目的基因的克隆课件

《目的基因的克隆课件》由会员分享，可在线阅读，更多相关《目的基因的克隆课件（72页珍藏版）》请在装配图网上搜索。

1、 Genetic Recombination,Genetic diagnosis and gene thereapy第十五章第十五章 目目 录录目目 录录第第 一小节一小节DNA的重组的重组 DNA Recombination目目 录录DNA重组重组接合作用接合作用(conjugation)转化作用转化作用(transformation)转导作用转导作用(transduction)转转 座座(transposition)同源重组同源重组(homologous recombination)位点特异的重组位点特异的重组(site-specific recombination)目目 录录第一小节第一

2、小节 重组重组DNA技术技术DNA Recombination Technique 目目 录录重组重组DNA技术的发展史技术的发展史1865年年 G.J.Mendel的豌豆杂交试验的豌豆杂交试验1944年年 O.T.Avery的肺炎球菌转化实验的肺炎球菌转化实验1973年年 美国斯坦福大学的科学家构建美国斯坦福大学的科学家构建第一个第一个重组重组DNA分子分子1977年年 美国南旧金山由博耶和斯旺森建立世界上美国南旧金山由博耶和斯旺森建立世界上第一家第一家遗传工遗传工程公司，专门应用重组程公司，专门应用重组DNA技术制造医学上重要的药物。技术制造医学上重要的药物。1980年年 开始建造开始建造

3、第一家第一家应用重组应用重组DNA技术生产胰岛素的工厂技术生产胰岛素的工厂1997年年 英国罗林研究所成功的克隆了英国罗林研究所成功的克隆了多莉多莉目目 录录n相关概念相关概念nDNA克隆克隆n工具酶工具酶n目的基因目的基因n基因载体基因载体n基本原理基本原理 n重组重组DNA技术与医学的关系技术与医学的关系本节主要内容本节主要内容目目 录录克隆克隆(clone)来自同一始祖的相同副本或拷贝的集合。来自同一始祖的相同副本或拷贝的集合。获取同一拷贝的过程称为获取同一拷贝的过程称为克隆化克隆化(cloning)，即即无性繁殖无性繁殖。（一）（一）DNA克隆克隆目目 录录技术水平：技术水平：分子克隆

4、分子克隆(molecular clone)即即DNA 克隆克隆 细胞克隆细胞克隆个体克隆（动物或植物）个体克隆（动物或植物）目目 录录DNA克隆克隆应用酶学的方法，在体外将各种来源的遗传应用酶学的方法，在体外将各种来源的遗传物质（同源的或异源的、原核的或真核的、天然物质（同源的或异源的、原核的或真核的、天然的或人工的的或人工的DNA）与载体）与载体DNA接合成一具有自我接合成一具有自我复制能力的复制能力的DNA分子分子复制子复制子(replicon)，继而，继而通过转化或转染宿主细胞，筛选出含有目的基因通过转化或转染宿主细胞，筛选出含有目的基因的转化子细胞，再进行扩增提取获得大量同一的转化子细

5、胞，再进行扩增提取获得大量同一D N A 分 子，也 称分 子，也 称 基 因 克 隆 或 重 组基 因 克 隆 或 重 组 D N A(recombinant DNA)。目目 录录生物技术工程生物技术工程:基因工程、蛋白质工程、基因工程、蛋白质工程、酶工程、细胞工程等酶工程、细胞工程等目的目的 分离获得某一感兴趣的基因或分离获得某一感兴趣的基因或DNA 获得感兴趣基因的表达产物（蛋白质）获得感兴趣基因的表达产物（蛋白质）基因工程基因工程(genetic engineering)实现基实现基因克隆所用的方法及相关的工作称基因工程，因克隆所用的方法及相关的工作称基因工程，又称又称重组重组DNA工

