DNA序列测定PPT课件

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1、 即即核酸核酸DNA分子一级结构的测定，是现代分子生物学一项分子一级结构的测定，是现代分子生物学一项重要的技术重要的技术。1963年，年，和和等人第一次完成胰岛素等人第一次完成胰岛素51个个氨基酸的序列测定，这在当时来说是一件了不起的大事。氨基酸的序列测定，这在当时来说是一件了不起的大事。70年年代后期，代后期，和和等人又建立了核酸序列测等人又建立了核酸序列测定的方法，定的方法，Sanger双脱氧末端终止法和双脱氧末端终止法和Maxam-Gilbert化学化学裂解法将核酸序列测定技术推进到裂解法将核酸序列测定技术推进到“直读直读”阶段，使核酸序列阶段，使核酸序列测定变得远比蛋白质氨基酸序列测定

2、容易，这样人们可以通过测定变得远比蛋白质氨基酸序列测定容易，这样人们可以通过核酸序列和遗传密码推导出蛋白质氨基酸的序列。核酸序列和遗传密码推导出蛋白质氨基酸的序列。在四种反应体系中，寡聚核苷酸分别终止于不同位在四种反应体系中，寡聚核苷酸分别终止于不同位置的置的A、T、G或或C碱基，将待测碱基，将待测DNA片段转变成一系列放片段转变成一系列放射性核素标记的单链射性核素标记的单链DNA片断，并使其一端为一固定的片断，并使其一端为一固定的末端，而另一端由于长度不同，成为一系列相差末端，而另一端由于长度不同，成为一系列相差1个碱基个碱基的连续末端。经电泳分离，放射自显影，可直接读出的连续末端。经电泳分

3、离，放射自显影，可直接读出DNA的序列。的序列。通过测定对突变进行定位和鉴定，应用时测定野通过测定对突变进行定位和鉴定，应用时测定野生型基因上同源区和突变体的相应序列直接在一张胶片上比较二者序生型基因上同源区和突变体的相应序列直接在一张胶片上比较二者序列差异。（已知基因序列）列差异。（已知基因序列）目的是提供一段目的是提供一段DNA准确的核苷酸序列。（未知基准确的核苷酸序列。（未知基因序列）因序列）对已知基因序列检查，特别是有遗传倾向的病例检测相关基因对已知基因序列检查，特别是有遗传倾向的病例检测相关基因有无突变，有助于阐明疾病发病机理及建立相应诊疗方案。有无突变，有助于阐明疾病发病机理及建立

4、相应诊疗方案。对已经克隆的未知序列进行测定，从而阐明该基因的一级结构，对已经克隆的未知序列进行测定，从而阐明该基因的一级结构，如人类基因组计划中大量的工作是要阐明克隆片段的核苷酸的排列顺如人类基因组计划中大量的工作是要阐明克隆片段的核苷酸的排列顺序。序。测序目的不同或靶测序目的不同或靶DNA片段大小有区别，则序列分析的具体方案片段大小有区别，则序列分析的具体方案有所不同，所以测序之前应根据相应情况制订序列测定的策略，这个有所不同，所以测序之前应根据相应情况制订序列测定的策略，这个问题在后面将涉及到，但由于学时限制，不可能完全展开来讲，请同问题在后面将涉及到，但由于学时限制，不可能完全展开来讲，

5、请同学参看相关书籍。学参看相关书籍。不管是上述哪一种方法，测序基本过程如下：不管是上述哪一种方法，测序基本过程如下：（P255,图图10-2）解决了质粒问题，节省了时间，解决了质粒问题，节省了时间，但缺乏灵活性。但缺乏灵活性。以酶学测序反应或（和）放标测序以酶学测序反应或（和）放标测序产物为基础，微机处理。产物为基础，微机处理。使极少数测序产物线性放大。使极少数测序产物线性放大。60.-180.￥，搞定。￥，搞定。当当3-OH由于脱氧或被取代，下一个核苷酸不能通过由于脱氧或被取代，下一个核苷酸不能通过5磷酸形成磷酸形成3，5磷酸二酯键，使链的延伸反应终止在这个异常的核苷酸处。如果用相磷酸二酯键

