临床常见细菌的手工鉴定和结果判断

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1、临床常见细菌的手工鉴定和结果判断一. 细菌的鉴定步骤1、鉴定的概念：将一个未知的菌株按其生物学特性，经过与所有 已知菌种进行比较后划归到一个已知菌种的分析过程。2、对待鉴定的菌种要明确已经获得纯化培养或者该菌种在血平板 上生长良好，有单个菌落可以进行生化试验。（我们这里一般都 是预先纯化培养）3、对待鉴定的菌种进行革兰染色，观察形态（G+c, G-b, G-c, G+b）, 做触酶，氧化酶实验，然后按科，属，种逐步鉴定。要注意对待 鉴定的菌种选择一个合适的鉴定系统，临床常见细菌的快速简单 的鉴定系统我们都已经设计好，参考鉴定质控单。4、按鉴定质控单的要求填写好病人姓名，年龄，性别；标本类型，

2、标本编号，送检日期等。另外最重要的是要填写好该菌种的菌落 形态以及有无溶血。5、复习革兰染色，触酶实验，氧化酶实验。.革兰染色：是细菌鉴定过程中最常用最基本最重要的染色 方法。首先要将待鉴定的细菌涂片，固定（目的：杀死细菌，改变细菌对染料的通透性）。第一步：以结晶紫初染（染色液I）第二步：以卢戈氏碘液媒染（染色液II）第三步：用95%乙醇脱色（染色液III）第四步：最后用稀释复红复染（染色液W）.触酶实验（H2O2实验）：a. 原理：具有过氧化氢酶的细菌能催化双氧水生成水和初 生态氧，继而形成氧分子出现气泡。b. 方法：一般用玻片法，就是挑取菌落在洁净的玻片上涂开， 滴加3%过氧化氢数滴，观察

3、结果（立即有大量气泡产生者为阳 性，不产生气泡者为阴性）。要注意不能在血平板上进行实验， 这样易出现假阳性；另外陈旧菌落要是进行实验可能会导致假 阴性结果；还有不能在接种针或环上进行实验。c. 阳性对照用金黄色葡萄球菌，阴性对照用链球菌；试剂要 避光置4C冰箱保存。d. 应用：绝大多数含细胞色素的需氧和兼性厌氧细菌触酶实 验阳性，链球菌属阴性。临床常见细菌鉴定实验中我们一般用 于区别葡萄球菌属（+ ），微球菌属（+），链球菌属（一）。.氧化酶实验（Kovac实验）：a. 原理：氧化酶又称细胞色素酶，是细胞色素呼吸酶系统 的最终呼吸酶。酶并不直接与试剂（1%盐酸四甲基对苯二 胺）起反应，而是首先

4、使细胞色素c氧化，然后氧化型细 胞色素c使对苯二胺氧化，出现深兰色反应。b. 方法（滤纸法，菌落法，试剂纸片法）：一般我们采用滤纸法，取白色洁净滤纸条，沾取菌落少许，加试剂一滴，阳性者立即呈粉红色，继而出现深兰色。结果读取在10秒钟时为最佳，60秒内读取可靠。本实验避 免接触含铁物质（假阳性），也不能在含糖培养基上生长 的菌落进行实验（假阴性）。c. 阳性对照用铜绿假单胞菌，阴性对照用大肠埃希菌。d. 应用：奈瑟氏属的菌种均阳性，也用于区别假单胞菌 属和肠杆菌，前者阳性，后者阴性。二. 葡萄球菌属的鉴定葡萄球菌属主要的种有金黄色葡萄球菌，表皮葡萄球菌，腐生葡萄球菌。1、形态与染色：葡萄球菌直径

5、0.51.5 mm，菌体圆形，呈单个，成双以及不规簇状排列。染色呈紫色，为革兰阳性球菌。2.3.与链球菌的区别：触酶实验为阳性，而链球菌阴性；菌体形态 链球菌小于葡萄球菌，呈成双和链状排列的卵圆形的革兰阳性球 菌。与微球菌的区别：触酶实验同为阳性，但微球菌的菌体呈四联酵三状，要大于葡萄球菌，微球菌葡萄糖氧化发酵实验（操作方法同甘露醇OF试验）为氧化型；而葡萄球菌为发酵型。另外呋喃唑酮（即痢特灵50mg/片）敏感实验微球菌为耐药，而金黄色葡萄球菌为敏感。4.葡萄球菌属的种间鉴定:.菌落色素与溶血毒素：金黄色葡萄球菌在血平板上呈金黄色，柠檬色或者淡黄色，而其他葡萄球菌则在血平板上菌落 大多数为白色

6、，也有部分为柠檬色或深黄色。.溶血毒素：金黄色葡萄球菌有a、B、Y、6溶血毒素， 各毒素的区别是对动物红细胞的溶血范围、抗原性及溶血 时的温度等。其中以a溶血毒素为主。而其他葡萄球菌大 多数不产生溶血毒素，只有表葡有极少能产生溶血毒素。.血浆凝固酶实验：用与区别金黄色葡萄球菌（阳性），表 皮葡萄球菌（阴性），腐生葡萄球菌（阴性）。血浆凝固酶 是金葡菌所产生的，有结合凝固酶和游离凝固酶两种。血浆 凝固酶检测有两种方法，为玻片法和试管法，我们一般采用 玻片法。a. 操作方法：挑取少许金黄色葡萄球菌菌落在玻片上与血 浆乳化，结合凝固酶能作用于血浆中的纤维蛋白原，从而在 金黄色葡萄球菌表面发生凝集，所

7、以我们肉眼能看见凝集颗 粒。玻片法主要由结合凝固酶作用产生；游离凝固酶是金黄 色葡萄球菌产生的胞外酶，能与血浆中的血浆凝固反应因子（类似凝血酶的一种物质）作用，形成复合物再使纤维蛋白 原转化成纤维蛋白而发生凝集。试管法主要由游离凝固酶作 用产生。b. 注意事项：菌落不能太多，否则会影响结果观察；凝固 酶阳性要做自凝阴性对照（用生理盐水代替血浆），只有在 阴性对照也不凝集才能认为是真正的阳性，有一部分葡萄球 菌有自凝现象。.新生霉素敏感实验：金黄色葡萄球菌，表皮葡萄球菌对新生霉素纸片（5mg/片）敏感；而腐生葡萄球菌，微球菌则 对之耐药。抑菌环直径16mm即为新生霉素敏感。.甘露醇氧化发酵实验:

8、a. 操作方法：取两支甘露醇微量生化管，在微量管内接种待 检细菌，然后一支加两滴石腊密封，另外一支则不加，放3 7C孵箱内1824h后观察结果。b. 结果观察：微量生化管变黄色为阳性，也就是能利用甘露 醇。若两管都变黄色则说明是发酵型；其中加石蜡管不变色， 没加石蜡管变黄色则为氧化型；如果两管都不变色则说明该 细菌是不利用甘露醇（产碱型）。c. 应用：金黄色葡萄球菌在需氧和厌氧的条件下都能利用甘 露醇（即两管都变黄色）；表皮葡萄球菌需氧部分产酸，厌 氧条件下不利用甘露醇（即没加石蜡管有部分会变黄色，加 石蜡管不变黄色）；腐生葡萄球菌与表皮葡萄球菌类似。三. 微球菌属的种间鉴定微球菌属主要的种有

9、易变微球菌，藤黄微球菌，玫瑰微球菌。鉴定生化见下表微球菌属的种间鉴定菌易变微球菌藤黄微球菌玫瑰微球色素产生黄色黄色粉红色需氧葡萄糖产酸+硝酸盐还原+脲素酶dd+氧化酶+一/+（弱）新生霉素敏感S/RSRd：不定 S：敏感 R：耐药四. 链球菌属1.形态和染色：链球菌的直径为0.5l.Oum,呈成双和链状排列的卵圆形革兰阳性球菌，菌体小于葡萄球菌，无鞭毛， 没有芽胞，但有些菌株会形成荚膜。肺炎链球菌呈矛头状，宽 端相对，尖端向外。2. 根据链球菌在血平板上溶血现象的不同分为三种：甲型（a-）溶血，即菌落周围出现较窄的草绿色溶血环；乙型（B-）溶血，即菌落周围出现较宽的透明溶血环；丙型（Y -）溶

10、血，即菌落周围无溶血环。3. 根据抗原结构（C多糖抗原）的不同可分为A、B、C、D、E 、F、G、H、K、L、M、N、0、P、Q、R、S、T 等 18 个群，对人 类有致病者90%属于A群，偶见其他群链球菌致病。4. 链球菌属的种间鉴定.乙型溶血链球菌的鉴定：a. 对杆菌肽（0.04U/片）（抑菌圈直径N10mm ）敏感: A群链球菌（主要为化脓性链球菌）。b. 对杆菌肽不敏感，胆汁七叶苷实验阴性，但马尿酸 钠水解实验、CAMP实验阳性：B群链球菌（主要为无乳 链球菌）。c. 对杆菌肽不敏感，胆汁七叶苷实验阴性，马尿酸钠 水解实验阴性，CAMP实验阴性：主要为马链球菌、类马 链球菌、兽疫链球菌

11、；对三者的区别实验要加做海藻糖 和山梨醇实验。d. CAMP实验：将能产生B-溶血的金黄色葡萄球菌在 血平板上划一横线接种，再将待鉴定菌于金黄色葡萄球 菌3mm处垂直种一短线，若在有C02条件下培养56小时，或无CO,条件下培养1824小时，在两细菌连接处 2出现一个半月型的加强溶血区即为CAMP实验阳性。.甲型溶血链球菌的鉴定：a. 草绿色链球菌：对杆菌肽敏感，对奥普托欣(Opto chin)不敏感，胆汁溶菌实验阴性，胆汁七叶苷实验阴 性，在高盐中不生长。主要有变异链球菌，轻型链球菌， 血链球菌，唾液链球菌等。b. 肺炎链球菌：菌体呈矛头状，成双排列，钝端相对， 尖端相背，较葡萄球菌，其他链

12、球菌略大；在血平板上 菌落细小、圆形、表面光滑、灰白色、半透明，开始时 菌落呈扁平状，以后中心塌陷，呈脐窝状。与草绿色链 球菌的主要区别是胆汁溶菌实验阳性，对奥普托欣(Op tochin)敏感。奥普托欣(Optochin)含量为5mg/片， 抑菌环18mm为敏感，15mm为不敏感，1518mm应重 复实验。.肠球菌(D群链球菌)的鉴定：溶血不定，主要是a-、Y-溶血；对杆菌肽不敏感，但其 特异性实验是胆汁七叶苷实验阳性;若能在6.5%NaCl的心 浸液肉汤中生长即为D群肠球菌，不能生长为D群非肠球 菌。.链球菌属鉴定的系统生化结果判断a.1%美兰牛乳b. 胆汁七叶苷实验：变黑为阳性。c. PH

13、9.6肉汤实验：变浑浊为能在碱性环境中生长（阳 性）。d. 6.5%NaCl心浸液肉汤：由紫变黄为能在高盐环境中 生长（阳性）。e. 精氨酸双水解酶实验：变红色（对照不变色，仍为 黄色）为性五. 奈瑟氏菌属和布兰汉菌属奈瑟氏菌属主要有脑膜炎奈瑟氏菌和淋病奈瑟氏菌；布兰汉氏 菌属只有卡他布兰汉氏菌。两者系需氧革兰阴性球菌。奈瑟氏菌的生物学特性：革兰阴性球菌，需氧，卵圆形或肾形，无动力，氧化酶及触酶均阳性。培养时对营养 要求高，能在巧克力平板或有丰富营养的血平板上，在51 0%CO2环境中生长。.鉴定过程：a. DNA酶实验阳性为布兰汉氏菌，阴性则为奈瑟氏菌。b. 能在普通血平板上生长的为其他奈瑟