6、艺学工艺学。目目 录录（二）工具酶（二）工具酶n 限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶n DNA聚合酶聚合酶n 逆转录酶逆转录酶n T4DNA连接酶连接酶n 碱性磷酸酶碱性磷酸酶n 末端转移酶末端转移酶n Taq DNA聚合酶聚合酶目目 录录重组重组DNA技术中常用的工具酶技术中常用的工具酶工工 具具 酶酶功功 能能限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶识别特异序列，切割识别特异序列，切割DNADNA连接酶连接酶催化催化DNA中相邻的中相邻的5 磷酸基和磷酸基和3 羟基末端之间形成磷酸羟基末端之间形成磷酸二酯键，使二酯键，使DNA切口封合或使两个切口封合或使两个DNA分子或片段连接分子或片段连接DNA聚

7、合酶聚合酶合成双链合成双链cDNA分子或片段连接分子或片段连接缺口平移制作高比活探针缺口平移制作高比活探针DNA序列分析序列分析填补填补3 末端末端Klenow片段片段又名又名DNA聚合酶聚合酶I大片段，具有完整大片段，具有完整DNA聚合酶聚合酶I的的53 聚合、聚合、35 外切活性，而无外切活性，而无53 外切活性。常用于外切活性。常用于cDNA第二链合成，双链第二链合成，双链DNA 3 末端标记等末端标记等反转录酶反转录酶合成合成cDNA替代替代DNA聚合酶聚合酶I进行填补，标记或进行填补，标记或DNA序列分析序列分析多聚核苷酸激酶多聚核苷酸激酶催化多聚核苷酸催化多聚核苷酸5 羟基末端磷酸

8、化，或标记探针羟基末端磷酸化，或标记探针末端转移酶末端转移酶在在3 羟基末端进行同质多聚物加尾羟基末端进行同质多聚物加尾碱性磷酸酶碱性磷酸酶切除末端磷酸基切除末端磷酸基目目 录录限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶定义定义限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶(restriction endonuclease,RE)是是识别识别DNA的特异序列的特异序列,并在识别位点或其周并在识别位点或其周围切割双链围切割双链DNA的一类内切酶。的一类内切酶。GGATCCCCTAGGGCCTAGGATCC GBam H目目 录录作用作用与甲基化酶共同构成细菌的限制修与甲基化酶共同构成细菌的限制修饰系统，限制外源饰系统，

9、限制外源DNA，保护自身保护自身DNA。分类分类、（基因工程技术中常用（基因工程技术中常用型）型）目目 录录第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写；第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写；第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写；第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写；第四个字母代表株；第四个字母代表株；用罗马数字表示发现的先后次序。用罗马数字表示发现的先后次序。命名命名Hin d 属属 系系 株株 序序Haemophilus influenzae d株株流感嗜血杆菌流感嗜血杆菌d株的第三种酶株的第三种酶目目 录录类酶识别序列特点类酶识别序列特点 回文结构回文结构(palindrome)切口

10、切口 ：平端切口平端切口、粘端切口粘端切口目目 录录Bam HGTCCAGGCCTAGGATCC GGGATCCCCTAGGHindGTCGACCAGCTGGACCTG平端切口平端切口粘端切口粘端切口目目 录录（三）目的基因（三）目的基因n cDNA(complementary DNA)n基因组基因组DNA(genomic DNA)目目 录录（四）基因载体（四）基因载体定义定义为携带目的基因，实现其无性繁殖或为携带目的基因，实现其无性繁殖或表达有意义的蛋白质所采用的一些表达有意义的蛋白质所采用的一些DNA分分子。子。常用载体常用载体质粒质粒DNA噬菌体噬菌体DNA病毒病毒DNA目目 录录克隆载

11、体克隆载体(cloning vector)为使插入的外源为使插入的外源DNA序列被扩增而特意序列被扩增而特意设计的载体称为设计的载体称为克隆载体克隆载体。表达载体表达载体(expression vector)为使插入的外源为使插入的外源DNA序列可转录翻译成序列可转录翻译成多肽链而特意设计的载体称为多肽链而特意设计的载体称为表达载体表达载体。目目 录录载体的选择标准载体的选择标准n能自主复制；能自主复制；n具有两个以上的遗传标记物，便于重组体具有两个以上的遗传标记物，便于重组体的筛选和鉴定；的筛选和鉴定；n有克隆位点（外源有克隆位点（外源DNA插入点），常具有插入点），常具有多个单一酶切位点，