6、，使链的延伸反应终止在这个异常的核苷酸处。如果用相同的同的4组引物组引物-模板混合物，每一组加模板混合物，每一组加4种种dNTP，其中，其中1种用种用32P（或（或35S）标记，加标记，加1种种ddNTP，每组将产生一种特异性的以，每组将产生一种特异性的以ddNTP为末端的不同为末端的不同长度的核苷酸链，经长度的核苷酸链，经PAGE分离，即可读出被测定的全部顺序（分离，即可读出被测定的全部顺序（dNTP和和ddNTP竞争结合底物）。（竞争结合底物）。（P255，图，图10-2）在在DNA合成时，利用合成时，利用ddNTP与与dNTP竞争掺入到竞争掺入到新生的新生的DNA链上使链终止的原理。即在

7、链上使链终止的原理。即在A、C、G、T 4种反应体系中，分别加入不同的种反应体系中，分别加入不同的ddNTP，其他试剂相，其他试剂相同，经酶促合成反应，生成具有相同的同，经酶促合成反应，生成具有相同的5末端，而末端，而3不不同的同的DNA片段的混合物。经电泳分离，放射自显影，片段的混合物。经电泳分离，放射自显影，直接读出直接读出DNA的核苷酸序列。的核苷酸序列。酶促测序反应中利用一个与模板特定序列互补的合成寡核苷酶促测序反应中利用一个与模板特定序列互补的合成寡核苷酸作为酸作为DNA合成的引物。合成的引物。在许多情况下可将靶在许多情况下可将靶DNA片段克隆于片段克隆于M13噬菌体或噬菌粒载噬菌体

8、或噬菌粒载体，以取得单链体，以取得单链DNA分子作为模板。也可用分子作为模板。也可用Sanger法测定变性双法测定变性双链链DNA模板序列（如变性质粒模板序列（如变性质粒DNA）。以上两种情况都可以采用）。以上两种情况都可以采用能与位于靶能与位于靶DNA侧翼的载体序列相退火的通用引物，不必取得与侧翼的载体序列相退火的通用引物，不必取得与未知未知DNA序列互补的引物。序列互补的引物。M13噬菌体重组子的通用测序引物一噬菌体重组子的通用测序引物一般长般长15-29bp，与紧靠，与紧靠M13mp18多克隆位点区的多克隆位点区的HindIII或或M13mp19多克隆位点区多克隆位点区EcoRI位点的序

9、列互补。这些引物同样也位点的序列互补。这些引物同样也可用于可用于PUC质粒的质粒的DNA进行进行“双链双链”测序，并且已经商品化。测序，并且已经商品化。纯单链纯单链DNA和经过热变性或碱变性的双链和经过热变性或碱变性的双链DNA都可以都可以用作用作Sanger法测定的模板。模板的质量和所用的法测定的模板。模板的质量和所用的DNA聚合聚合酶的种类是至关重要的。酶的种类是至关重要的。通常采用通常采用M13噬菌体颗粒分离到的单链噬菌体颗粒分离到的单链DNA模板效果模板效果最佳，用变性双链最佳，用变性双链DNA作模板则难获此效果。小量制备质作模板则难获此效果。小量制备质粒粒DNA常被寡核苷酸小分子，核

10、糖核苷酸及常被寡核苷酸小分子，核糖核苷酸及DNA聚合酶抑聚合酶抑制剂所污染，前两者可被用作随机引物，造成假象和强终制剂所污染，前两者可被用作随机引物，造成假象和强终止现象，使测序胶含糊不清。采用小量制备质粒止现象，使测序胶含糊不清。采用小量制备质粒DNA测定测定未知未知DNA克隆片段的序列，并不可取，如果用克隆片段的序列，并不可取，如果用CsCl-溴化乙溴化乙锭梯度离心结果纯化质粒锭梯度离心结果纯化质粒DNA，测序结果会好得多，但又，测序结果会好得多，但又耗费大量的人力和物力。耗费大量的人力和物力。因为因为DNA是相当大的分子，一般由几是相当大的分子，一般由几kb组成，最小的质粒和病毒组成，最