14、氏菌，在巧克力 平板上生长的主要为脑膜炎奈瑟氏菌和淋病奈瑟氏菌。c. 能使麦芽糖氧化分解产酸的是脑膜炎奈瑟氏菌，不利用麦芽糖的是淋病奈瑟氏菌。.几种主要细菌对葡萄糖、麦芽糖、蔗糖的氧化分解产酸结果如下：氧化分解产酸菌种葡萄糖麦芽糖蔗糖淋病奈瑟氏菌+脑膜炎奈瑟氏菌+粘液奈瑟氏菌+卡他布兰汉菌DNA酶实验：a. 方法：将待鉴定细菌点种于含0.2%DNA的DNA琼脂平 板上，培养后用1mmol/LHCl覆盖平板，菌落周围出现透 明环者为阳性。b. 原理：某些细菌能产生DNA酶，可使DNA长链水解成 由几个单核苷酸组成的寡核苷酸链；长链DNA可被酸沉 淀，而水解后形成后的寡核苷酸链则可溶于酸，故在DN

15、A 琼脂平板加盐酸，可在菌落周围形成透明的溶血环。（肠 杆菌科中只有沙雷氏菌和变形杆菌可产生DNA酶，阳性球 菌中只有金葡菌能产生DNA酶。）六. 肠杆菌科肠杆菌科是一大群生物学性状相似的革兰阴性杆菌，其中对人致 病性较强的鼠疫耶尔森菌（现已基本没有流行）和伤寒沙门菌；4类 常引起腹泻和肠道感染的细菌（埃希氏菌、志贺氏菌、沙门氏菌、耶 尔森氏菌）和8种常导致院内感染的细菌（枸橼酸杆菌属、克雷伯菌 属、肠杆菌属、多源菌属、沙雷菌属、变形杆菌属、普罗威登菌属 和摩根菌属）。另外还有很多细菌是肠道的正常菌群，但在一定条件 下也可致病（条件致病菌）。实验过程中对于革兰阴性杆菌首先要做氧化酶实验，阴性为

16、肠杆 菌科细菌；阳性的为非发酵菌（我们实验室还没有简单的系统鉴定方 法，一般要仪器上卡检测）或弧菌科细菌。1. 肠杆菌科的系统生化.KIA试验（克氏双糖铁）组成：乳糖/葡萄糖=10/1 （斜面/高层，其长度最好是 都是2CM）结果判断：斜面或高层变黄色：阳性；不变色（红色）： 阴性高层中出现裂隙：产气阳性高层中出现黑色（FeS）:产HS阳性2.苯丙氨酸脱羧酶试验细菌产生的苯丙氨酸脱羧酶使苯丙氨酸氧化脱羧后生成 苯丙酮酸，再与10%的FeCl3试剂产成深绿色反应。（变 形杆菌属、普罗威登菌属和摩根菌属为阳性，其他为阴 性）.枸橼酸盐试验（碳源利用实验）在枸橼酸盐培养基中细菌能利用的碳源只有枸橼酸

17、盐，分 解后生成碳酸钠，使培养基变碱性，pH指示剂漠麝香草 酚蓝由淡绿色变为深兰色，即为枸橼酸盐试验阳性。（埃 希氏菌属，志贺氏菌属，爱德华菌属为阴性，其他为阳性） 注意：接种时不能被糖，蛋白胨污染，要单独接种）.甲基红（MR）试验细菌分解葡萄糖产生丙酮酸，丙酮酸进一步分解为甲酸、 乙酸、乳酸和琥珀酸等，使培养基的pH下降至4.5以下 时，加入甲基红指示剂由桔黄色变桔红色为弱阳性；变红 色为阳性。培养基成分：葡萄糖蛋白胨水试剂：甲基红0.1g，酒精300ml，水200ml主要用于大肠埃希菌（+）和产气肠杆菌（一）的鉴别； 常与V-P实验联合使用，一般情况下两者结果正好相反， 但也有例外如奇变两

18、者同为阳性。.MIU （动力一靛基质一尿素）试验 .动力：在半固体培养基中穿刺接种细菌培养后，若穿刺线周围有细菌扩散生长，则为动力（+）;清晰则 为动力（一）。 .靛基质试验（吲噪试验）：某些细菌有色氨酸酶，能分解培养基中的色氨酸生成吲噪。吲噪再与试剂对位 二氨基苯甲醛作用形成玫瑰吲噪而呈红色。 .尿素试验：某些细菌能产生尿素酶，分解尿素产生大量的氨，使培养基变碱，再使培养基中的指示剂（0.4%酚红）变红色即为阳性。.硝酸盐还原试验NONO（大肠）NO_NH广NOffN2 （沙雷氏菌属）试剂甲：对氨基苯磺酸试剂乙：a-萘胺观察结果时甲液和乙液要等量加入，立即或10min内出现 红色为阳性。若不

19、变色，则要加入锌粉：变红色，说明 硝还试验为真阴性仍不变色，说明硝还试验真阳性，但 原先还原产物不是NO。阴性结果出现时有三种可能：细菌不能还原硝酸盐亚 硝酸盐继续分解生成氨或氮培养基不适合细菌生长 肠杆菌科细菌均能还原硝酸盐为亚硝酸盐。（7）.氨基酸脱羧试验细菌产生脱羧酶分解氨基酸使其脱羧生成胺和CO2,虽 然各种细菌所产生的脱羧酶不一定相同，但最后都能生 成胺（赖氨酸f尸胺，鸟氨酸f腐胺，精氨酸f精胺） 和CO2。然后胺能使培养基变碱性，通过指示剂（漠甲 酚紫）由黄变紫即为阳性。对照管（无氨基酸）为黄色。 注意：微量管接种好后要加石蜡，使培养基造成厌氧 环境。（生成的胺更稳定，还能诱导氨基

20、酸脱羧酶的产 生）对照管如果不显黄色，则结果不能判断。应用：除伤寒沙门氏菌，鸡沙门氏菌外，其他沙门氏菌 鸟AA，赖AA均为阳性；除宋氏和鲍氏志贺菌外其他志 贺菌也菌为阳性。.葡萄糖酸盐试验微量管在培养1824h后，加班氏试剂，水浴煮沸10min，由兰色变黄绿色到砖红色即为阳性，不变为阴性。1.肠杆菌的鉴定流程.根据苯丙氨酸脱羧酶实验：（+）:变形杆菌属，普罗威登斯菌属，摩根氏菌属（）：埃希氏菌属，志贺氏菌属，沙门氏菌属，枸橼酸杆菌属，爱德华菌属；克雷伯菌属，肠杆菌属， 沙雷氏菌属，哈夫尼亚菌属。.苯丙氨酸脱羧酶实验阴性，加做葡萄糖酸盐实验（+ ）:克雷伯菌属，肠杆菌属，沙雷氏菌属，哈夫尼亚 菌