12、称为多克隆位点；多个单一酶切位点，称为多克隆位点；n分子量小，以容纳较大的外源分子量小，以容纳较大的外源DNA。目目 录录1.1.质粒质粒(plasmid)特点特点 能在宿主细胞内独立自主复制；带有某能在宿主细胞内独立自主复制；带有某些遗传信息些遗传信息,会赋予宿主细胞一些遗传性状。会赋予宿主细胞一些遗传性状。目目 录录目目 录录目目 录录噬菌体噬菌体DNA改造系统改造系统 gt系列（插入型，适用系列（插入型，适用cDNA克隆）克隆）EMBL系列（置换型，适用基因组克隆）系列（置换型，适用基因组克隆）2.噬菌体噬菌体(phage)M13噬菌体噬菌体DNA改造系统（含改造系统（含lacZ基因）基

13、因）M13mp系列系列pUC系列系列目目 录录3.粘性质粒粘性质粒(cosmid)目目 录录酵母人工染色体酵母人工染色体(yeast artificial chromosome,YAC)细菌人工染色体细菌人工染色体(bacterial artificial chromosome,BAC)动物病毒动物病毒DNA改造的载体改造的载体（如腺病毒，腺病毒相关病毒，逆转录病毒）（如腺病毒，腺病毒相关病毒，逆转录病毒）其他其他目目 录录二、重组二、重组DNA技术基本原理技术基本原理基本原理基本原理目的基因的获取目的基因的获取DNA导入受体菌导入受体菌外源基因与载体的连接外源基因与载体的连接克隆载体的选择和

14、构建克隆载体的选择和构建重组体的筛选重组体的筛选克隆基因的表达克隆基因的表达 以以 质质 粒粒 为为 载载 体体 的的DNA 克克 隆隆 过过 程程目目 录录目目 录录（一）目的基因的获取（一）目的基因的获取1.化学合成法化学合成法要求：已知目的基因的核苷酸序列或其产物的要求：已知目的基因的核苷酸序列或其产物的氨基酸序列氨基酸序列。2.基因组基因组DNA文库文库(genomic DNA library)3.cDNA文库文库(cDNA library)4.聚合酶链反应聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)目目 录录*化学合成法获取目的基因化学合成法获取目的基因

15、由已知氨基酸序列推测可能的由已知氨基酸序列推测可能的DNA序列序列组织或细胞染色体组织或细胞染色体DNA基因片断基因片断克隆载体克隆载体重组重组DNA分子分子含重组分子的转化菌含重组分子的转化菌限制性内切酶限制性内切酶受体菌受体菌基因组基因组DNA文库文库存在于转化细胞内存在于转化细胞内由克隆载体所携带的所由克隆载体所携带的所有基因组有基因组DNA的集合的集合*从基因组从基因组DNA文文库获取目的基因库获取目的基因目目 录录限制酶切位点限制酶切位点限制酶消化限制酶消化 除去中间片段除去中间片段cos LR coscos L左臂左臂R cos右臂右臂真核生物染真核生物染色体色体DNA限制酶部分消

16、化限制酶部分消化 外源外源DNA与载体与载体DNA混合混合 连接反应连接反应 体外包装体外包装 用重组噬菌体用重组噬菌体感染大肠杆菌感染大肠杆菌 20 Kb DNA 片段片段 cos LR cos20 Kb 外源外源 DNA 片段片段 基因文库基因文库目目 录录mRNA cDNA 双链双链cDNA 重组重组DNA分子分子 cDNA文库文库 反转录酶反转录酶 载体载体 受体菌受体菌 复制复制*从从cDNA文库获取目的基因文库获取目的基因 逆转录酶逆转录酶A A A A T T T T AAAASISI核酸酶核酸酶 DNA聚合酶聚合酶碱水解碱水解 T T T T目目 录录目目 录录（三）外源基因与