11、小的质粒和病毒也在也在1kb以上，而测序的最好方法，一次也只能测几百个以上，而测序的最好方法，一次也只能测几百个bp（以（以300-500bp为好，为好，300bp最佳），所以测序前，可以用最佳），所以测序前，可以用2种限制酶消化待测种限制酶消化待测DNA，使其降解成小片段，用琼脂糖凝胶电泳分离回收。回收片段，使其降解成小片段，用琼脂糖凝胶电泳分离回收。回收片段，如果超过如果超过700-800bp，则进行第二次限制酶消化，再次分离回收。然，则进行第二次限制酶消化，再次分离回收。然后分别测定每个片段的顺序。由于两种限制酶在后分别测定每个片段的顺序。由于两种限制酶在DNA链上的切点位置链上的切点位

12、置不同，产生的片段之间有交错重叠顺序，据不同，产生的片段之间有交错重叠顺序，据2片段的这种末端重叠现片段的这种末端重叠现象，用计算机定出各片段的位置，而排出象，用计算机定出各片段的位置，而排出DNA的全部序列。的全部序列。在测序中，小片段在测序中，小片段DNA只需直接克隆到只需直接克隆到M13mp或者质粒载体中，或者质粒载体中，进行双链或单链模板测序。现在常用的进行双链或单链模板测序。现在常用的M13mp载体一般是成对设计，载体一般是成对设计，如如M13mp18与与M13mp19都有相同的多克隆位点，但方向相反。同一都有相同的多克隆位点，但方向相反。同一待测的待测的DNA片段分别克隆到这两个载

13、体中，用一通用引物进行测序。片段分别克隆到这两个载体中，用一通用引物进行测序。对于数对于数kb大片段大片段DNA分子，则有几种策略，如定向克隆，内部片段克分子，则有几种策略，如定向克隆，内部片段克隆，原位亚克隆，包含上述用隆，原位亚克隆，包含上述用2种限制酶消化种限制酶消化DNA等。等。-是寄生在细菌的病毒。存在是寄生在细菌的病毒。存在3种状态，有尾种状态，有尾20面体，无尾面体，无尾20面体和丝状单链噬菌体（面体和丝状单链噬菌体（filamentous），），M13是一类雄性特异的大肠杆是一类雄性特异的大肠杆菌噬菌体，含单链环状的菌噬菌体，含单链环状的DNA。它感染细菌（宿主菌）呈溶原状态生

14、长，在。它感染细菌（宿主菌）呈溶原状态生长，在菌体内形成过渡阶段双链环状复制型菌体内形成过渡阶段双链环状复制型DNA（Replicative form DNA，RF DNA），在适当的条件下，可以扩增至数百个拷贝。成熟的噬菌体成为单链），在适当的条件下，可以扩增至数百个拷贝。成熟的噬菌体成为单链（正链、（正链、RF则以正链为模板复制则以正链为模板复制1条链，再以此链复制正链）分泌到培养液条链，再以此链复制正链）分泌到培养液中。因此双链中。因此双链DNA（RF）可以按质粒提取方法从细菌细胞中制备，做为克隆）可以按质粒提取方法从细菌细胞中制备，做为克隆所用的载体。从培养上清液提取成熟的单链所用的载

15、体。从培养上清液提取成熟的单链DNA做为测序模板。做为测序模板。在感染过程中，在感染过程中，M13并不杀死细胞，但细胞的生长受到某种程度抑制。并不杀死细胞，但细胞的生长受到某种程度抑制。dsDNA复制又产生大量的复制又产生大量的ssDNA，它被，它被1个外壳蛋白包装成成熟的噬菌体，个外壳蛋白包装成成熟的噬菌体，在细胞生长的过程中，子代噬菌体颗粒释放出来，这是在细胞生长的过程中，子代噬菌体颗粒释放出来，这是M13不同于其他噬菌不同于其他噬菌体的特点。每体的特点。每ml培养液沉淀的噬菌体可提取培养液沉淀的噬菌体可提取5-10mgssDNA，产量是很高的。，产量是很高的。用作克隆载体，用作克隆载体，