21、属a. 动力（一）：克雷伯菌属，属内种的鉴定主要根据吲噪试验（肺克吲噪实验阴性，三个亚种鉴别 试验IMViC:肺炎+，臭鼻I，鼻硬结-+）b. 动力（+ ），DNA酶（ + ）：沙雷氏菌属 动力（+ ），DNA酶（一），枸橼酸盐（ + ）：肠 杆菌属（主要是阴沟肠杆菌和产气肠杆菌，前者赖 氨酸阴性，而后中为阳性）动力（+ ），DNA酶（一），枸橼酸盐（一）：哈 夫尼亚菌属（一）：加做IMViC （靛基质-甲基红- VP-枸橼酸盐）试验a. IMViC （+）:大肠埃希菌（HS）或2爱德华菌属（HS+）。 2b. IMViC （-/+）：枸橼酸杆菌属.苯丙氨酸脱羧酶实验阳性，根据产H2S可分（+

22、 ）:变形杆菌属属内主要鉴定试验如下普变奇变产粘变潘尼氏尿素酶+鸟氨酸一+一一靛基质+一一一麦芽糖一一+木糖+一+（）:普罗威登氏菌属，摩根氏菌属普罗威登氏菌属：鸟氨酸：一；枸橼酸盐：+ （属 内鉴定尿素酶及一些碳水化合物的产酸试验， 如甘露醇、阿拉伯糖、海藻糖等）摩根氏菌属：鸟氨酸：+;枸橼酸盐：一（只有 一个种：摩氏摩根氏菌）.志贺氏菌属和沙门氏菌属这两种菌属在肠道选择性培养基（SS、麦康凯）形成 不发酵乳糖的透明或半透明的无色菌落，但一些沙门氏能 产H S就会形成中心黑色的菌落，鉴定时在选择性培养基2上挑选可疑菌落进行鉴定。a.志贺氏菌属主要系统生化：KIA： K/A （只有福氏6型能产

23、气），HS （ ） ； MIU： +/；2苯丙：一；枸橼酸盐：一。报告结果时要根据其血清学的结果鉴定到种，即A群 （痢疾志贺氏菌）、B群（福氏志贺氏菌）、C群（鲍氏 志贺氏菌）、D群（宋氏志贺氏菌）；我国主要以B群和 D群为主。b.沙门氏菌属主要系统生化：KIA： K/AG, HS （+/）； MIU： 一2一;苯丙：一；枸橼酸盐：一。伤寒沙门氏菌的抗原结构：菌体抗原（O抗原），鞭毛 抗原（H抗原），包膜抗原（主要是Vi抗原）根据系统生化鉴定到沙门氏菌属后，在根据其抗原结构的 特点，用血清学凝集分到种即可报告结果。血清凝集步骤如下：A-F 多价 O （ + ）：O2, Ha （ + ）： A群

24、（甲型副伤寒沙门氏菌）O4，Hb（ + ）：B群（乙型副伤寒沙门氏菌）O6 7，Hc，Vi（ + ）：C群（丙型副伤寒沙门氏菌）O9，Hd，Vi（ + ）： D群（伤寒沙门氏菌）O ，Heh （ + ）： E 群 3、10O11，Hi（ + ）：F 群A-F多价O （ ），做Vi血清因子凝集：（ + ）浓菌液 沸水煮沸30min，再用A-F多价O血清定群；（一）继续 以A-F以外的多价O血清凝集分型。血清凝集注意：确定O群后，一定要用H因子再做凝集;最终结果要以凝到H相后才能报告。七.非发酵革兰阴性杆菌非发酵革兰阴性杆菌是指一群不利用葡萄糖或仅以氧化形式利用葡萄糖、需氧或兼性厌氧、无芽胞的革兰

25、阴性杆菌。氧化酶试验 一般阳性，除不动杆菌属和嗜麦芽假单胞菌外。非发酵菌按下列试验进行初步分属菌属氧化酶O-F试验动力MaCC生长情况 触酶假单胞菌属+O/-+ / 生长+无色杆菌属+O/-+ / 生长+不动杆菌属O/-生长+产碱杆菌属+生长+摩拉菌属+不生长+金氏菌属+F （弱）不定黄杆菌属 + F （弱） 一不生长下面主要讲一下铜绿假单胞菌：在血平板上形成的菌落大而扁平、 湿润、有金属光泽，有生姜味的灰绿色或兰绿色的菌落，并有明显 的溶血环。常有色素产生（绿脓素，青脓素，红脓素，黑脓素等）， 在MH平板上更加明显。铜绿假单胞菌的最低鉴定标准：动力+氧化酶+枸橼酸盐+ 氧化分解GLU，木糖不

26、利用麦芽糖赖、鸟氨酸脱羧酶试验一 精氨酸双水解酶试验+H S一。2八.棒状杆菌属棒状杆菌属是一群革兰阳性杆菌。菌体大小长短不一，常一端 或两端膨大呈棍棒状。大多数存在于水和土壤中，其中有的是人和 动物粘膜上的正常菌群，若是从无菌部位分离到棒状杆菌，应予以 鉴定（如宫颈拭子）。在血平板上能生长，但生长不良好，菌落细小，湿润。鉴定：根据触酶和有无溶血，可分：.HO+，无溶血：白喉、假白喉、溃疡、干燥、假结核、 2 2马棒、牛棒；(2). HO一,有溶血：溶血棒、化脓棒、阴道棒 2 2.加做葡萄糖，麦芽糖，蔗糖产酸试验，结合和标本 类型，基本上可以鉴定到是哪一种棒状杆菌。药敏试验方法：一、K-B 法

27、：1、从孵育了16-24小时的琼脂平板上(血平板)，挑出单个菌落，直 接用生理盐水制成0.5麦氏单位。2、在15分钟内，用无菌棉拭子醮取调好的菌液，在液面上方管壁处 旋转并用力挤压几次，以从中挤出过多的菌液。3、用棉拭子在无菌的M-H培养基表面化线接种，再重复操作两次， 每次将平板转动60度，每次接种都应保证接种物均匀分布，最后用 棉拭子涂抹平板的边缘。4、将确定好的药敏纸片分贴到平板表面。每个纸片都应压一下，以 保证与平板表面完全接触。每个纸片中心间距24mm。纸片一旦与平 板接触，不应再移动。5、贴完纸片后，应在15分钟内放入35度孵箱。嗜血杆菌属，链球 菌属放入3%-5%的CO2烛缸。6