17、载体的连接（三）外源基因与载体的连接1.1.粘性末端连接粘性末端连接方式方式：(1)同一限制酶切位点连接同一限制酶切位点连接(2)不同限制酶切位点连接不同限制酶切位点连接配伍末端连接配伍末端连接非配伍末端连接非配伍末端连接（二）克隆载体的选择和构建（二）克隆载体的选择和构建Bam H切割反应切割反应 GGATCC CCTAGGT4 DNA连接酶连接酶15CGATCC GGCCTAG目的基因用目的基因用 Bam H切割切割GCCTAGGCCTAGGCCTAGGCCTAGGATCCGGATCCGGATCCGGATCCG载体载体DNA用用Bam H切割切割GCCTAGGCCTAGGCCTAGGCCT

18、AGGATCCGGATCCGGATCCGGATCCG重组体重组体GCCTAGGCCTAGGATCCGGATCCGGCCTAGGCCTAGGATCCGGATCCG载体自连载体自连目的基因自连目的基因自连同一限制酶切位点连接同一限制酶切位点连接目目 录录不同限制酶切位点（非配伍末端）的连接不同限制酶切位点（非配伍末端）的连接GAATTCCTTAAGAGATCTTCTAGAEco R切割位点切割位点GCTTAAATCTAGAATTCGGATCTABg l切割位点切割位点AATTCGATCTAGAATTCGGATCTAAATTCGATCTAGEcoR+Bg l双酶切双酶切Eco R+Bg l双酶切双酶

19、切GCTTAAATCTAGAATTCGGATCTAT4 DNA连接酶连接酶15C重组体重组体配伍末端的配伍末端的连接情况和同一连接情况和同一限制酶切位点连限制酶切位点连接相似。接相似。目目 录录目目 录录2.平端连接平端连接适用于：适用于：限制性内切酶切割产生的平端限制性内切酶切割产生的平端粘端补齐或切平形成的平端粘端补齐或切平形成的平端目的基因目的基因载体载体限制性内切酶限制性内切酶限制性内切酶限制性内切酶T4 DNA连接酶连接酶15C重组体重组体载体自连载体自连目的基因目的基因 自连自连目目 录录目目 录录受体菌条件受体菌条件安全宿主菌安全宿主菌 限制酶和重组酶缺陷限制酶和重组酶缺陷处于感

20、受态处于感受态(competent)导入方式导入方式转化转化(transformation)转染转染(transfection)感染感染(infection)（四）重组（四）重组DNA导入受体菌导入受体菌目目 录录（五）重组体的筛选（五）重组体的筛选 1.直接选择法直接选择法(1)抗药性标记选择抗药性标记选择(2)标志补救标志补救(marker rescue)(3)分子杂交法分子杂交法原位杂交原位杂交Southern印迹印迹 2.免疫学方法免疫学方法如免疫化学方法及酶免检测分析等如免疫化学方法及酶免检测分析等(插入失活法插入失活法)抗药性标记选择抗药性标记选择目目 录录目目 录录重组重组DNA

21、DNA技术操作过程可形象归纳为技术操作过程可形象归纳为 小小 结结分分分离目的基因分离目的基因 切切限制酶切目的基因与载体限制酶切目的基因与载体接接拼接重组体拼接重组体 转转转入受体菌转入受体菌 筛筛筛选重组体筛选重组体 重组重组DNA技术操作的主要步骤技术操作的主要步骤载体载体质粒质粒噬菌体噬菌体病毒病毒目的基因（外源基因）目的基因（外源基因）基因组基因组DNA cDNA 人工合成人工合成PCR产物产物限制酶消化限制酶消化开环载体开环载体DNA目的基目的基因因连接酶连接酶重组体重组体转化转化体外包装，转染体外包装，转染带重组体的宿主带重组体的宿主筛选筛选表型筛选表型筛选酶切电泳鉴定酶切电泳鉴