16、M13有有1个得天独厚的优点，即可产生大量含有外源个得天独厚的优点，即可产生大量含有外源DNA其其中中1条链的条链的DNA分子，后者可在下列工作中充作模板：分子，后者可在下列工作中充作模板：都是从同一重组都是从同一重组M13mp1改造而来。改造而来。在基因在基因II-IV（500bp，570bp左右）之间有左右）之间有1个多克隆位点个多克隆位点（multiple cloning sites，MCS）可供外源基因插入。）可供外源基因插入。该区域（该区域（MCS）插入了）插入了1小段小段Ecoli.DNA，有，有-半乳糖苷酶基因半乳糖苷酶基因（LacZ）的调控序列及其）的调控序列及其N端端146个

17、个aa编码信息，它与宿主菌（含编码信息，它与宿主菌（含LacZ）-互补，形成有活性的互补，形成有活性的-半乳糖苷酶，使平板上底半乳糖苷酶，使平板上底X-gal生色成蓝噬菌斑，生色成蓝噬菌斑，当外源基因插入当外源基因插入MCS，破坏了，破坏了-互补，几乎无一例外生成无色（白）噬斑。互补，几乎无一例外生成无色（白）噬斑。这是一种非常有效的克隆筛选选择性标志。这是一种非常有效的克隆筛选选择性标志。是一对载体，它们有相同的是一对载体，它们有相同的13个多克隆个多克隆位点，但方向相反。（当位点，但方向相反。（当RF DNA被两种限制酶切割后，被两种限制酶切割后，M13mp18和和M13mp19轻易不能重

18、新环化，当连接混合液中含外源匹配末端轻易不能重新环化，当连接混合液中含外源匹配末端dsDNA片片段时方闭合成环，这一片段在二者中将以互为相反的两个方向插入。这样段时方闭合成环，这一片段在二者中将以互为相反的两个方向插入。这样M13mp18正链中含有外源正链中含有外源DNA的一条链，而在的一条链，而在M13mp19正链中含外源正链中含外源DNA的另一条链）。所以的另一条链）。所以M13mp18和和M13mp19作为一对载体可用同一通作为一对载体可用同一通用引物，（从所插入用引物，（从所插入DNA片段任一端开始），测定互为相反两条链的片段任一端开始），测定互为相反两条链的DNA序列。（并可制备只与

19、外源序列。（并可制备只与外源DNA任意任意1条条DNA链互补的探针）。（分子克链互补的探针）。（分子克隆隆P202）。）。测定数测定数kb的的DNA序列时，可以建立一系列一端删切序列时，可以建立一系列一端删切200-300bp的的DNA片段次级克隆。对它们分别测序，就可以连续读出该大片段片段次级克隆。对它们分别测序，就可以连续读出该大片段DNA的全部序列。核酸酶的全部序列。核酸酶BAL31和核酸外切酶和核酸外切酶III，均可以达到连续删切的目，均可以达到连续删切的目的。的。-是从乳白短杆菌（是从乳白短杆菌（Brevibacterium albidum）细）细菌中分离。它能以渐进的方式将线型菌中

20、分离。它能以渐进的方式将线型DNA分子的分子的3，5两端同时降解，两端同时降解，形成小的寡核苷酸片段或单核苷酸。底物可以是带延伸末端的，也可以形成小的寡核苷酸片段或单核苷酸。底物可以是带延伸末端的，也可以是平头末端的是平头末端的dsDNA，对，对3，5两端降解有同样性，此酶要求两端降解有同样性，此酶要求Ca2+作辅作辅因子，以因子，以EDTA作螯合剂，可使该酶失活。作螯合剂，可使该酶失活。BAL31还有较弱的单链特异内切酶活性，与核酸酶还有较弱的单链特异内切酶活性，与核酸酶S1相似，降解相似，降解ssDNA或或ssRNA形成形成5磷酸末端的单或寡核苷酸酶片段，能从磷酸末端的单或寡核苷酸酶片段，

