蛋白质表达课件

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1、 mRNA的生物合成的生物合成 蛋白质生物合成蛋白质生物合成 原核生物表达系统原核生物表达系统 真核生物表达系统真核生物表达系统 蛋白质的纯化方法蛋白质的纯化方法 蛋白质生物合成的基本原理蛋白质生物合成的基本原理参与蛋白质生物合成的物质包括参与蛋白质生物合成的物质包括:1、三种、三种RNA mRNA（messenger RNA）rRNA（ribosomal RNA）tRNA（transfer RNA）2、20种氨基酸作为原料种氨基酸作为原料3、酶及众多蛋白因子、酶及众多蛋白因子4、ATP、GTP、无机离子等、无机离子等mRNA的生物合成的生物合成(转录转录)目的基因目的基因 RNA聚合酶聚合酶

2、 启动子启动子 转录终止信号转录终止信号 转录因子等等转录因子等等 启动子是启动子是DNA分子可以与分子可以与RNA取聚合酶特异结合的取聚合酶特异结合的部位部位,也就是转录开始的部位。也就是转录开始的部位。某个基因是否表达决某个基因是否表达决定于特定的启动子的起始转录。定于特定的启动子的起始转录。以开始转录生成以开始转录生成RNA 5端端 第一个核苷酸的位置为第一个核苷酸的位置为1,以负数表示上游的碱基数，正数为下游碱基数。以负数表示上游的碱基数，正数为下游碱基数。转录的起始点不是翻译起始点。转录的起始点不是翻译起始点。启动子启动子原核生物启动子原核生物启动子5-TTGACG-TATAA-起始

3、位点起始位点-3 -35区区 -10区区 +1（A、G）Pribnow框框真核生物启动子真核生物启动子5-GC-CAAT-TATA-起始位点起始位点-3 -80-110区区 -75区区 -25区区 +1（A、G）Hogness框框-35区与区与-10区之间的距离大约是区之间的距离大约是1619bp，小于，小于15bp或大于或大于20bp都会降低启动子的活性。强启动都会降低启动子的活性。强启动子子-10和和-35区之间的间隔为区之间的间隔为171 bp，增加或减少，增加或减少都能明显影响启动子强度。都能明显影响启动子强度。-10区与区与-35区的最佳间距区的最佳间距在克隆基因上游设置调节型强启动

4、子是一个高效的蛋白质表达在克隆基因上游设置调节型强启动子是一个高效的蛋白质表达系统最基本的条件。系统最基本的条件。不同启动子，效率不同。强启动子可产生较多不同启动子，效率不同。强启动子可产生较多mRNA，弱的，弱的则相反。则相反。外源基因的大量持续表达往往对宿主细胞有害，因为这一过外源基因的大量持续表达往往对宿主细胞有害，因为这一过程会消耗大量能量，从而破坏宿主细胞的必要的生理功能。程会消耗大量能量，从而破坏宿主细胞的必要的生理功能。带有表达克隆基因的质粒，在几次细胞分裂后往往会丢失。带有表达克隆基因的质粒，在几次细胞分裂后往往会丢失。解决的办法：解决的办法：引入强启动子并控制克隆基因在宿主细

5、胞生长引入强启动子并控制克隆基因在宿主细胞生长周期的某一特定时期发生转录，并且持续特定的时间。周期的某一特定时期发生转录，并且持续特定的时间。调节型强启动子调节型强启动子转录终止信号即转录终止信号即终止子终止子，其作用是使其作用是使RNA聚合酶聚合酶在在DNA模板的特异位点模板的特异位点终止终止RNA的合成。的合成。转录终止信号转录终止信号(DNA)3-GGGTCGGGCGGATTACTCGCCCGAAAAAAAA-5(RNA)5-CCCAGCCCGCCUAAUGAGCGGGCUUUUUUUU-OH-3通常只要有一个核苷酸的改变，破坏了规则的双螺旋的茎时，即可通常只要有一个核苷酸的改变，破坏了