22、定菌落原位杂交菌落原位杂交目目 录录目目 录录（一）疾病基因的发现与克隆（一）疾病基因的发现与克隆根据基因定位克隆之并研究其性质，而认根据基因定位克隆之并研究其性质，而认识疾病的分子机制。识疾病的分子机制。三、基因重组的意义三、基因重组的意义（二）生物制药（二）生物制药 重组重组DNA医药产品医药产品产产 品品功功 能能组织胞浆素原激活剂组织胞浆素原激活剂抗凝抗凝血液因子血液因子VIII促进凝血促进凝血颗粒细胞颗粒细胞-巨噬细胞集落剌激因子巨噬细胞集落剌激因子剌激白细胞生成剌激白细胞生成促红细胞生成素促红细胞生成素剌激白细胞生成剌激白细胞生成生长因子生长因子(bFGF,EGF)刺激细胞生长与分

23、化刺激细胞生长与分化生长素生长素治疗侏儒症治疗侏儒症胰岛素胰岛素治疗糖尿病治疗糖尿病干扰素干扰素(1b,2a,2b,)抗病毒感染及某些肿瘤抗病毒感染及某些肿瘤白细胞介素白细胞介素激活、剌激各类白细胞激活、剌激各类白细胞超氧化物歧化酶超氧化物歧化酶抗组织损伤抗组织损伤单克隆抗体单克隆抗体利用其结合特异性进行诊断试验、肿利用其结合特异性进行诊断试验、肿瘤导向治疗瘤导向治疗乙肝疫苗乙肝疫苗(CHO,酵母酵母)预防乙肝预防乙肝口服重组口服重组B亚单位菌体霍乱菌苗亚单位菌体霍乱菌苗预防霍乱预防霍乱目目 录录目目 录录基因诊断基因诊断(genetic diagnosis)是利用分子生利用分子生物学及分子遗

24、传的技术和原理，在物学及分子遗传的技术和原理，在DNA水平水平分析、鉴定遗传疾病所涉及基因的置换、缺失分析、鉴定遗传疾病所涉及基因的置换、缺失或插入等突变。或插入等突变。（三）基因诊断（三）基因诊断基本过程基本过程区分或鉴定区分或鉴定DNA的异常的异常分离、扩增待测的分离、扩增待测的DNA片断片断目目 录录标准标准.能正确扩增靶基因；能正确扩增靶基因；.能准确区分单个碱基的差别；能准确区分单个碱基的差别；.本底或噪声低，不干扰本底或噪声低，不干扰DNA的鉴定的鉴定;.便于完全自动化操作，适合大面积、便于完全自动化操作，适合大面积、大人群普查。大人群普查。目目 录录方法：方法：.限制性酶切片段多

25、态性分析；限制性酶切片段多态性分析；.分子杂交技术分子杂交技术.聚合酶链式反应（聚合酶链式反应（PCR)目目 录录分子杂交与印迹技术分子杂交与印迹技术Molecular Hybridization&Blotting Technology目目 录录核酸分子杂交核酸分子杂交(nucleic acid hybridization)在在DNA复性过程中，如果把不同复性过程中，如果把不同DNA单链单链分子放在同一溶液中，或把分子放在同一溶液中，或把DNA与与RNA放在一放在一起，只要在起，只要在DNA或或RNA的单链分子之间有一定的单链分子之间有一定的的碱基配对碱基配对关系，就可以在不同的分子之间形关系

26、，就可以在不同的分子之间形成成杂化双链杂化双链(heteroduplex)。一、分子杂交与印迹技术的原理一、分子杂交与印迹技术的原理目目 录录复性复性RNADNA目目 录录（一）印迹技术（一）印迹技术（二）探针技术（二）探针技术 探针探针(probe)一小段用同位素、生物素或荧光染料一小段用同位素、生物素或荧光染料标标记其末端或全链的已知序列的多聚核标标记其末端或全链的已知序列的多聚核苷酸，与固定在苷酸，与固定在NC膜上的核苷酸结合，判膜上的核苷酸结合，判断是否有同源的核酸分子存在。断是否有同源的核酸分子存在。目目 录录二、印迹技术的类别及应用二、印迹技术的类别及应用（一）（一）DNA印迹技术