21、能从DNA片片段中切除单链尾巴，产生平头末端。核酸酶段中切除单链尾巴，产生平头末端。核酸酶S1是从米曲霉是从米曲霉（Aspergillus Oryze）中分离的。）中分离的。-是一种从是一种从E.coli中分离，从中分离，从dsDNA的的3-OH末端降末端降解产生解产生5单核苷酸的外切酶。（此外，外核酸酶单核苷酸的外切酶。（此外，外核酸酶III还有内核酸酶，还有内核酸酶，RnaseH和和3-磷酸酶的活性。磷酸酶的活性。Klenow大片段大片段-DDDPI是由分子量是由分子量109KD一条多肽链组成，此酶可被一条多肽链组成，此酶可被枯草杆菌蛋白酶分解成枯草杆菌蛋白酶分解成2个片段，个片段，1个片

22、段分子量为个片段分子量为76KD，有聚合酶，有聚合酶，35外切酶活力，此片段称为外切酶活力，此片段称为Klenow片段，另一片段片段，另一片段34KD，有，有5外切外切酶活力。酶活力。此酶是末端终止法最早采用的酶，用它进行测序常常产生较高的本底和此酶是末端终止法最早采用的酶，用它进行测序常常产生较高的本底和假带，催化链延伸反应的能力也较差，通常只能读出距引物假带，催化链延伸反应的能力也较差，通常只能读出距引物250个核苷酸以个核苷酸以内的序列。此酶价格便宜，容易获得，对于已知序列内的序列。此酶价格便宜，容易获得，对于已知序列DNA次级克隆的鉴定次级克隆的鉴定仍有应用价值。仍有应用价值。测序酶是

23、经过改造的测序酶是经过改造的T7噬菌体噬菌体DNA聚合酶，消除了聚合酶，消除了35外切酶活性。外切酶活性。活性非常稳定，具有很高的链延伸能力和极快的聚合反应速度，是测定较长活性非常稳定，具有很高的链延伸能力和极快的聚合反应速度，是测定较长DNA序列的首选酶。该酶及名称是序列的首选酶。该酶及名称是HSB公司的专利。试剂盒已商品化。公司的专利。试剂盒已商品化。Taq酶用于序列测定，除具有很好的链延伸性能外，还可以在高温酶用于序列测定，除具有很好的链延伸性能外，还可以在高温（70-80）进行反应的优点，因而能克服富含）进行反应的优点，因而能克服富含GC序列的模板形成自身二序列的模板形成自身二级结构对

24、测定的影响，将级结构对测定的影响，将PCR与末端终止法测序结合进行，只需少量模板。与末端终止法测序结合进行，只需少量模板。传统传统32P-dNTP，由于，由于32P衰变过程中产生高能的衰变过程中产生高能的射线，导致射线，导致放射自显影图谱条带扩散，分辨率低，限制了识读序列的数量。放射自显影图谱条带扩散，分辨率低，限制了识读序列的数量。另外，由于另外，由于32P对对DNA样品辐射分解作用很强，通常都在测序反应样品辐射分解作用很强，通常都在测序反应后后24小时内上样电泳，否则无法得到满意的结果。小时内上样电泳，否则无法得到满意的结果。-32S-dNTP近年来得到广泛使用，它解决了近年来得到广泛使用

25、，它解决了32P的两大缺点，的两大缺点，具有很高的分辨率，较低的本底。测序反应产物具有很高的分辨率，较低的本底。测序反应产物-20保存一周并保存一周并不明显影响反应结果。不明显影响反应结果。（一）制胶（一）制胶（二）模板变性（双链）（二）模板变性（双链）（三）测序反应（三）测序反应 1、模板引物退火、模板引物退火 2、链延伸、链标记、链终止反应、链延伸、链标记、链终止反应 3、上样电泳、上样电泳 4、读片（序）、读片（序）（分子克隆（分子克隆P640）（必须经过实践才能获得技巧）（必须经过实践才能获得技巧）1、将待测、将待测DNA与与M13mp载体相连，构成重组体。载体相连，构成重组体。2、用