6、规则的双螺旋的茎时，即可破坏终止子的功能。破坏终止子的功能。茎环结构使转录终止的机理茎环结构使转录终止的机理 使使RNA聚合酶变构，转录停止；聚合酶变构，转录停止；使转录复合物趋于解离，使转录复合物趋于解离，RNA产物释放。产物释放。5pppG5335蛋白质的生物合成（翻译）蛋白质的生物合成（翻译）mRNA起始翻译受下列因素影响起始翻译受下列因素影响 mRNA的核糖体结合位点的核糖体结合位点 AUG前后的核酸序列前后的核酸序列SD序列(Shine-Dalgarno）UAAGGAGGU SD序列位于mRNA 5末端非翻译的前导区内，其起点距翻译起始密码AUG上游约3-11个 bp（-3-11bp

7、）。SD序列与16s rRNA3末端碱基AUUCCUCC互补，控制翻译的起始。二者互补的程度以及SD序列与起始密码间的合适距离(一般是8个bp）都影响mRNA的翻译效果。mRNA5-UAAGGAGGU-AUG 16S rRNA3 -AUUCCUCCA-mRNA的核糖体结合位点的核糖体结合位点大肠杆菌大肠杆菌mRNAs的的SD顺序与顺序与16SrRNA的的3-端的互补性端的互补性DB 序列序列 5-AUGAAUCACAAAGUG-3 DB 序列（序列（downstream box）位于起始密码下游，）位于起始密码下游，16S rRNA的的1469-1483 碱基互补。这个序列也影响碱基互补。这个

8、序列也影响mRNA的起始翻译。的起始翻译。真核生物无真核生物无SD序列，但是有一个序列，但是有一个Kozak序列，这个序列影响序列，这个序列影响真核真核mRNA的起始翻译。这个序列的起始翻译。这个序列-3位的位的A最重要，而且在最重要，而且在+4位最好是嘌呤，位最好是嘌呤，G是最优的碱基。是最优的碱基。AUG前后的核酸序列前后的核酸序列G C C A C C A U G G-6 -5 -4 -3 -2 -1 1 2 3 4 遗传密码与遗传密码与tRNA 除了极个别情况除了极个别情况,遗传密遗传密码在所有的有机体内是码在所有的有机体内是相同的相同的,但是不同的有机但是不同的有机体内不同密码子的使

9、用体内不同密码子的使用程度不同。而这种不同程度不同。而这种不同是由于是由于tRNA在不同的机在不同的机体内的丰度不同。体内的丰度不同。N端端fMet或或Met的切除的切除 二硫键的形成二硫键的形成 特定氨基酸的修饰特定氨基酸的修饰 切除新生肽链中非功能片段切除新生肽链中非功能片段 多聚体构成的蛋白质还要经过聚合过程多聚体构成的蛋白质还要经过聚合过程 糖基化，磷酸化等等糖基化，磷酸化等等蛋白质前体的加工蛋白质前体的加工不论原核生物还是真核生物，在细胞内合成的蛋白质需定不论原核生物还是真核生物，在细胞内合成的蛋白质需定位于细胞内的特异区域，或者分泌出细胞。分泌性蛋白位于细胞内的特异区域，或者分泌出

10、细胞。分泌性蛋白都有一段都有一段信号肽信号肽，即在蛋白质合成过程中，即在蛋白质合成过程中N端有一端有一1536个氨基酸残基的肽段个氨基酸残基的肽段-信号肽，它能引导蛋白质的肽链信号肽，它能引导蛋白质的肽链到达并通过内质网，然后被内质网中的信号肽酶切除。到达并通过内质网，然后被内质网中的信号肽酶切除。相对于真核生物来说，原核生物蛋白的分泌要简单得多。相对于真核生物来说，原核生物蛋白的分泌要简单得多。蛋白质的分泌蛋白质的分泌一些信号肽的一级结构一些信号肽的一级结构蛋白的分泌（一）蛋白的分泌（一）蛋白的分泌（二）蛋白的分泌（二）蛋白的糖基化蛋白的糖基化革兰氏阳性菌蛋白的分泌革兰氏阳性菌蛋白的分泌革兰

