酿酒酵母产泛酸工程菌株的构建与诱变

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1、酿酒酵母产泛酸工程菌株的构建与诱变孙杰;姜杰;任郑;魏春 【摘要】泛酸具有重要的生理功能,参与糖、脂肪、蛋白质及能量的代谢，广泛用作 微生物药物、食品添加剂和饲料添加剂.通过强化酿酒酵母泛酸生物合成途径的酮 泛解酸羟甲基转移酶、酮泛解酸还原酶、泛酸合成酶和多胺氧化酶的表达水平，提 高酵母泛酸合成量.在不合泛酸的培养基中培养102 h后，泛酸质量浓度达到290 pg/L.进一步对菌株BYPAN01进行微波辐照诱变，筛选到的突变株BYPAN02泛酸 质量浓度较菌株BYPAN01和BY4741分别提高了 43.3%和203.2%,达到 415.7pg/L,为实现泛酸的环保和低成本合成提供了新的思路.

2、【期刊名称】发酵科技通讯 【年(卷)，期】2017(046)003 【总页数】5页(P134-137,142) 【关键词】酿酒酵母;泛酸;表达盒;微波辐射 【作者】孙杰姜杰;任郑;魏春【作者单位】浙江工业大学生物工程学院，浙江杭州310014;浙江工业大学生物工 程学院,浙江杭州310014;浙江工业大学生物工程学院，浙江杭州I 310014;浙江工业 大学生物工程学院，浙江杭州I 310014【正文语种】中文中图分类】Q93泛酸(pantothenic acid)，又称遍多酸或维生素B5，具有手性，只有D型泛酸具 备生理活性.泛酸在生物体内同腺嘌呤、核糖核酸和磷酸等生物分子组成辅酶A.辅 酶

3、A为乙酰化反应的辅酶，参与糖、脂肪、蛋白质及能量的代谢1.泛酸广泛用作 微生物药物、食品添加剂和饲料添加剂.动物不能合成泛酸，只能通过饮食获得在 细菌和酵母中，缬氨酸合成的中间代谢物a-酮异戊酸由酮泛解酸羟甲基转移酶、 酮泛解酸还原酶和泛酸合成酶催化生成泛解酸2-3.细菌中L-天冬氨酸脱羧生成P- 丙氨酸，泛解酸和B-丙氨酸缩合生成泛酸4.酿酒酵母的生长需要外源泛酸，而 White等3发现酵母具有合成泛酸的能力，FMS1基因编码的胺氧化酶催化精胺 生成P-丙氨酸.当以葡萄糖为酿酒酵母的培养基碳源时，FMS1基因的表达受到抑 制，酵母需要依靠外源泛酸维持生长；而当酵母以甘油或乙酸作为唯一碳源时，

4、 FMS1基因表达，酵母可以从头合成泛酸3.在工业合成D-泛酸时，首先需要通过化学合成DL-泛解酸或泛解酸内酯，再进行 手性拆分，工艺复杂，产物分离困难，并且需使用大量有机溶剂5.饲料工业是泛 酸的主要应用领域.酵母细胞含有大量蛋白质和丰富的维生素，广泛应用于饲料工 业6 .本研究目的是增强酵母的泛酸合成能力，从而提供一种简单和低成本的泛酸 来源.1.1菌种与质粒S. cerevisiae BY4741(MATa, his3A1, leu2A0, met15A0, ura3A0)和泛酸含量测 试菌 Lactobacillus plantarum ATCC 8014 均购自 American t

5、ype culture collection(ATCC) ; pYES2 质粒购自 Invitrigen 公司.1.2试剂和引物Prim star HS DNA聚合酶、Taq DNA聚合酶、dNTPs、限制性内切酶Ncol 和 Hindlll、T4 DNA连接酶、100 bp plus Marker.基因组提取试剂盒、质粒提取 试剂盒、PCR产物纯化试剂盒和DNA琼脂糖凝胶回收试剂盒均购自大连TaKaRa公司.所用引物列于表1,引物名称中同一个大写字母表示一个表达盒.引物合成及 测序由上海桑尼生物科技有限公司完成.1.3培养基YPD培养基(1%酵母提取物，2%蛋白腺和2%葡萄糖)用于酵母培养和

6、感受态制备;缺少尿嘧啶的SD-Ura培养基购自北京泛基诺科技有限公司，用于重组子的筛选； 无泛酸培养基购自青岛海博生物技术有限公司.1.4方法 1.4.1酵母菌的培养摇瓶培养时，平板上挑取单克隆，接种至5 mL的SD-Ura中培养过夜.培养物离 心并用无菌水清洗后，加至50 mL的无泛酸培养基中，起始OD600 nm达到 0.05，进行培养.1.4.2泛酸合成酵母菌的构建按照Sha o等7的方法进行质粒构建.为制备基因表达盒，首先提取酿酒酵母基因 组DNA.使用表1列出的引物，用PCR分别扩增启动子GPM1p(760 bp)， TDH3p(673 bp)，TEF1p(458 bp)和PGK1p