26、两种限制酶从待测、用两种限制酶从待测DNA片段的一端与载体序列之片段的一端与载体序列之间将间将DNA切断，产生线性切断，产生线性DNA，使近待测，使近待测DNA片段的一端片段的一端为为5突出末端，近载体一端为突出末端，近载体一端为3突出末端。突出末端。3、外切核酸酶、外切核酸酶从从5突出末端消化待测突出末端消化待测DNA，37C时，每分钟水解时，每分钟水解250个核苷酸个核苷酸 4、核酸酶、核酸酶SI去除残余单链，自我环化，转化或转染宿去除残余单链，自我环化，转化或转染宿主菌得到次级克隆。主菌得到次级克隆。5、将各克隆用于测序。、将各克隆用于测序。（三）引物延伸法（三）引物延伸法 是一种定向测

27、序法，从是一种定向测序法，从DNA的的3依赖特定引依赖特定引物延伸测定一段物延伸测定一段DNA序列，再根据测得序列设计序列，再根据测得序列设计新的引物，作下一延伸反应的引物，如此向前推新的引物，作下一延伸反应的引物，如此向前推进，最终测得进，最终测得DNA的全长序列。的全长序列。（直读，（直读，Sanger双脱氧末端法也是直读法）双脱氧末端法也是直读法）法是法是Maxam和和Gilbert等人等人1977年创建的，用来测定年创建的，用来测定DNA序序列。列。化学法是用化学试剂在化学法是用化学试剂在A、G、C、T处特定地裂解处特定地裂解DNA片段，产生一簇各种长度的短链（等差数列片段，产生一簇各

28、种长度的短链（等差数列 n=1），经过），经过PAGE和放射自显影后，可以直接读出和放射自显影后，可以直接读出DNA的顺序。的顺序。某些试剂能修饰或破坏某些试剂能修饰或破坏DNA链上特定核苷酸的碱基进而链上特定核苷酸的碱基进而使使N-糖苷键断裂，暴露出的糖环以糖苷键断裂，暴露出的糖环以-消除反应，在消除反应，在3和和5位位上断裂磷酸二酯键。使戊糖脱落，用于嘌呤环的试剂是硫酸上断裂磷酸二酯键。使戊糖脱落，用于嘌呤环的试剂是硫酸二甲酯，而联氨可用于肼解嘧啶环。二甲酯，而联氨可用于肼解嘧啶环。4种核苷酸的特异裂解种核苷酸的特异裂解和鉴别方法如下：和鉴别方法如下：G反应反应-硫酸二甲酯（硫酸二甲酯（D

29、MS）使）使GN7甲基化，其后断开甲基化，其后断开了了C8-C9间的化学键，哌啶置换了被修饰鸟嘌呤与核糖的结合。间的化学键，哌啶置换了被修饰鸟嘌呤与核糖的结合。G+A反应反应-（哌啶）甲酸使嘌呤环上氮原子质子化，削（哌啶）甲酸使嘌呤环上氮原子质子化，削弱了嘌呤脱氧核糖核苷酸和腺嘌呤脱氧核糖核苷酸的糖苷键，弱了嘌呤脱氧核糖核苷酸和腺嘌呤脱氧核糖核苷酸的糖苷键，然后哌啶置换了嘌呤。然后哌啶置换了嘌呤。T+C反应反应-肼断开了嘧啶环，产生碱基片段被哌啶置换。肼断开了嘧啶环，产生碱基片段被哌啶置换。C反应反应-在在NaCl存在时，只有存在时，只有C才能与肼发生反应，随后，才能与肼发生反应，随后，被修饰