11、氏阴性菌蛋白的分泌革兰氏阴性菌蛋白的分泌 多肽链合成后必须正确地折叠才能具有天然的构象。经多肽链合成后必须正确地折叠才能具有天然的构象。经过跨膜转运进入内质网的肽链，在折叠过程中是在蛋白伴侣过跨膜转运进入内质网的肽链，在折叠过程中是在蛋白伴侣（chaperones)或称分子伴侣（或称分子伴侣（molecular chaperones)辅助下辅助下完成的，蛋白伴侣广泛分布于原核及真核细胞中。起到介导完成的，蛋白伴侣广泛分布于原核及真核细胞中。起到介导各种功能域乃至整个蛋白质分子的折叠，辅助肽链折叠成天各种功能域乃至整个蛋白质分子的折叠，辅助肽链折叠成天然构象的具有生物学活性的蛋白质。然构象的具有

12、生物学活性的蛋白质。伴侣蛋白伴侣蛋白理想的表达载体质粒包括：理想的表达载体质粒包括：一个具有一个具有3种不同的阅读框以方便基因插入的多克隆位点种不同的阅读框以方便基因插入的多克隆位点一个调节型的强启动子一个调节型的强启动子一个选择性标记一个选择性标记一个复制起点一个复制起点一个有助于蛋白质的稳定一个有助于蛋白质的稳定、纯化并可去除的融合蛋白标签纯化并可去除的融合蛋白标签一个转录终止信号一个转录终止信号一个分泌信号肽（分泌型）一个分泌信号肽（分泌型）表达载体质粒表达载体质粒融合蛋白融合蛋白 融合蛋白是两个或多个基因的部分编码区连接融合蛋白是两个或多个基因的部分编码区连接起来而编码的氨基酸序列。融

13、合蛋白的作用：起来而编码的氨基酸序列。融合蛋白的作用：提高外源蛋白在表达系统中的稳定性提高外源蛋白在表达系统中的稳定性增加外源蛋白在表达系统中的表达量增加外源蛋白在表达系统中的表达量增加目的蛋白的溶解性增加目的蛋白的溶解性作为抗原的标记蛋白作为抗原的标记蛋白易于外源蛋白的纯化易于外源蛋白的纯化融合蛋白作为抗原的标记蛋白融合蛋白作为抗原的标记蛋白C-myc 标记蛋白V5 标记蛋白MBP麦芽糖结合蛋白麦芽糖结合蛋白Amylose树脂树脂MBPFactor Xa 蛋白酶切割位点蛋白酶切割位点10 mM 麦芽糖麦芽糖目的蛋白目的蛋白融合蛋白易于外源蛋白的纯化融合蛋白易于外源蛋白的纯化融合蛋白的纯化融合

14、蛋白的纯化非融合蛋白的纯化非融合蛋白的纯化原核生物表达系统原核生物表达系统原核生物表达系统原核生物表达系统:大肠杆菌大肠杆菌、枯草杆菌、农杆菌、枯草杆菌、农杆菌大肠杆菌表达体系的优点：大肠杆菌表达体系的优点：积累了相对充分的研究工作，有多种表型的宿主菌和相应积累了相对充分的研究工作，有多种表型的宿主菌和相应的载体可供选择应用的载体可供选择应用易于进行遗传操作和高效表达易于进行遗传操作和高效表达操作安全，致病能力低操作安全，致病能力低生长迅速生长迅速,培养代谢易于控制培养代谢易于控制,成本相对低等等成本相对低等等大肠杆菌表达体系的缺点大肠杆菌表达体系的缺点缺乏真核生物的转录后和翻译后加工机制，不

15、宜表缺乏真核生物的转录后和翻译后加工机制，不宜表达真核生物的蛋白达真核生物的蛋白缺乏表达蛋白复性系统，表达蛋白无特异性空间结缺乏表达蛋白复性系统，表达蛋白无特异性空间结构构,常形成不溶性包涵体常形成不溶性包涵体(inclusion body)表达产物不稳定，易被细菌蛋白酶降解表达产物不稳定，易被细菌蛋白酶降解细菌的内毒素（热源）不易除去，会造成人畜发热细菌的内毒素（热源）不易除去，会造成人畜发热大肠杆菌表达体系的转录调控大肠杆菌表达体系的转录调控 P：启动子：启动子 O：操纵子：操纵子 I：调节基因：调节基因 I CAP调控序列调控序列 结构基因结构基因乳糖操纵元（乳糖操纵元（lac oper