28、、孵育24小时以后，测量各药敏纸片抑菌圈直径，与NCCLS 手册比 较，作出结果判断。说明：细菌药敏结果的判断以NCCLS为标准，所以药敏试验的每一步 都应严格按照NCCLS操作，否则将失去意义。链球菌、奈瑟菌属、流 感嗜血杆菌、除铜绿假单孢菌和不动杆菌外的假单孢菌属不用K-B法.肺炎链球菌胶乳凝集测定法1、在一干净玻片上分别滴两滴生理盐水。2、从冰箱取出鉴定试剂（Slidex pneumo-kit）于室温。3、在其中一滴生理盐水上滴加R1试剂，在另外一滴上滴加R2试剂，用搅拌棒混匀。4、轻轻晃动玻片2分钟，观察结果。5、2分钟内，如R1出现凝集为阳性；如R1、R2均未出现凝集为阴性。注：R3

29、为阳性对照。二、药敏纸片的选择1、革兰阴性杆菌（肠杆菌科）头孢噻肟（CTX0）头孢唑林（CZ）头孢他定（CAZ）氨苄西林（AM）哌拉西林（PIP）阿米卡星（AN）头孢噻吩（CF）环丙沙星（CIP）头孢他定/克拉维酸（CAZ/CA）哌拉西林/三唑巴坦（PIP/TZ）羧苄青霉素（CB）亚安培南 头孢匹肟（FEP）头孢克罗（CEC）头孢呋辛（CXM）头孢噻肟/棒酸（CTX/CA）庆大霉素（GM）奥格门丁（AMX/CA）2、铜绿假单孢菌/不动杆菌妥布霉素（TM）阿米卡星（AN）安曲南（AZT）头孢哌酮（CFP）哌拉西林（PIP）头孢匹肟头孢噻肟（CTX）环内沙星（CIP）头孢他定（CAZ）左旋氧氟沙星

30、（OFL）亚安培南哌拉西林/三唑巴坦3、金黄色葡萄球菌苯唑西林（OX）青霉素G（P）头孢唑林（CZ）阿米卡星（AN）红霉素（E） 头孢噻肟（CTX）环丙沙星（CIP）头孢噻吩（CF）万古霉素奥格门丁（AMX/CA）哌拉西林/三唑巴坦4、肠球菌氨苄西林（AM）万古霉素环丙沙星（CIP）庆大霉素（GM）红霉素（E）氧氟沙星（OFL）5、除肺炎链球菌外链球菌氨苄西林（AM）头孢噻肟（CTX）万古霉素红霉素（E）氧氟沙星（OFL）克林霉素（CM）肺炎克雷伯菌产酸克雷伯菌和大肠杆菌ESBLs的检测MH培养基上贴头孢他定，头孢他定/克拉维酸，头孢噻肟/棒酸，安 曲南。如头孢他定的抑菌圈22mm，安曲南27

31、mm，头孢噻肟27mm，意味可 能有ESBLS产生。如头孢他定/克拉维酸与头孢他定，头孢噻肟/棒酸与头孢噻肟的差值N5mm，则确证ESBLS产生。耐药机制。一代头孢对普通变形杆菌、枸橼酸杆菌、肠球菌、假单孢菌属、沙雷 氏菌属、拟杆菌属无效。第二代头孢对假单孢菌属、不动杆菌属、沙 雷氏菌属、肠球菌无效；肠球菌对头孢类天然耐药。氨基糖甙类抗生 素阿米卡星与庆大霉素不完全交叉耐药。红霉素类、四环素类等抗生 素内部有相互交叉耐药。金黄色葡萄球菌耐万古霉素、无乳链球菌耐青霉素和氨苄青霉素、无 乳链球菌和D群链球菌耐万古霉素和替拉考宁为不可能的表型。洋葱伯克霍德菌对氨基糖甙类、亚安培南天然耐药。除表皮葡萄

32、球菌和溶血葡萄球菌外，替拉考宁耐药的凝固酶阴性的葡 萄球菌不常见。金黄色葡萄球菌对复方新诺明耐药为罕见表型。氨苄青霉素对非发酵类不宜应用。对于葡萄球菌，苯唑西林耐药，青霉素敏感是不可能的。NCCLS关于细菌药敏实验的说明总评论：1、头孢噻吩可以代表头孢噻吩、头孢匹林、头孢拉定、头孢氨苄、 头孢克洛、和头孢羟氨苄。但是，头孢唑林、头孢呋辛、头孢泊肟、 头孢丙烯应单独测试，因为某些对这些药物敏感的菌株对头孢噻吩是 耐药的。2、利福平不能单独用于化疗。肠杆菌科1、对于沙门菌属和志贺菌属只有氨苄西林、喹诺酮、和甲氧苄啶/ 磺胺甲恶唑可用于常规试验与报告。初此之外，对于沙门菌属和志贺 菌属的肠道外分离株

33、，应测试并报告氯霉素和一种三代头孢菌素。2、克雷伯菌属和大肠艾希菌的产ESBLS株对青霉素、头孢菌素类或 安曲南临床治疗可显耐药性，尽管在体外药敏试验对其中某些抗生素 敏感。对于所有产ESBLs株，应报告为耐所有青霉素类、头孢菌素及 安曲南。3、随着3代头孢菌素的治疗，肠杆菌属、枸橼酸菌属和沙雷菌属可 发展其耐药性。最易敏感的菌株在开始治疗3-4天就可变为耐药，因 此要反复测试这些菌株。葡萄球菌1、青霉素敏感的葡萄球菌对FDA批准的用于葡萄球菌感染的其他青 霉素类、头孢菌素和碳青烯类也是敏感的。青霉素耐药而苯唑西林敏 感的菌株对B-内酰胺酶不稳定的青霉素是耐药的，但对其他B-内 酰胺酶稳定的青