30、的胞嘧啶被哌啶置换。被修饰的胞嘧啶被哌啶置换。限制酶消化待测限制酶消化待测DNA，得到长度为，得到长度为100-200bp的一组片段，纯化回的一组片段，纯化回收每收每1个片段作为测序材料。个片段作为测序材料。碱性磷酸酶处理消除碱性磷酸酶处理消除5磷酸。磷酸。多核苷酸酶催多核苷酸酶催32PdNTP标记（标记（5-OH）末端。）末端。使标记片段变性为单链。使标记片段变性为单链。分成分成4-5个反应体系，按上述程序（表或个反应体系，按上述程序（表或4个机制）化学处理，严格个机制）化学处理，严格控制反应条件。（使得平均每控制反应条件。（使得平均每1个个DNA分子只有分子只有1个位置被断裂，这种断裂个位

31、置被断裂，这种断裂是随机的，如是随机的，如G反应，则在反应，则在DNA链上任意位置链上任意位置G断裂），断裂），DNA链上每链上每50-100碱基只有碱基只有1个被裂解，这样，每个反应中虽然都在同一核苷酸处断裂个被裂解，这样，每个反应中虽然都在同一核苷酸处断裂DNA链，但由于碱基位置不同，产生链，但由于碱基位置不同，产生1组不同长度的组不同长度的DNA片段。其长度可片段。其长度可由几个核苷酸到接近待测由几个核苷酸到接近待测DNA全长。全长。电泳电泳放射自显影放射自显影4个反应管统一阅读，个反应管统一阅读，DNA4个碱基每个位置都有一个相应的片段，个碱基每个位置都有一个相应的片段，待测待测DNA

32、全部核苷酸序列就可直接读出。全部核苷酸序列就可直接读出。化学法没有末端终止法应用广泛，但有一个明化学法没有末端终止法应用广泛，但有一个明显的优点，即所测序列来自原显的优点，即所测序列来自原DNA分子而不是酶促分子而不是酶促合成反应所产生的拷贝，因此利用化学法可以对合合成反应所产生的拷贝，因此利用化学法可以对合成的寡核苷酸进行测序，可以分析诸如甲基化等成的寡核苷酸进行测序，可以分析诸如甲基化等DNA修饰的情况，不能通过化学保护及修饰干扰实修饰的情况，不能通过化学保护及修饰干扰实验来研究验来研究DNA二级结构及蛋白质与二级结构及蛋白质与DNA的相互作用。的相互作用。化学法测序放射自显影图谱的识读，

33、较末端法更复杂一些，这是因化学法测序放射自显影图谱的识读，较末端法更复杂一些，这是因为化学裂解反应并不完全是碱基特异性的，每组测序图谱为为化学裂解反应并不完全是碱基特异性的，每组测序图谱为4或或5条垂直条垂直的阶梯带，的阶梯带，AC反应可以不做。该片从胶底部一个个向顶部读，反应可以不做。该片从胶底部一个个向顶部读，G+A和和C+T两列中含有所有相差一个碱基的两列中含有所有相差一个碱基的DNA片段。如果片段。如果G+A中出现中出现1条带就条带就看看G列中是否有同样大小的带，若有即为列中是否有同样大小的带，若有即为G碱基，无则为碱基，无则为A碱基；同理，碱基；同理，C+T中则检查中则检查C列中有无

34、同样大小条带，有即为列中有无同样大小条带，有即为C，无则为，无则为T。在做了。在做了AC反应时，出现较深的带时，可以帮助确定为反应时，出现较深的带时，可以帮助确定为A碱基。化学法必须碱基。化学法必须4或或5个反应管统一阅读，个反应管统一阅读，DNA中中4个碱基每个位置都有个碱基每个位置都有1个相应的片段，待测个相应的片段，待测的的DNA全部序列可直接读出。（专业技术人员）全部序列可直接读出。（专业技术人员）化学法测序采用化学法测序采用32P标记标记DNA进行，条带会较末端法更模糊，更宽，进行，条带会较末端法更模糊，更宽，由于分辨率不足，从单块凝胶上能得到可靠序列数量约为由于分辨率不足，从单块凝胶上能得到可靠序列数量约为200-300bp以以内。读序常见问题及解决办法参见分子克隆内。读序常见问题及解决办法参见分子克隆P665。末端法读序（分子克隆末端法读序（分子克隆P640）