16、on）：）：大肠杆菌的基因多数以大肠杆菌的基因多数以操纵元操纵元的形式组成基因表达调控的单元，的形式组成基因表达调控的单元，操纵元包括相关结构基因及其上游的调控序列。操纵元包括相关结构基因及其上游的调控序列。z：-半乳糖苷酶半乳糖苷酶 y：通透酶：通透酶 a：转乙酰基酶：转乙酰基酶 乳糖乳糖(lac)操纵元的表达调控是利用阻遏蛋白的负性调控操纵元的表达调控是利用阻遏蛋白的负性调控而实现的：而实现的：大肠杆菌在没有乳糖的环境中生存时，大肠杆菌在没有乳糖的环境中生存时，1ac操纵元处于阻遏操纵元处于阻遏状态。状态。i基因在自身的启动子基因在自身的启动子pi控制下，产生阻遏蛋白控制下，产生阻遏蛋白R

17、。R以四聚体形式与操纵子以四聚体形式与操纵子o结合，阻碍结合，阻碍RNA聚合酶与启动子聚合酶与启动子P的结合，阻止基因的转录起始。的结合，阻止基因的转录起始。R的阻遏作用不是绝对的，的阻遏作用不是绝对的，R与与O偶尔解离，使细胞中还有偶尔解离，使细胞中还有极低水平的极低水平的-半乳糖苷酶及通透酶的生成（本底表达）。半乳糖苷酶及通透酶的生成（本底表达）。当有乳糖存在时，乳糖与阻遏蛋白结合，改变阻遏当有乳糖存在时，乳糖与阻遏蛋白结合，改变阻遏蛋白的空间构象，使阻遏蛋白四聚体解聚成单体，蛋白的空间构象，使阻遏蛋白四聚体解聚成单体，失去与失去与o的亲和力，与的亲和力，与o解离，基因转录开放。解离，基因

18、转录开放。异丙基硫代半乳糖苷（异丙基硫代半乳糖苷（isopropylthiog-alactoside IPTG），一种化学合成的乳糖类似物，能与阻遏蛋），一种化学合成的乳糖类似物，能与阻遏蛋白特异性结合使阻遏蛋白白特异性结合使阻遏蛋白R构象变化，诱导构象变化，诱导lac操纵操纵元的开放，但本身不受元的开放，但本身不受-半乳糖苷酶的催化分解而十半乳糖苷酶的催化分解而十分稳定。分稳定。CAP(cAMP activated protein)的正性调控的正性调控 cAMP含量与葡萄糖的分解代谢有关，当细菌利用葡萄含量与葡萄糖的分解代谢有关，当细菌利用葡萄糖分解供给能量时，糖分解供给能量时，cAMP生成

19、少，生成少，cAMP含量低；含量低；相反，当环境中无葡萄糖可供利用时，相反，当环境中无葡萄糖可供利用时，cAMP含量就含量就升高，升高，cAMP与与cAMP的受体蛋白的受体蛋白 CRP（cAMP receptor protein）结合变为）结合变为CAP，并以二聚体的方式，并以二聚体的方式与特定的与特定的DNA序列结合。序列结合。在缺乏葡萄糖的培养基中时，在缺乏葡萄糖的培养基中时，CAP合成量增加，合成量增加，CAP具有激活具有激活乳糖（乳糖（Lac）等启动子的功能。一些依赖于）等启动子的功能。一些依赖于CRP的启动子缺乏的启动子缺乏一般启动子所具有的典型的一般启动子所具有的典型的-35区序列