7、(756 bp).分别将泛酸合成相关酶的编 码基因及其转录终止子ECM31(去除线粒体信号肽，1 018 bp)，PAN5(1 411 bp), PAN6(1 256 bp)和 FMS1(1 787 bp)扩增出来.PCR 反应程序为 98 变性 2 min ;98 C 10 s,60 退火15 s，扩增启动子延伸时间为1 min，扩增结构基 因延伸时间为2 min , 32个循环.扩增pYES2的质粒骨架的PCR反应程序为98 C 变性2 min ;98 C 10 s,68 C退火和延伸8 min , 32个循环.PCR反应产物进行 琼脂糖凝胶电泳，切胶回收DNA片段.使用重叠延伸PCR(O

8、E-PCR)连接4个基因表达盒.首轮PCR反应体系不加入引物， 以待连接片段互为引物和模板，反应程序为98 1变性2 min ;98 1变性10 s ,58 退火30 s,72 C延伸2 min , 20个循环.取出5 pL作为模板，加入反应体 系为50 pL的第二轮PCR反应中，使用表达盒外侧引物，PCR程序为98 1变性 2 min ;98 C 10 s,68 C退火和延伸1.5 min , 32个循环.PCR反应产物进行琼 脂糖凝胶电泳，切胶回收DNA片段.将上述4个基因表达盒（各300 ng）、线性的pYES2质粒骨架（500 ng）混合，使用 乙酸锂化学转化法进行酵母细胞转化.转化后

9、，涂布SC-Ura平板，30 C培养2 3 d后长出单菌落.将克隆随机挑入液体培养基，培养1 d,然后提取质粒DNA，使 用PCR进行阳性转化子的验证.表达质粒的菌株命名为BYPAN01.1.4.3微波诱变为进一步提高菌株的泛酸产量，进行了酵母菌的微波诱变.使用无菌水将酵母悬液 调整至107 cells/mL ,30 1下在SD-Ura培养基中进行培养.将培养物的试管插在 冰中，微波辐射数秒.微波炉输出功率850 W,2 450 MHz.辐射处理后，涂布SC- Ura 平板培养，确认质粒没有因突变而丢失.30 C培养2 d，计算致死率.致死率 =（诱变前菌落数-诱变后菌落数）/诱变前菌落数X1

10、00%.挑取突变后的50个单菌落，30 C下在试管中液体培养2 d，取上清通过微生物法 测定泛酸含量.选取泛酸产量较高的菌株进行下一轮诱变.连续进行5轮诱变，最后 轮诱变得到的菌株培养于不含泛酸的培养基中，30 C培养至96 h.泛酸产量最 高的突变株命名为BYPAN02.1.4.4微生物法测定泛酸含量以L. plantarum ATCC 8014作为测定菌株，在泛酸测定培养基中测定泛酸的含 量8.取100 pL酵母工程菌的发酵上清液于3 mL泛酸测定培养基中，121 C高 压灭菌15 min.接种50 pL植物乳杆菌，置于37 C恒温培养箱中培养，直至植物 乳杆菌的光密度不再发生变化.同时使

11、用0-60 ng泛酸标准品，制作泛酸含量与 植物乳杆菌生长状况的标准曲线.通过测定植物乳杆菌在640 nm的光密度，间接 测定泛酸含量.2.1酿酒酵母泛酸合成基因的克隆与表达盒组装从酵母基因组中扩增了 4个组成型启动子和4个带有终止子的泛酸合成基因（图1a），通过 OE-PCR方法，在体外成功组装了 GPM1p-ECM31，TDH3p-PAN5， TEF1p-PAN6和PGK1p-FMS14个表达盒（图1b）.同时扩增pYES2质粒骨架.4个 表达盒与质粒骨架之间有45 bp左右碱基互相重叠.2.2增强酿酒酵母泛酸的合成本实验使用组成型强启动子，过表达泛酸合成途径的酮泛解酸羟甲基转移酶、酮泛

12、解酸还原酶和泛酸合成酶.另外，葡萄糖为唯一碳源时，FMS1基因的表达受到抑 制，无法合成泛酸.而通过组成型启动子增强FMS1基因表达，可以解除葡萄糖对 酵母泛酸合成的抑制.而当培养基中同时含有乙酸钠和葡萄糖两种碳源，泛酸的合 成则不会完全被葡萄糖抑制.如图2所示，宿主菌BY4741在无泛酸平板划线，酵 母菌可以生长，但是生长并不旺盛.而通过基因改造得到的菌株BYPAN01在无泛 酸平板划线，菌株生长旺盛.说明高表达泛酸合成的相关酶，并解除葡萄糖对酵母 泛酸合成的抑制后，泛酸可以在酵母体内合成.在不含泛酸的培养基中同时含有乙酸钠和葡萄糖两种碳源，泛酸的合成不会完全被 葡萄糖抑制，原始菌株BY47