34、霉素、B-内酰胺酶抑制剂复合药、相关的头孢类和 卡巴陪南是敏感的。苯唑西林耐药的葡萄球菌对现在可用的所有B- 内酰胺类抗生素是耐药的。因此仅测试青霉素和苯唑西林就可以推知 一大批B-内酰胺类抗生素的敏感性与耐药性，不必常规测试其他青 霉素类、B-内酰胺类抑制剂复合药、头孢类和卡巴陪南类。2、绝大多数的MRS对多种抗生素耐药。包括B-内酰胺类、氨基糖 甙类、大环内酯类、克林霉素和四环素。观察到多重耐药应该是对甲 氧西林可能耐药的线索。3、长期应用喹诺酮类治疗的过程中葡萄球菌可发展其耐药性，因此 应重复测试耐药性。肠球菌1、对于肠球菌属，头孢菌素、氨基糖甙类（除了筛选高水平耐药性）、 克林霉素和甲

35、氧苄啶/磺胺甲恶唑在体外可能有活性，但临床无效， 因此不能报告细菌对这些药物敏感。2、青霉素敏感性可以用于不产B-内酰胺酶的肠球菌对氨苄西林、 阿莫西林、酰基氨苄西林、氨苄西林/舒巴坦、阿莫西林/克拉维酸、 哌拉西林以及哌拉西林/三唑巴坦的敏感性3、氨苄西林是氨苄西林和阿莫西林类的代表药。氨苄西林的结果可 用来判断不产B -内酰胺酶的肠球菌对阿莫西林/克拉维酸和氨苄西 林/舒巴坦的敏感性。4、青霉素的结果可预测不产B-内酰胺酶的肠球菌对氨苄西林、阿 莫西林、氨苄西林/舒巴坦、阿莫西林/克拉维酸、哌拉西林/三唑巴 坦的敏感性。5、对于血和脑脊液分离株需用头孢硝噻吩B-内酰胺酶试验，阳性 提示对青

36、霉素耐药，同时对酰胺基、羧基和脲基青霉素耐药。细菌鉴别要点：1、革兰阳性球菌所有革兰阳性球菌第一步为触酶试验。通常触酶阳性为葡萄球菌和微球菌，阴性为链球菌科。但不排除 例外，气球菌为弱阳性。粪肠球菌偶有阳性。操作触酶试验应尽量避 免用铂金取菌环（针）在H2O2上涂菌，而应先涂菌，在滴H2O2，步骤 不能颠倒。因为铂金可以和H2O2产生假阳性反应。H2O2必须新鲜，若 放置过久或暴露于光线下容易分解，必须保存于4C冰箱。实验所用 菌须大量，不可挑到琼脂，会产生假阳性。对触酶阳性的革兰阳性球菌，应继续做玻片法血浆凝固酶试验， 此为检出葡萄球菌，如阳性一般为金黄色葡萄球菌；如阴性应做试管 法凝固酶实

37、验确证，玻片法仅为筛选实验。血浆凝固酶实验用血浆须 用兔或猪血浆，新鲜血浆不稳定，可能发生自我凝集或形成颗粒产生 浑浊或产生沉淀而导致判度错误；不可使用人血浆，其含有抑制物质 回干扰实验结果。触酶阴性为链球菌科，根据菌落溶血进行下一步鉴定：a溶血：草绿色链球菌；肺炎链球菌；肠球菌b溶血：A群链球菌；B群链球菌，部分D群链球菌肠球菌也有不溶血菌落，不能根据溶血判断肠球菌。链球菌主要实验： 胆汁七叶苷，七叶苷，菊糖，CAMP，杆菌肽，高盐，奥朴托辛，胆盐 溶解。肠球菌为致病菌，且肠球菌与非肠球菌耐药机制不同，应进行鉴 别，肠球菌分为粪肠球菌和屎肠球菌；非肠球菌分为牛链球菌和马链 球菌。肠球菌对青霉

38、素耐药，非肠球菌对青霉素敏感。肠球菌的药敏 注意高耐氨基糖甙的细菌，如高耐氨基糖甙则意味氨基糖甙与b内 酰胺类药物合用无协同作用。肺炎链球菌与草绿色链球菌鉴别：肺炎链球菌奥朴托辛、菊糖、胆盐 溶解实验皆为阳性。但这3个实验都非特异，需联合应用方为最佳。 肺炎链球菌的青霉素药敏实验应注意，当青霉素（K-B法）的抑菌圈 直径大于或等于19mm时为敏感，当小于19mm时不能确定是否中敏或 耐药，应做MIC稀释确证。2、革兰阴性杆菌包括肠杆菌科、非发酵菌和弧菌科。第一步实验为氧化酶实验。氧化酶阴性为肠杆菌科；阳性为非发酵菌和弧菌科。肠杆菌科包括大肠杆菌、变形杆菌、普罗菲登斯菌及摩根菌属、克雷 伯菌属、

39、肠杆菌属、多源菌属、沙雷菌属、耶尔森菌属。非发酵菌包 括铜绿假单孢菌、黄单孢菌、不动杆菌等。氧化酶实验注意事项：需用铜绿假单孢菌做阳性对照。60秒内判读结果有效，而以10秒内最佳。不要用含微量铁的取 菌环或针，可用棉棒替代。革兰阴性杆菌的鉴定以API系列为国标，其他生化管仅为常规鉴定。标准化的微生物采集方法（一）基本原则1、发现感染应及时采集微生物标本作病原学检查，二、三级医院微生物标本送检率不应低于70%。2、尽量在抗菌药物使用之前采集标本。3、标本采集时应严格无菌操作，减少或避免机体正常菌群及其它杂 菌污染。4、标本采集后应立即送至细菌室。床旁接种可提高病原菌检出率。5、以棉拭子采集的标本

40、如咽拭子、肛拭或伤口拭子，宜插入运送培 养基送检。6、送检标本应注明来源和检验目的，使细菌室能正确选用相应的培养基和适宜的培养环境。（二）血液与骨髓的送检方法1、通常采血部位为肘静脉。疑似细菌性心内膜炎时，以肘动脉或股 动脉采血为宜，切忌在静滴抗菌药物的静脉处采取血标本。2、采血部位的局部皮肤应严格消毒。将采集的血液注入血培养瓶前， 应更换针头或过火消毒针头。3、每次采血量成人510ml，婴幼儿12ml,培养基与血液之比以 10： 1为宜，以稀释血液中的抗生素。4、怀疑菌血症因尽早采血，体温上升阶段采血可提高阳性率，但要 防止因等待而延误时机。对已用抗菌药物而不能停药者，可在下次用 药前采血。