20、特征（区序列特征（TTGACA）。因）。因此此RNA聚合酶难以与其结合。聚合酶难以与其结合。CAP能提高能提高RNA聚合酶与启动聚合酶与启动子结合常数：子结合常数：CAP通过改变启动子的构象以及与酶的相互作用帮助酶分通过改变启动子的构象以及与酶的相互作用帮助酶分子正确定向子正确定向,以便与以便与-10区结合，起到取代区结合，起到取代-35区功能的作用。区功能的作用。CAP还能抑制还能抑制RNA聚合酶与聚合酶与DNA中其它位点的结合，从而中其它位点的结合，从而提高与其特定启动子结合的概率。提高与其特定启动子结合的概率。由于由于P1ac是弱启动子，单纯因乳糖的存在发生去阻是弱启动子，单纯因乳糖的存

21、在发生去阻遏使遏使1ac操纵元转录开放，还不能使细胞很好利用操纵元转录开放，还不能使细胞很好利用乳糖，必须同时有乳糖，必须同时有CAP来加强转录活性，细菌才来加强转录活性，细菌才能合成足够的酶来利用乳糖。能合成足够的酶来利用乳糖。1ac操纵元的强诱导操纵元的强诱导既需要有乳糖的存在，又需要没有葡萄糖可供利既需要有乳糖的存在，又需要没有葡萄糖可供利用，通过用，通过CAP的正调控作用，细菌才能充分利用的正调控作用，细菌才能充分利用乳糖。乳糖。由于由于P1ac是弱启动子，实际上的基因工程应用中，是弱启动子，实际上的基因工程应用中，通过通过1ac启动子启动子-10区核苷酸突变产生的区核苷酸突变产生的1

22、acUV5启启动子经常用于质粒表达载体中，这种启动子比野动子经常用于质粒表达载体中，这种启动子比野生型生型1ac启动子更强。启动子更强。pET表达载体表达载体pET表达载体的启动子是表达载体的启动子是T7噬菌体基因噬菌体基因10启动子（启动子（T7启动启动子），需要子），需要T7RNA聚合酶才能转录。聚合酶才能转录。T7RNA聚合酶转录机制十分有效并具有选择性：充分诱导聚合酶转录机制十分有效并具有选择性：充分诱导时，几乎所有的细胞资源都用于表达目的蛋白；在非诱导时，几乎所有的细胞资源都用于表达目的蛋白；在非诱导条件下，几乎可以使目的基因完全处于沉默而不转录。条件下，几乎可以使目的基因完全处于沉

23、默而不转录。T7RNA聚合酶基因插入由大肠杆菌聚合酶基因插入由大肠杆菌lacUV5启动子控制、启动子控制、DE3溶原状态下的大肠杆菌染色体上。溶原状态下的大肠杆菌染色体上。在在pET表达载体的表达载体的T7启动子的下游有一个启动子的下游有一个lac操纵子序列，操纵子序列，这个载体还有一个带有常规启动子以及编码这个载体还有一个带有常规启动子以及编码lac阻遏蛋白的阻遏蛋白的序列（序列（lac I）。）。T7启动子、启动子、lac操纵子和操纵子和lacI位置交错。位置交错。pET表达载体在表达载体在DE3溶原状态下的大肠杆菌中，溶原状态下的大肠杆菌中，lac阻遏蛋阻遏蛋白可以作用于大肠杆菌染色体上

24、，抑制宿主菌转录白可以作用于大肠杆菌染色体上，抑制宿主菌转录T7RNA聚合酶，也作用于聚合酶，也作用于T7启动子、启动子、lac操纵子，以阻断任何操纵子，以阻断任何T7RNA聚合酶导致的目的基因转录。聚合酶导致的目的基因转录。(保证表达质粒在宿主保证表达质粒在宿主菌中的稳定菌中的稳定)T7lac启动子的调控启动子的调控另一个为目的基因提供另一个为目的基因提供稳定性保证的方法是在稳定性保证的方法是在拥有兼容的氯霉素抗性、拥有兼容的氯霉素抗性、编码表达少量编码表达少量T7溶菌酶溶菌酶的宿主菌（的宿主菌（pLysS和和pLysE）中表达。）中表达。T7溶溶菌酶是一种双功能蛋白：菌酶是一种双功能蛋白：

