离子肼质谱仪动态范围窄、不便，但分辨率较低；离子肼质谱仪动态范围窄、不便确定是否适用于目标蛋白，且易受检测器条件等多确定是否适用于目标蛋白，且易受检测器条件等多个仪器参数的影响因而重复性略差。个仪器参数的影响因而重复性略差。故以故以SELDI蛋白质芯片技术进行了蛋自质差异表达蛋白质芯片技术进行了蛋自质差异表达筛选，并进行差异蛋自的后续分离鉴定，采用双向筛选，并进行差异蛋自的后续分离鉴定，采用双向凝胶电泳方法能更有效地从蛋自质混合液中分离出凝胶电泳方法能更有效地从蛋自质混合液中分离出目标蛋白，进一步经目标蛋白，进一步经FTICR-MS可以获得较理想的可以获得较理想的鉴定结果。鉴定结果。
SELDI蛋白质芯片筛选差异蛋白分子的二级鉴定课件