41、5、对疑为细菌性骨髓炎或伤寒病人，在病灶或骼前（后）上棘处严 格消毒后抽取骨髓1ml作细菌培养。（三）尿液的送检方法1、中段尿：女性采样前应先用肥皂水或0.1%高锰酸钾溶液冲洗外阴 部及尿道口；男性须翻转包皮冲洗，用0.1%新洁尔灭消毒尿道口， 灭菌纱布擦干后，收集标本。2、导尿管导尿采样可减少污染。对留置导尿者，可用碘酒消毒尿道 口处的导尿管壁，用联空针筒的细针斜穿管壁抽吸尿液；或拔去闭式 引流的集尿袋，弃取导尿管前段尿液，留无污染的膀胱内尿液数毫升 送检。不可从集尿袋的下端管口留取标本。3、送检标本以晨起第一次尿为宜。4、室温下尿标本担搁稍久可导致尿内细菌浓度明显增加而影响病原 菌与污染菌

42、的区分。不能立即送检者，可暂存4C冰箱。（四）痰标本的送检方法1、咳痰：清水反复漱口后用力咳痰，从呼吸道深部咳出新鲜痰液于 无菌容器送检。痰量极少者可用45C10%氯化钠溶液雾化吸入导痰。2、对咳嗽乏力或昏迷病人，可用吸痰管经鼻腔或口抵达气管腔内 吸 引痰液。用纤维支气管镜可直接在病灶部位采集高浓度的感染病原 菌，但不能完全避免咽喉部正常菌群感染。3、双侧肺部感染伴人工气道如气管切开或气管插管患者，可用吸痰 管经人工气道估插至叶支气管水平吸引痰液。4、痰标本不能及时送检者，可暂存4C冰箱。室温下担搁数小时定 植于口咽部的非致病菌呈过度生长而肺炎链球菌、葡萄球菌和流感嗜 血杆菌检出率明显降低（五

43、）手术创口、烧伤创面于脓液1、无菌生理盐水擦洗病灶表面后，用棉拭子采取病灶深部的脓液和 分秘物，置运送培养基内送检。2、对未溃疡的脓肿宜用碘酒、酒精消毒皮肤后，以无菌注射器抽取 脓液送检；也可于切开脓肿时用无菌棉拭子采样。3、采样前病灶局部应避免用抗菌药物或消毒剂。（六）粪便的送检方法1、排便后，挑取有脓血、黏液部分的粪便23g （液状粪便则取絮 状物），盛于蜡纸袋内送检。2、对不易获取粪便者或婴幼儿，可用肛拭采集。将拭子前端用无菌 甘油水湿润。然后插入肛门约45cm （幼儿约23cm）处，轻轻旋 转擦取直肠表面黏液后退出，置运送普及内送检。（七）咽拭、口腔拭子的送检1、病人清水漱口后，由检查

44、者将其舌外拉时悬幽垂尽可能向外牵引，棉拭子越过舌根到咽后壁或悬幽垂的后侧，反复擦拭数次，插入 运送培养基。棉拭子应避免触及舌、口腔黏膜和唾液。对化脓性扁桃体炎或口腔念珠菌病，用棉拭临床标本的处理1、血标本1.1常见细菌革兰阳性菌：肺炎链球菌、金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、溶血 性 链球菌、粪肠球菌、类白喉棒状杆菌、产单核李斯特菌等。革兰阴性菌：脑膜炎奈瑟菌、卡他布兰汉菌、伤寒沙门菌、流感嗜血 杆菌、大肠艾希菌、变形杆菌、产汽肠杆菌、铜绿假单孢菌、肺炎克 雷伯菌等。1.2临床意义血液培养应用于伤寒、副伤寒、化脓性细菌和其他革兰阴性杆菌引起 的败血症的诊断。目前引起败血症的细菌多为金黄色葡萄球菌和

45、大肠埃希菌。疥、痈和脓肿继发的败血症主要是金黄色葡萄球菌和溶血性链球菌引 起。尿道、胆、胃肠黏膜损伤引起的败血症以大肠埃希菌多见，其次为变 形杆菌、产汽肠杆菌、葡萄球菌。急性细菌性心内膜炎以金黄色葡萄球菌、溶血性链球菌、脑膜炎奈瑟 菌常见；亚急性心内膜炎以草绿色链球菌多见，偶见肠球菌；化脓性 心包炎以金黄色葡萄球菌、溶血性链球菌、肺炎链球菌多见。血液病、肝硬化引起的败血症金黄色葡萄球菌和铜绿假单孢菌为主。 弥漫性血管内凝血以革兰阴性杆菌为主。烧伤后败血症以铜绿假单孢菌为主。3、痰标本常见细菌：肺炎链球菌、化脓性链球菌、金黄色葡萄球菌、结核分 枝杆菌；脑膜炎奈瑟菌、卡他布兰汉菌、肺炎克雷伯菌、大

46、肠艾希菌、 铜绿假单孢菌、沙雷菌、流感嗜血杆菌。痰标本:须接种2个血平板，一个放普通孵箱，另一个放CO孵箱.痰标 2本接种于血平板、麦康凯平板、巧克力平板。巧克力平板是用来筛选 流感嗜血杆菌。肺炎链球菌和流感嗜血杆菌的检出率是衡量一个细菌 室水平的重要依据，因此对于包括以上两种菌在内的苛养菌的鉴定应 引起重视。痰标本接种时，第一区划完线后，接种环必须过火消毒， 否则将达不到分区的效果。痰标本建议接种2个血平板、一个巧克力平板、一个麦康凯平板。痰 标本于咽标本的处理基本相同。4、尿标本常见细菌：大肠艾希菌、葡萄球菌、变形杆菌。注意事项：尿标本不能离心，离心将使污染菌也集中于沉淀部分，导 致错误结