25、它能够切割大肠杆菌细它能够切割大肠杆菌细胞壁肽聚糖层，也可与胞壁肽聚糖层，也可与T7RNA聚合酶结合，阻聚合酶结合，阻止转录。止转录。pET表达载体的功能非常强大，表达载体的功能非常强大，即使即使pET表达载体上的表达载体上的T7启启动子只是造成低水平的本底表动子只是造成低水平的本底表达，通常也会造成敏感宿主菌达，通常也会造成敏感宿主菌生长困难以及表达宿主中质粒生长困难以及表达宿主中质粒不稳定。所以常用的克隆宿主不稳定。所以常用的克隆宿主菌是菌是NovaBlue,JM109以及以及DH5。表达宿主菌（表达宿主菌（pLysS和和pLysE 等）等）抗生素抗性抗生素抗性pET系列的载体有系列的载体

26、有kanR或或ampR的筛选标记。的筛选标记。kanR pET载体载体中中kan基因与基因与T7启动子反向，因此诱导启动子反向，因此诱导T7启动子并不会增加启动子并不会增加kan基因产物产量。相反，基因产物产量。相反，ampR pET载体的载体的-内酰胺酶基因内酰胺酶基因位于位于T7启动子的下游并与之同向。虽然所有的启动子的下游并与之同向。虽然所有的pET表达载体表达载体都带有位于都带有位于-内酰胺酶基因前的天然内酰胺酶基因前的天然T7转录终止子（转录终止子（T），），但是这个终止子只有大约但是这个终止子只有大约70%的效率，的效率，T7RNA聚合酶仍能读聚合酶仍能读通从而除了产生目的通从而除

27、了产生目的RNA外也有少量的外也有少量的-内酰胺酶内酰胺酶RNA，这，这样诱导的培养体系中就会有样诱导的培养体系中就会有-内酰胺酶，内酰胺酶，-内酰胺酶会使氨内酰胺酶会使氨苄青霉素降解，从而使筛选失败。所以苄青霉素降解，从而使筛选失败。所以pET-43.1和和pET-44载载体的体的-内酰胺酶基因已被翻转。内酰胺酶基因已被翻转。宿主染色体宿主染色体DNA整合整合由于质粒的复制，RNA的转录及其编码蛋白质的翻译都需要能量，质粒增加了细胞代谢的负担。高拷贝数质粒对细胞造成的负担大于低拷贝数质粒。因而，一部分细胞在生长过程中会丢失质粒。如果将目的DNA直接引入宿主生物的染色体中，就能克服质粒丢失的问

28、题。目的基因整合到宿主染色体时，染色体整合位置必须在所需的编码以外，即，DNA序列必须插入到染色体中特定的非必要位点，两个DNA分子之间只要发生同源重组即可。为了将DNA整合到染色体中，插入DNA一般至少需要与染色体DNA有50个核苷酸相同的序列。真核生物表达系统真核生物表达系统 昆虫细胞表达系统昆虫细胞表达系统 哺乳动物细胞表达系统哺乳动物细胞表达系统 酵母菌表达系统酵母菌表达系统昆虫表达系统是利用培养的昆虫细胞或幼虫，通昆虫表达系统是利用培养的昆虫细胞或幼虫，通过杆状病毒载体来表达哺乳动物细胞蛋白过杆状病毒载体来表达哺乳动物细胞蛋白允许插入较大的外源基因允许插入较大的外源基因可以胞内表达，

29、也可以进行分泌性表达可以胞内表达，也可以进行分泌性表达能进行蛋白质翻译后加工能进行蛋白质翻译后加工:糖基化、磷酸化等等糖基化、磷酸化等等杆状病毒具有宿主专一性，对其他动物是安全的杆状病毒具有宿主专一性，对其他动物是安全的缺点：每表达一次蛋白都要制备新的病毒缺点：每表达一次蛋白都要制备新的病毒昆虫细胞表达系统昆虫细胞表达系统一种广泛应用的杆状病毒是多核型多角体病毒（一种广泛应用的杆状病毒是多核型多角体病毒（AcMNPV），），病毒在其侵染周期中，产生两种形式的病毒：单个病毒颗粒，病毒在其侵染周期中，产生两种形式的病毒：单个病毒颗粒，该颗粒从受感染的细胞中释放出来后又去感染其他的细胞；该颗粒从受感

