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1、作品名称： 刚地弓形虫TgAtg8-TgAtg3分子互作在小分子药物研发中的应用大类： 自然科学类学术论文小类： 生命科学简介： 弓形虫病是一种重要的食源性、人兽共患寄生虫病，寻找高效、低毒药物是该病防治中亟需解决的问题。通过体内实验发现弓形虫TgAtg8、TgAtg3存在相互作用关系。进一步体外实验证实两者可发生1:1的直接结合。以此为靶点，成功获得1个小分子抑制剂，初步发现其对宿主无毒副性，可显著抑制虫体增殖、保护受染小鼠。本研究成果有助阐明弓形虫自噬机制，促进研发抑制高效、低毒的小分子药物，有效控制弓形虫感染。详细介绍： 【生活中的隐形杀手】 刚地弓形虫（Toxoplasma gondi
2、i）专性地寄生于人和动物的有核细胞内，引起人兽共患弓形虫病。全世界约有三分之一人群属于弓形虫隐形感染人群。当机体免疫力低下（如器官移植、恶性肿瘤放疗、AIDS病人）时，虫体可在患者体内广泛散播致病，严重可致死亡。妇女孕期首次感染可引起流产、死胎或畸型等。 此外，弓形虫可感染其他哺乳类动物，可致病畜死亡、流产等，给畜牧业带来巨大的经济损失。在我国，家畜的弓形虫感染率可达10% 50%。研究数据表明，全国大部分地区的牲畜均存在着弓形虫隐性感染。而猪、羊等常见牲畜的感染率更高，在部分地区甚至接近40%。30% 63%的人群感染是通过食入含弓形虫包囊的肉类制品所致。可见，该病是我国一种重要的食源性、人
3、兽共患性寄生虫病。 据统计，10年内中国的宠物数量增长了近900%。其中猫犬是大部分人的主流选择据研究，犬类弓形虫感染率可达到20%以上，而猫的平均感染率甚至高达40%。当人类与宠物亲密接触或清理宠物排泄物时，弓形虫可通过呼吸道、损伤的皮肤和粘膜以及眼等途径感染人体，引发弓形虫病。一项研究表明，一般人群的弓形虫感染率为11.11%，而宠物饲养者的感染率近30%。 但目前弓形虫病的治疗仍以化学药物为主，如乙胺嘧啶、磺胺嘧啶、乙酰螺旋霉素等。但这些药物都存在副作用强、根治率低、疗程长等缺陷，且耐药株的报道逐年增加。寻找一种既可有效杀灭虫体、又对宿主无毒副作用的药物是弓形虫病防治工作中亟需解决的问题
4、。 【研究历程】 本项目所关注的细胞自噬（autophagy）是普遍存在于真核生物中、一种高度保守的机制。其中，自噬体形成是自噬过程的限速步骤，并受众多自噬相关蛋白（autophagy-related protein, Atg）调控。在酵母与多种真核细胞中，有两种类泛素样连接体系参与自噬体形成：Atg8-磷脂酰乙醇胺（phosphatidylethanolamine, PE）与Atg12-Atg5。其中，Atg8-PE是必需的。Atg8-PE连接体系中，Atg8首先经Atg4水解，暴露C-末端甘氨酸残基与Atg7（E1样激活酶）结合，随后被转运至Atg3（E2样连接酶），形成Atg8-Atg3
5、复合物，最后经Atg3将Atg8转运至吞噬膜上的PE，介导Atg8-PE复合体形成，从而黏合脂质膜，促进自噬体膜形成与延伸。因Atg8-PE结合必须由Atg3介导，Atg8-Atg3的分子互作成为自噬体形成中的关键。然而，弓形虫TgAtg8-TgAtg3是否存在相互作用目前尚无文献报道。 为证实弓形虫TgAtg8-TgAtg3是否存在相互作用，我们进行了以下的研究工作：通过同源建模，发现弓形虫TgAtg3具有保守的E2样酶活性区，而TgAtg8则具有保守的W-site与L-site结构域；利用Pull-down与质谱分析，证实虫体内天然的TgAtg8-TgAtg3之间存在相互作用关系；利用无细
6、胞蛋白表达系统、Alpha检测、BIAcore实验与单分子光谱等体外实验证实两个蛋白存在1:1的直接结合，即1个TgAtg8分子与1个TgAtg3分子直接结合；基于以上结果，我们对352个小分子化合物进行筛选，获得1个可显著抑制TgAtg8-TgAtg3结合的小分子抑制剂，命名为ToxoSMI-1（Toxoplasma Small Molecule Inhibitor-1）。初步细胞实验表明，ToxoSMI-1对人源宿主细胞无毒害作用，但可显著降低弓形虫胞内增殖。动物实验中，ToxoSMI-1治疗的弓形虫感染小鼠，存活时间显著延长。综上所述，我们证实了TgAtg8-TgAtg3分子互作具有作为
7、抗弓形虫病药物靶点的潜能。 【创新点及实用性】 1. 首次证实了TgAtg8-TgAtg3 的相互作用关系，并准确测定了1:1 的分子结合比例，丰富了弓形虫自噬理论。其新颖性已通过中科院国家一级鉴定中心确认。 2.团队成员前往澳大利亚IMB研究所，在自噬领域搭建了无细胞蛋白表达系统、单分子光谱技术等全新的蛋白相互作用分析平台，不但克服了传统验证方法的缺陷，大幅缩短实验周期，也为大规模检测两个甚至多个蛋白相互作用提供了实验平台。 3. 项目针对“自噬”靶点研发的小分子抑制剂可作为弓形虫病新型治疗药物，这在国内外尚未见相关报道。更为重要的是，小分子抑制剂可针对弓形虫自噬蛋白特异性氨基酸结合序列产生
8、抑制作用，阻止虫体生长的同时对宿主无毒副作用，在动物甚至人类弓形虫病药物治疗上具有广阔的应用前景。 4. 科研应用领域上的经典自噬抑制剂可同时干扰宿主自噬现象，造成研究结果的偏差，该小分子抑制剂解决了上述国际难点，保证了实验的精确性，在科研平台上具有很大的学术意义和应用价值。 【国内外合作】 1. 团队成员前期在澳大利亚昆士兰大学IMB 研究所开展体外实验，并初步筛选得到了小分子抑制剂。 2. 悉尼欧洲分子生物学研究所（EMBL）已同意邀请本团队再次前往澳大利 亚，开展延伸项目。 3. 团队与*康乐药业股份有限公司签订小分子药物研发合作意向书，药业公司将在小分子抑制剂原料合成和动物安全性试验上给予资金支持和技术指导。 4. 团队与*金土地农业开发有限公司、*金凯畜牧专业合作社两家农副业公司签订小分子药物动物试验推广意向书，将为团队后期在动物中的推广试验提供充足的试验对象。获奖情况： 第十四届“挑战杯”特等奖
刚地弓形虫TgAtg8-TgAtg3分子互作在小分子药物研发中的应用