47、果。一般而言，菌落大于105/ml代表真正感染，103/ml以 下表示污染，104105/ml为怀疑污染，如病人的排尿速度太快或接 受药物治疗或尿的pH小于5.0，比重小于1.003时，细菌的数目可 能降低。因此病人若已服用抗生素，104/ml菌落即需进行鉴定和抗 生素药敏试验。加强微生物实验室与临床科室的联系、密切合作，确保标本的质量：微生物学检验的标本大多数都是由临床科室有关人员或患者 留取的，而留取的标本的质量是否符合要求就是一个非常重要的问 题，因此要与临床合作，确保标本的质量，主要有以下几个方面：1、血液（骨髓）标本的留取1）应在给患者使用抗菌药物之前留取标本。2）应在患者发热初起或

48、发热高峰时留取。3）应尽量留取两次标本。4）留取标本时应尽量避免污染，如有可能污染时应注明。5）如考虑有厌氧菌感染时应同时作需氧菌及厌氧菌培养。6）如已给予患者抗菌药物治疗则应使用树脂培养瓶并在给药之 前留取。7）儿童患者则应使用儿童培养瓶。8）如考虑有L型菌感染的可能则应使用L型培养瓶。2、下呼吸道分泌物标本的留取1）清晨留取。2）留取前用清水漱口三次。3）嘱患者用力咳出。4）如患者做纤维支气管镜检查则可同时抽取分泌物。5）昏迷患者可作气管穿刺吸取。3、尿液标本的留取1）留取清晨第一次尿液。2）留取中段尿，女性患者则应清洗会阴部后留取中段尿。3）必要时可导尿留取标本。4）不应从留置导尿管中抽

49、取尿标本。5）必要时可做耻骨联合上膀胱穿刺抽取尿液标本。4、化脓性感染及外伤标本的留取1）用无菌棉拭子醮取分泌物，如分泌物较多可先用灭菌生理盐 水冲洗后留取，标本留取后应将拭子插入运送培养基中。2）如为慢性感染可取感染坏死组织与健康组织之间的少许组织 作为培养标本。3）如有局限性脓肿可抽吸脓液。4）如考虑有厌氧菌感染的可能，应进行床旁接种或将抽取脓液 的注射器内空气排除，针尖插入灭菌胶塞以隔离空气。5、粪便标本的留取1）留取新鲜粪便，特别是异常部分。2）应用抗菌药物之前录取。6、穿刺液标本的留取1）应用抗菌药物之前录取。2）如考虑有厌氧菌感染的可能，可同时进行床旁接种或将抽取 脓液的注射器内空

50、气排尽，针尖插入灭菌胶塞。3）为防止穿刺液凝固可用抗凝管盛放穿刺液。7、当某些标本的留取遇到困难或出现问题时，临床科室和实验室应 密切配合，及时处理。二、为确保病原微生物的检出，应尽量减少中间环节，标本须立即送 检，应力争在标本留取后10 20分钟送到实验室，否则有些微生 物将会死亡而影响检出，如脑膜炎奈瑟菌和肺炎链球菌等；有的微生 物在尿液中又可快速生长而导致误诊，如尿液标本在室温下停放两小 时，即使细菌计数达到10万/ml，亦无临床意义，而淋病奈瑟菌又 非常容易死亡。三、标本送达实验室后应及时进行检查和接种，如不能及时检查则应 采取适当措施，以保障标本中的微生物的存活：1、尿液、下呼吸道分

51、泌物、脓性分泌物等标本可放置4C冰箱暂时保存。2、如怀疑脑膜炎奈瑟菌、肺炎链球菌、嗜血杆菌或淋菌感染时标本（如脑脊液）则应于室温保存。四、采取有力措施，为临床合理使用抗菌药物提供依据，减少和控制 细菌耐药性的产生和传播。1、定期（一个季度）向临床科室报告从临床各种标本分离的细菌种 类及对抗菌药物的敏感性结果，供临床医生初步选择抗菌药物参考。2、分段报告微生物培养结果，以便临床医师及时用药。1）实验室工作人员接到标本后，要立即进行涂片染色检查，并 将结果尽快报告（如电话）临床科室。对不符合质量要求的标本，应 及时与临床科室联系重新留取标本（如下呼吸道标本）。2）在微生物培养出来之后立即进行涂片染

52、色检查，并将检查结 果尽快（如电话）报告临床科室。3）对微生物鉴定并做抗菌药物敏感性试验，立即向临床科室报 告结果（口头和书面报告）。4）做好报告回访工作，以了解实验室诊断结果和临床诊断的符 合情况，从而找出问题、改进工作。五、树立防病观念、采取有力措施预防和控制医院感染。1、医院感染的对象除包括住院患者外，也包括医、护、技人员，其 中实验室工作人员试一重要方面，尤其是接收来自患者的各种各样的 标本，因而无形中也增多了感染的机会，所以要树立预防和控制感染 的概念。2、坚持无菌操作，最好使用洁净操作台。3、作好污物的处理。1）废弃的标本和培养物要无害化处理（焚烧或高压灭菌）。2）一次性使用物品用

53、后要毁型和无害化处理。4、实验室工作人员应做好个人防护：1）按照操作规程进行工作。2）做好手的消毒工作。5、建立严格的操作规程。6、适当采用疫苗预防注射（如乙肝疫苗）。7、定期检查身体。六、不断加强和充实实验室工作人员队伍、努力提高实验室工作人员 的素质，以适应医疗改革的需要。1、面对当前医疗改革形式要有紧迫感，搞好本职工作，一切为病人。2、建立工作人员合理梯队。3、建立或逐步建立考核制度（晋升、上岗）。4、加强继续教育，不断提高业务水平。5、加强预防和控制医院感染的理论学习，做好预防和控制医院感染 的有关工作：1）参加医院内医院感染管理委员会，完成有关医院感染预防及控制 方面的工作。2）参加医院药事委员会参与有关工作，特别是抗菌药物的合理使用。3）加强消毒灭菌理论的学习和实践。七、不断加强实验室管理和基本建设。1、建立严格的规章制度并在实践工作中不断的充实和改进。2、建立严谨的质量控制体系（室间、室内）并严格执行。3、在条件允许的情况下不断更新和完善实验室设备。4、建立仪器档案及仪器管理制度。5、不断开展新的实验项目，以满足临床需求。6、建立或逐步建立网络化系统：1）实验室内部。2）实验室内部与医院有关科室。3）实验室与社会（院外有关单位）。