13、41在不含泛酸的培养基中培养102 h后，泛酸质量 浓度达到137.1 pg/L.相同培养时间，菌株BYPAN01的泛酸质量浓度达到290 pg/L.2.3诱变和筛选微波诱变具有正突变频率高和所选育菌株遗传性状稳定等优点9.Grundler等10 发现微波辐照对酵母细胞的生长具有较大影响.为进一步提高表达ECM31 , PAN5 , PAN6和FMS1基因的菌株的泛酸产量，进行了微波辐照诱变实验.酵母致死率和 辐射时间的关系见图3.随着辐射时间的延长，酵母的致死率升高.普遍认为酵母致 死率达到85%左右，正向突变的概率最高.当微波照射时间为85 s，酵母致死率达 到85.3%.每次诱变后，涂布

14、SC-Ura平板，确认质粒没有因突变而丢失.5轮突变-筛选之后，选取平板上较大的单菌落接种于摇瓶中，在50 mL不含泛酸 的培养基中30 C培养120 h，测定突变株的泛酸产量.通过微波辐照，筛选得到泛 酸产量提高的突变株BYPAN02.如图4(a)所示，泛酸产量提高的菌株，到达生长 平台期后的生物量较宿主菌略低.这可能与菌株BYPAN01带有强启动子驱动的 ECM31 , PAN5 , PAN6和FMS1基因，造成较大的代谢负担有关.如图4(b)所示， 在培养102 h后，突变株BYPAN02泛酸质量浓度较BYPAN01和BY4741菌株 分别提高了 43.3%和203.2%，达到415.7

15、 凹/L.然而该产量仍然较低，下一步需 要对中心代谢途径进行改造，结合发酵培养优化，进一步提高泛酸产量.泛酸具有重要的生理功能，是重要的营养补充剂.笔者尝试使用代谢工程改造的酵 母合成泛酸.将带有强启动子驱动的泛酸合成相关基因ECM31 , PAN5 , PAN6和 FMS1基因构建菌株BYPAN01.在不含泛酸的培养基中培养102 h后，泛酸质量 浓度达到290 pg/L.进一步对菌株BYPAN01进行微波辐照诱变.筛选到的突变株 BYPAN02泛酸质量浓度较BYPAN01和BY4741菌株分别提高了 43.3%和 203.2%，达到415.7 pg/L.然而该产量仍然较低，下一步需要对中心

16、代谢途径进 行改造，结合发酵培养优化，进一步提高泛酸产量，才有可能具备应用价值.【相关文献】1 WILLIAMSON J M, BROWN G M. Purification and properties of L-Aspartate-alpha- decarboxylase, an enzyme that catalyzes the formation of beta-alanine in Escherichia coliJ. Journal of biological chemistry, 1979, 254(16):8074-8082.2 SCHMITZBERGER F, SMITH A

17、 G, ABELL C, et al. Comparative analysis of the Escherichia coli ketopantoate hydroxymethyltransferase crystal structure confirms that it is a member of the (pa)8 phosphoenolpyruvate/pyruvate superfamilyJ. Journal of bacteriol, 2003, 185:4163-4171.0d6rm6LsLn17 货6o-o(Dt;cuqMo -cuuno.s=ou 虺 ip 一(DlpsI

18、JJs-s(Dq+-usDu-ucu-甲cuACDgLJNVNOKOWJ .0080I46z.0L(17D9Z.TI00z FIS 沱ip 一料一 6o_oqM。2no5 U_E*S Eo4= uot;npodDuccu-cu(DqMo AcuMqxd -OUcu6U-OU- s-s(Dq+-usoq pucuuc(Dq+-o+-ucud 00c pM。迪q&捋 s 一 %_SE8 S8EO32SIN01_rd n_lznNnDIM ILIHMS(睡真品膏m) .99?m9oo(0I/6)1717、686IO6unlpsn右uMlpslQz5S 迪 uo_ouo.yE ISCUM PCDX-M=捋0一 uottD*Dcumoee+-ucuuos -m- N NVIAnlUJxKUJKlNnKD 5己.寸鸣二 8LS666I 、碧溯旱卅霆.s .挪坦黑.1、成必炀O7J.1、畏环或湛OOJ .9IW(z)z.m、600z_CUCUDSa5Ma5d -料一 ECDlpoqMo uotinnsuou PECU0MPO ucu、D-qEDsscuZQIOVHZIOVHZ、z OVHS E .ZOI法0&)Ln17、9IOZR?1世慈盥我.s积酒泾前盥H-坦世怅卅盥我检回眉却湛、e祁赢、期施理9