30、染的细胞中释放出来后又去感染其他的细胞；多角体，多个病毒颗粒被包裹在蛋白外壳（多角体蛋白）中，多角体，多个病毒颗粒被包裹在蛋白外壳（多角体蛋白）中，当细胞裂解或宿主死亡后，多角体就释放到环境中。当细胞裂解或宿主死亡后，多角体就释放到环境中。昆虫杆状病毒（昆虫杆状病毒（baculovirus）单颗粒病毒粒子多角体多角体蛋白基因的启动子非常强，把目的蛋白的基因多角体蛋白基因的启动子非常强，把目的蛋白的基因接在其启动子后能高水平地表达目的蛋白。构建重接在其启动子后能高水平地表达目的蛋白。构建重组杆状病毒组杆状病毒AcMNPV的转运载体和的转运载体和AcMNPV DNA共转染培养的昆虫细胞，几天后可收

31、到目的蛋白。共转染培养的昆虫细胞，几天后可收到目的蛋白。Pp:多角体蛋白基因的启动子多角体蛋白基因的启动子Pt:多角体蛋白基因的终止序列多角体蛋白基因的终止序列MCS:多克隆位点多克隆位点哺乳动物细胞表达系统最大的优点是能表达翻译后修哺乳动物细胞表达系统最大的优点是能表达翻译后修饰过的外源蛋白饰过的外源蛋白哺乳动物细胞表达系统的缺点是，对组织细胞培养技哺乳动物细胞表达系统的缺点是，对组织细胞培养技术要求高，培养和筛选细胞株的周期长术要求高，培养和筛选细胞株的周期长常用的细胞系有：非洲绿猴肾细胞（常用的细胞系有：非洲绿猴肾细胞（COS）、小仓鼠）、小仓鼠肾细胞（肾细胞（BHK）、人的胚胎肾细胞（

32、）、人的胚胎肾细胞（HEK-239）、中）、中国仓鼠卵巢细胞（国仓鼠卵巢细胞（CHO）哺乳动物细胞表达系统哺乳动物细胞表达系统哺乳动物细胞表达系统的表达载体哺乳动物细胞表达系统的表达载体但是目的基因要接上增强翻译和有助于分泌和纯化的序列：但是目的基因要接上增强翻译和有助于分泌和纯化的序列：kozak序列（序列（K）信号序列（信号序列（S）蛋白纯化标签（蛋白纯化标签（T）蛋白酶切位点（蛋白酶切位点（P）终止密码子（终止密码子（SC）5UTR、3UTR有助于有助于RNA的稳定性并提高翻译效率的稳定性并提高翻译效率酵母菌表达外源基因的优势：酵母菌表达外源基因的优势：全基因组已测序，表达调控机理比较清

33、楚，遗传操作简便全基因组已测序，表达调控机理比较清楚，遗传操作简便具有原核细菌无法比拟的真核蛋白翻译后加工系统具有原核细菌无法比拟的真核蛋白翻译后加工系统能将外源基因表达产物分泌至培养基中（分泌型）能将外源基因表达产物分泌至培养基中（分泌型）不含有特异性的病毒、不产生内毒素，认定为安全的不含有特异性的病毒、不产生内毒素，认定为安全的基因工程受体系统（基因工程受体系统（Generally recognized as Safe GRAS)大规模发酵历史悠久、技术成熟、工艺简单、成本低廉大规模发酵历史悠久、技术成熟、工艺简单、成本低廉酵母菌是最简单的真核模式生物酵母菌是最简单的真核模式生物如果说大肠

34、杆菌是外源基因最成熟的原核生物表如果说大肠杆菌是外源基因最成熟的原核生物表达系统，酵母菌则是最成熟的真核生物表达系统。达系统，酵母菌则是最成熟的真核生物表达系统。酵母菌表达系统酵母菌表达系统的宿主菌酿酒酵母（酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）乳酸克鲁维酵母（乳酸克鲁维酵母（Kluyveromyces lactis）多形汉逊酵母（多形汉逊酵母（Hansenula polymorpha）巴斯德毕赤酵母（巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris）巴斯德毕赤酵母（巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris）表达系统）表达系统巴斯德毕赤酵母巴斯德毕赤酵母（Pichia

