细胞融合技术14781

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1、细胞融合技术 细胞融合技术是用自然的或人为的方法，使种类不同的两种生物细胞直接融合，产生能够同时表达二者有益性状新杂种细胞的技术。自然进行的细胞融合，即卵子和精子受精形成合体，只能发生在同一种生物或亲缘关系很近的生物种之间。然而，细胞融合技术的问世不仅为细胞学、遗传学的研究提供了有力的手段，而且开创了动物、植物育种和工业生产的新局面。简介 有性繁殖时发生的精卵结合是正常的细胞融合，即由两个配子融合形成一个新的二倍体。而细胞融合为在自然条件下或用人工方法（生物的、物理的、化学的）使两个或两个以上的细胞合并形成一个细胞的过程。其中人工诱导的细胞融合，在六十年代作为一门新兴技术而发展起来。由于它不仅

2、能产生同种细胞融合，也能产生种间细胞的融合，因此细胞融合技术目前被广泛应用于细胞生物学和医学研究的各个领域。基因型相同的细胞融合成的杂交细胞称为同核体（homokaryon）；来自不同基因型的杂交细胞则称为异核体（heterokaryon）。2 融合技术 人工细胞融合一般都采用化学和物理因素的诱导技术。如目前化学诱导常用促融合剂聚乙二醇(PEG);物理诱导采用电融合。为了改善和提高细胞融合的有效性，植物和微生物细胞的融合必须先除去细胞壁，使其成为原生质体。因此，对于植物和微生物来讲，细胞融合常被称为原生质体融合。细胞融合技术是在 20 世纪 60 年代建立和发展起来的。1960 年，首先发现两

3、种不同类型的细胞，在混合培养过程中，会自发融合形成融合细胞。同时发现，紫外光灭活的仙台病毒可以诱发艾氏腹水瘤细胞相互融合。1965 年，采用灭活的仙台病毒诱导产生了第一个种间异梭体。一年后，又进一步使用仙台病毒获得了能够增殖的杂种细胞。此后，人工诱导体细胞融合方法作为一种新的生物工程技术已广泛地用于种内、种间、属间、科间乃至动、植物的杂种细胞的构建。该法无论在生物学的基础理论研究方面，或工、农、医等应用方面，均具有广阔的前景。1 历史发展 19 世纪 30 年代，科学家们相继在肺结核，天花，水痘，麻疹等疾病患者的病理组织中观察到多核细胞。19 世纪 70 年代，科学家们在蛙的血细胞中也看到了多

4、核细胞的现象，但是当时科学发展水平的限制，没有给予足够重视。1962 年，日本科学家发现日本血凝型病毒能引起艾氏腹水瘤细胞融合的现象。1965 年，英国科学家进一步证实了灭活的病毒在适当的条件下也可以诱发动物细胞融合。后来科学家又成功诱导了不同种动物的体细胞融合，并且能将杂种细胞培养成活。细胞融合技术不断改进，现在已广泛应用于细胞学，遗传学，免疫学，病毒学等多种学科的研究工作中。意义价值 细胞融合不仅可用于基础研究，而且还有重要的应用价值，在植物育种方面已经成功的有萝卜+甘蓝、粉蓝烟草+郎氏烟草、番茄+马铃薯等等。细胞融合另一个重要应用就是制备单克隆抗体。单克隆抗体可以用作诊断试剂，治疗疾病和

5、运载药物，具有准确，高效，简易，快速等优点。理论上说任何细胞，都有可能通过体细胞杂交而成为新的生物资源。这对于种质资源的开发和利用具有深远的意义。融合过程不存在有性杂交过程中的种性隔离机制的限制，为远缘物种间的遗传物质交换提供了有效途径。体细胞杂交产生的杂种细胞含有来自双亲的核外遗传系统，在杂种的分裂和增殖过程中双亲的叶绿体、线粒体 DNA 亦可发生重组，从而产生新的核外遗传系统。淋巴细胞杂交瘤和单克隆抗体的制备。细胞融合技术 使不同来源的细胞原生质体结合并增生或形成新生物体的技术，又称原生质体融合技术。动物细胞无细胞壁，可直接诱导融合；植物细胞进行融合时，必须先除去细胞壁。例如两种不同植物的

