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1、测序引物设计方法引见及本卷须知一、PCR引物设计方法：1.引物最好在模板cDNA的保守区内设计。DNA序列的保守区是经过物种间类似序列的比较确定的。在NCBI上搜索不同物种的同一基因，经过序列分析软件比如DNAman比对Alignment，各基因一样的序列就是该基因的保守区。2.引物长度普通在1530碱基之间。引物长度primerlength常用的是18-27bp，但不应大于38，由于过长会导致其延伸温度大于74，不适于TaqDNA聚合酶进展反响。3.引物GC含量在40%60%之间，Tm值最好接近72。GC含量composition过高或过低都不利于引发反响。上下游引物的GC含量不能相差太大。
2、另外，上下游引物的Tm值meltingtemperature是寡核苷酸的解链温度，即在一定盐浓度条件下，50%寡核苷酸双链解链的温度。有效启动温度，普通高于Tm值510。假设按公式Tm=4G+C+2A+T估计引物的Tm值，那么有效引物的Tm为5580，其Tm值最好接近72以使复性条件最正确。4.引物3端要避开密码子的第3位。如扩增编码区域，引物3端不要终止于密码子的第3位，因密码子的第3位易发生简并，会影响扩增的特异性与效率。5.引物3端不能选择A，最好选择T。引物3端错配时，不同碱基引发效率存在着很大的差别，当末位的碱基为A时，即使在错配的情况下，也能有引发链的合成，而当末位链为T时，错配的
3、引发效率大大降低，G和C错配的引发效率介于A、T之间，所以3端最好选择T。6.碱基要随机分布。引物序列在模板内该当没有类似性较高，尤其是3端类似性较高的序列，否那么容易导致错误引发Falsepriming。降低引物与模板类似性的一种方法是，引物中四种碱基的分布最好是随机的，不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在。尤其3端不应超越3个延续的G或C，因这样会使引物在GC富集序列区错误引发。7.引物本身及引物之间不应存在互补序列。引物本身不应存在互补序列，否那么引物本身会折叠成发夹构造Hairpin使引物本身复性。这种二级构造会因空间位阻而影响引物与模板的复性结合。引物本身不能有延续4个碱基的互补。两引物之间也
4、不应具有互补性，尤其应防止3端的互补重叠以防止引物二聚体Dimer与Crossdimer的构成。引物之间不能有延续4个碱基的互补。引物二聚体及发夹构造假设不可防止的话，应尽量使其G值不要过高应小于4.5kcal/mol。否那么易导致产生引物二聚体带，并且降低引物有效浓度而使PCR反响不能正常进展。8.引物5 端和中间G值应该相对较高，而3 端G值较低。G值是指DNA双链构成所需的自在能，它反映了双链构造内部碱基对的相对稳定性，G值越大，那么双链越稳定。应中选用5端和中间G值相对较高，而3端G值较低绝对值不超越9的引物。引物3端的G值过高，容易在错配位点构成双链构造并引发DNA聚合反响。不同位置
5、的G值可以用Oligo6软件进展分析 9.引物的5 端可以修饰，而3 端不可修饰。引物的5端决议着PCR产物的长度，它对扩增特异性影响不大。因此，可以被修饰而不影响扩增的特异性。引物5 端修饰包括：加酶切位点；标志生物素、荧光、地高辛、Eu3+等；引入蛋白质结合DNA序列；引入点突变、插入突变、缺失突变序列；引入启动子序列等。引物的延伸是从3端开场的，不能进展任何修饰。3端也不能有构成任何二级构造能够。10.扩增产物的单链不能构成二级构造。某些引物无效的主要缘由是扩增产物单链二级构造的影响，选择扩增片段时最好避开二级构造区域。用有关软件比如RNAstructure可以预测估计mRNA的稳定二级
6、构造，有助于选择模板。实验阐明，待扩区域自在能G小于58.6lkJ/mol时，扩增往往不能胜利。假设不能避开这一区域时，用7-deaza-2-脱氧GTP取代dGTP对扩增的胜利是有协助的。11.引物应具有特异性 引物设计完成以后，应对其进展BLAST检测。假设与其它基因不具有互补性，就可以进展下一步的实验了。值得一提的是，各种模板的引物设计难度不一。有的模板本身条件比较困难，例如GC含量偏高或偏低，导致找不到各种目的都非常适宜的引物；用作克隆目的的PCR，由于产物序列相对固定，引物设计的选择自在度较低。在这种情况只能退而求其次，尽量去满足条件。做RealTime时,用于SYBRGreenI法时的一对引物与普通PCR的引物,在引物设计上所要求的参数是不同的。
研究生实验测序引物设计方法介绍及注意事项ppt课件