27、印迹技术(Southern blotting)用于基因组用于基因组DNA、重组质粒和噬菌体、重组质粒和噬菌体的分析。的分析。（二）（二）RNA印迹技术印迹技术(Northern blotting)用于用于RNA的定性定量分析。的定性定量分析。（三）蛋白质的印迹分析（三）蛋白质的印迹分析(Western blotting)用于蛋白质定性定量及相互作用研究。用于蛋白质定性定量及相互作用研究。目目 录录 其他其他斑点印斑点印迹迹(dot blotting)原位杂交原位杂交(in situ hybridization)DNA点阵点阵(DNA array)DNA芯片技术芯片技术(DNA chip)目目

28、录录三种印迹技术的比较三种印迹技术的比较目目 录录分子杂交实验分子杂交实验目目 录录目目 录录放放射射自自显显影影照照片片目目 录录目目 录录 生生 物物 芯芯 片片 技技 术术Biological Chip Technology目目 录录DNA芯片芯片(DNA chip)cDNA芯片芯片(cDNA chip)是指将许多特定的是指将许多特定的DNA片段或片段或cDNA片片段作为探针，有规律地紧密排列固定于单位段作为探针，有规律地紧密排列固定于单位面积的支持物上面积的支持物上 。一、基因芯片一、基因芯片基因芯片基因芯片(gene chip)目目 录录目目 录录目目 录录是将高度密集排列的蛋白分子

29、作为探针点是将高度密集排列的蛋白分子作为探针点阵固定在固相支持物上，当与待测蛋白样品反阵固定在固相支持物上，当与待测蛋白样品反应时，可捕获样品中的靶蛋白，再经检测系统应时，可捕获样品中的靶蛋白，再经检测系统对靶蛋白进行定性和定量分析的一种技术。对靶蛋白进行定性和定量分析的一种技术。二、蛋白质芯片二、蛋白质芯片蛋白质芯片蛋白质芯片(protein chip)目目 录录 聚聚 合合 酶酶 链链 反反 应应Polymerase Chain Reaction目目 录录5 Primer 15 Primer 2Cycle 2Cycle 15 5 5 5 5 5 Template DNA5 5 5 5 5

30、5 5 5 一、基本工作原理一、基本工作原理目目 录录目目 录录Cycle 35 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 2530 次循环后，模板次循环后，模板DNA的含量的含量可以扩大可以扩大100万倍以上。万倍以上。目目 录录目目 录录n模板模板DNAn 特异性引物特异性引物n耐热耐热DNA聚合酶聚合酶n dNTPsn Mg2+二、二、PCRPCR体系基本组成成分体系基本组成成分目目 录录三、三、PCR的基本反应步骤的基本反应步骤变性变性95C延伸延伸72C退火退火Tm-5C目目 录录（一）目的基因的克隆（一）目的基因的克隆（二）基因的体外突变（二）基因的体外突变（三）

31、（三）DNA和和RNA的微量分析的微量分析（四）（四）DNA序列测定序列测定（五）基因突变分析（五）基因突变分析四、四、PCR的主要用途的主要用途目目 录录三、几种重要的三、几种重要的PCR衍生技术衍生技术（一）反转录（一）反转录PCR技术技术（二）原位（二）原位PCR技术技术（三）实时（三）实时PCR技术技术目目 录录实时实时PCRPCR技术原理技术原理目目 录录目目 录录（四）基因治疗（四）基因治疗定义定义基因治疗基因治疗(gene therapy)是向有功能缺陷是向有功能缺陷的细胞补充相应功能的基因，以纠正或补偿的细胞补充相应功能的基因，以纠正或补偿其基因的缺陷，从而达到治疗的目的。其基因的缺陷，从而达到治疗的目的。方式方式体细胞基因治疗体细胞基因治疗(somatic cell gene therapy)性细胞基因治疗性细胞基因治疗(germ line gene therapy)目目 录录1.基因置换基因置换2.基因修饰基因修饰3.基因修正基因修正4.基因失活基因失活基因治疗包括以下几个方面：基因治疗包括以下几个方面：