6、体细胞，如叶，子叶、下胚轴、根、愈伤组织或悬浮培养的细胞，经纤维素酶、果胶酶等酶类消化可除去细胞壁。使不同来源的细胞原生质体结合并增生或形成新生物体的技术，又称原生质体融合技术。动物细胞无细胞壁，可直接诱导融合；植物细胞进行融合时，必须先除去细胞壁。例如两种不同植物的体细胞，如叶，子叶、下胚轴、根、愈伤组织或悬浮培养的细胞，经纤维素酶、果胶酶等酶类消化可除去细胞壁。然后诱导进行融合，使形成杂种细胞，更进一步在合适的培养条件下，诱导其持续地进行细胞分裂，形成细胞团、愈伤组织或胚状体，最后发育成完整的杂种植株。细胞融合过程 包括两个原生质体的接触、粘连、膜融合、细胞质融合，进而两个核同步分裂发生核

7、融合，可分为同源融合和异源融合两类。同源融合 同一物种细胞在原生质体分离过程中，常自发融合，故称自发的同源融合。同种细胞若只有胞质融合，尚未发生核融合时，则在细胞中含有两个或两个以上遗传上完全相同的核，称为同核体；同源融合中胞质和核如均发生融合，则可形成同源多倍体。自发融合的频率一般较低。异源融合 是不同物种原生质体在融合诱导剂或电场的作用下发生的融合，又称诱导融合。当核尚未融合，双亲的核共存于一个杂种细胞内，称为异核体；双亲细胞核如同步分裂，进一步发生核融合，则产生共核体，即核杂种。诱导融合的频率一般较高。由于融合的杂种来自体细胞，与通常性细胞结合的有性杂交不同，故称体细胞杂交，由此产生的杂

8、种称体细胞杂种或准性杂种。作为一种特例，近年来也有用体细胞与性细胞（如从花粉四分体分离原生质体）进行融合的，这种融合称为体细胞或配子细胞融合，在烟草上已有用此产生可育三倍体杂种的成功报道。广义的细胞杂交还包括原生质体吸收外源遗传物质如 DNA、RNA、叶绿体、线粒体、染色体等。异源融合的细胞要从双亲细胞和同源融合的细胞中挑选出来，必须要有合适的选择体系。迄今建立的选择体系不外两大类。根据双亲细胞的形态特征，用不同荧光染料标记，人工挑选，或用机械（如荧光激活细胞分拣机）分离异核体，进行单独培养；在合适的选择压下，只允许杂种细胞生长，淘汰双亲细胞和同源融合的细胞。如生长激素自主选择，代谢互补选择，

9、白化互补选择，营养和药物抗性互补选择，营养缺陷互补选择等，这些方法各有其适用范围和局限性。过去使用 NaNO3、仙台病毒、人造海水等作为融合诱导剂，融合频率极低。1973 年凯洛（Keller）和梅尔彻斯（Melchers）首次用高 Ca2、高 pH 诱导融合，融合频率大大提高。1974 年高国楠和米蔡卢克（Mi-chayluk）首先报告用聚乙二醇（PEG）诱导融合。这种 PEG 法，不仅推动了植物细胞融合研究的发展，而且也已在动物细胞及微生物的融合上被广泛采用。近年，更多的是将 PEG 法和高 Ca2、高 pH法结合使用。PEG 的作用是把相邻的原生质体拉在一起，在 PEG 分子被稀释洗去时

10、发生膜融合。原生质体一般带负电，Ca2在相邻的原生质体之间可能起分子桥的作用，从而增加它们的接触的粘连，促进膜融合。将原生质体置融合小室中，在交变电场作用下，原生质体由于双向泳动，排成串珠状，质膜相互接触，用直流脉冲瞬间处理，也能使原生质体融合，称电融合。其优点是操作简易，不受操作者经验和素质的限制；融合过程短，不需花长时间洗去 PEG 等对细胞有害的物质；尤为重要的是可通过选择亲本细胞种类和改变电场参数，控制和提高人们所期望的双亲细胞 11 融合的比例，这显然比化学融合法中的随机融合前进了一步。常规有性杂交为作物品种改良作出了巨大贡献。为扩大作物品种的遗传背景，育种家们试图从近缘或远缘物种中