35、 pastoris）的特点：的特点：具有调节型强启动子具有调节型强启动子pAOX1，紧密调控编码乙醇氧化酶基因，紧密调控编码乙醇氧化酶基因，在以甲醇为唯一碳源的情况下，细胞内总蛋白中乙醇氧化酶在以甲醇为唯一碳源的情况下，细胞内总蛋白中乙醇氧化酶能达到能达到30%，缺乏的情况下，缺乏的情况下，AOX1基因完全关闭基因完全关闭不产生乙醇，可以高密度培养产生大量蛋白不产生乙醇，可以高密度培养产生大量蛋白通常也分泌少量蛋白，可以简化分泌型蛋白的纯化通常也分泌少量蛋白，可以简化分泌型蛋白的纯化巴斯德毕赤酵母（巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris）表）表达系统的表达载体达系统的表达载体整合型表达

36、：单交换（整合型表达：单交换（AOX）整合型表达单交换（整合型表达单交换（HIS）整合型表达：双交换（整合型表达：双交换（AOX）整合型表达：多拷贝（体内）整合型表达：多拷贝（体内）体外构建多拷贝目的基因的表达载体体外构建多拷贝目的基因的表达载体Bgl II A|GATC T T CTAG|ABamH I G|GATC C C CTAG|G克隆方案I：分泌表达含有天然N端蛋白质PCR引物的设计：引物的设计：正向引物含有一个正向引物含有一个Xho I位点和位点和Kex蛋白酶切割蛋白酶切割位点，随后紧接目的基因的第一个密码子。位点，随后紧接目的基因的第一个密码子。反向引物包含有反向引物包含有Bgl

37、 的识别序列和的识别序列和Stop Code。K:Lys 赖氨酸，赖氨酸，R:Arg 精氨酸精氨酸克隆方案II：分泌表达含有非天然N端的蛋白质 如果目的基因中含有如果目的基因中含有Xho I酶切位点，那么酶切位点，那么就需要利用载体中的其它位点将该基因与就需要利用载体中的其它位点将该基因与-MF融合在同一阅读框中。这一克隆方融合在同一阅读框中。这一克隆方案会在目的蛋白质的案会在目的蛋白质的N端加入载体编码的端加入载体编码的氨基酸。选用载体中的多克隆位点氨基酸。选用载体中的多克隆位点Bgl II和和Kpn I为例。为例。K:Lys 赖氨酸，赖氨酸，R:Arg 精氨酸精氨酸克隆方案III：分泌表达

38、C端含有HA-Tag的蛋白质 该基因在该基因在C末端融合有抗原决定簇末端融合有抗原决定簇tag（红血（红血球凝聚素抗原决定簇，球凝聚素抗原决定簇，HA）。）。正向引物的设计参照克隆方案正向引物的设计参照克隆方案I或或II。反向引物应包含编码反向引物应包含编码HA 的的DNA，终止密码，终止密码子和用于克隆至多克隆位点的限制性内切酶子和用于克隆至多克隆位点的限制性内切酶位点（以位点（以Bgl为例）。为例）。K:Lys 赖氨酸，赖氨酸，R:Arg 精氨酸精氨酸常用的蛋白质纯化方式Gel filtration chromatographyIon ExchangeAffinity chromatographyl单柱蛋白纯化单柱蛋白纯化l无需蛋白酶无需蛋白酶l用于蛋白质的连接和特殊标记用于蛋白质的连接和特殊标记l用于抗体的分析纯化用于抗体的分析纯化l融合表达目的蛋白、融合表达目的蛋白、Intein 和几丁质结和几丁质结合蛋白（合蛋白（CBD）l通过通过CBD将融合蛋白结合到几丁质将融合蛋白结合到几丁质(chitin)柱上。柱上。l利用利用Intein介导的蛋白自剪接将目的蛋介导的蛋白自剪接将目的蛋白从几丁质柱上释放出来白从几丁质柱上释放出来lIntein和和CBD仍结合在几丁质介质上仍结合在几丁质介质上