11、寻找各种有利性状，如抗逆性，抗病虫性等等。亲缘关系较远的物种之间进行有性杂交，往往因精子和卵子不能结合，或者虽能受精，但胚胎早期败育，而不能得到杂种。这种现象称为有性杂交中的不亲和性。体细胞融合的目的之一，就是试图避开生殖细胞的受精过程，在一定程度上克服了有性杂交中的不亲和性的障碍，使基因在远缘的物种之间转移，从而创造新类型或新品种，或大大丰富育种用的原始材料。自 1972 年卡尔森（Carlson）在烟草上获得第一个种间体细胞杂种以来，迄今已有 90 多个组合的种间、属间体细胞杂种问世，显示出它在理论研究和作物品种改良实践中的重要作用。通过体细胞杂交，可以创造自然界中没有的新物种。如马铃薯和

12、番茄融合，得到薯番茄和番茄薯，这是迄今通过有性杂交未能获得的属间杂种。甘蓝与白菜融合，使两个亲本的染色体组相加，人工合成了甘蓝型欧洲油菜，在实验室中短时间内重复出现了自然界的进化过程，使芸苔属的三角进化关系又一次得到验证。现在把这种双亲全套基因组相加而无染色体丢失的杂种称为对称杂种，而把一个亲本或双亲的染色体出现部分丢失的杂种称为不对称杂种。在拟南芥菜与白菜型油菜融合产生的杂种拟南芥油菜中，既有对称杂种，又有不对称杂种。细胞融合的应用 转移部分基因（组）早期的一些研究工作，多将重点放在远缘物种之间的融合上，设想通过融合将两者的染色体组相加。事实上这方面存在着不少问题。杂种细胞核在遗传上很不稳定

13、，常常出现严重的染色体丢失；杂种细胞不易分化成株，如科间融合至今未获得杂种植株，种间，属间即使可再生杂种植株，但体细胞杂种大多表现育种性降低；远缘双亲基因组相加，尤其是当采用野生种作为亲本之一时，常会同时带进其他许多不利性状。因此应将体细胞杂交的着眼点放在转移少数外源基因上。已成功的例子有：胡萝卜-S 欧芹融合，只转移一条欧芹染色体。胡萝卜-S 羊角芹融合，只转移了羊角芹的染色体片段。栽培茄与野生种（Solanum sisymbriifolium）融合，转移了对线虫和螨类抗性。二倍体马铃薯与二倍体野生种（S.brevidens）融合，转移了对卷叶病毒的抗性，且杂种可育。创造或改良胞质杂种 利用

14、细胞融合产生胞质杂种具有特殊价值。因为农作物的许多性状是由细胞质基因控制的，如雄性不育性、除草剂抗性等，同时胞质对作物的产量也有很重要的影响。在有性杂交中，由于花粉所带的胞质极少，因此父本对有性杂种的胞质贡献极小，难以产生胞质杂种。而在细胞融合中，双亲的细胞质都会有程度不同的贡献。双亲叶绿体在细胞融合后的命运存在着随机分离和非随机分离两种情况，即存在着一种选择过程，最终选择出的叶绿体或者是亲本甲的，或者是亲本乙的，在某些情况下，杂种中只能是某一亲本的叶绿体，未发现有叶绿体重组的情况。线粒体则不同，已有大量重组的证据。研究表明，叶绿体和线粒体的分配是独立的，因此有可能通过细胞融合获得细胞核、叶绿体、线粒体基因组的不同组合，这在育种上具有重要价值。如通过融合已获得具油菜叶绿体和萝卜胞质不育特性的春油菜，以及具白菜叶绿体（编码除草剂抗性、抗三嗪）和萝卜胞质不育特性（由线粒体基因组控制）的胞质杂种。萝卜胞质不育油菜的低温敏感性通过导入油菜或白菜叶绿体得到了改良，它们在 12低温下不会黄化。在油菜雄性不育系的改良上，也已通过融合将线粒体基因组控制的雄性不育性和叶绿体基因组编码的除草剂抗性（抗三嗪）结合在一起。这是在常规有性杂交中无法做到的，因为两种细胞器均为母性遗传。体细胞杂交是有性杂交的补充和发展，充分认识细胞融合的特点及其限制，扬长避短，将有助于在作物品种改良中作出应有的贡献。