肿瘤标志物检测的质量保证

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1、肿瘤标志物检测的质量保证一、肿瘤标志物的定义肿瘤标志物（tumor marker, TM）是指在肿瘤的发生和增殖过程中，由肿瘤 细胞本身所产生的或者是由机体对肿瘤细胞反应而产生的，反映肿瘤存在和生长 的一类物质，包括蛋白质、激素、酶（同工酶）、多胺及癌基因产物等。肿瘤患 者血液或体液中肿瘤标志物的检测，对肿瘤的辅助诊断、鉴别诊断、疗效观察、 病情监测以及预后的评价具有一定的价值。肿瘤标志物存在于细胞浆和细胞核中，与细胞表面膜相连，在血液中进行循 环。肿瘤标志物可以在血清、血浆、其他体液、组织提取物或石蜡固定的组织中 检测到。大多数肿瘤标志物可以用免疫学的技术进行检测。二、影响肿瘤标志物检测的因

2、素1. 样本采集对检测的影响如前列腺按摩、前列腺穿刺、射精、导尿和直肠镜检查后，血液PSA和PAP值可升 高；肝、肾功能异常和胆道排泄不畅、胆汁淤滞等均可造成肿瘤标志物如CEA、 ALP、GGT、细胞因子等浓度增高；某些药物影响肿瘤标志物的浓度，如抗雄激素 治疗前列腺癌时可抑制PSA产生，导致PSA假阴性结果；唾液和汗液污染标本可 使SCC升高。由于红细胞和血小板中也存在神经元特异性烯醇化酶（NSE），因此， 样本溶血或放置时间过长（且未分离血清保存）可使血液中NSE浓度增高。采血管 内的促凝剂或抗凝剂，对某些项目的测定有干扰。2. 样本保存对检测的影响血液标本采集后应及时离心，分离血清或血浆

3、尽快测定，或保存于4C冰箱中； 若在23个月内测定，则应低温冰冻保存，防止反复冻融。酶类和激素类TM不稳 定，如fPSA和HCG,半寿期短，易降解,应及时测定。3. 肿瘤病人自身状况的影响肿瘤患者自身的状况影响肿瘤标志物的检出及血液中肿瘤标志物的浓度，包 括：肿瘤的大小和肿瘤细胞的数目：肿瘤越大、肿瘤细胞的数目越多，血液中 TM越高。肿瘤细胞自身的分化程度：肿瘤细胞的分化程度越差，恶性程度越高， 血液中TM越高。肿瘤的分期不同：肿瘤越晚期，血液中TM越高。肿瘤细胞表达和合成肿瘤标志物的程度：肿瘤细胞表达和合成的TM程度越高，血液中TM 越高，反之，血液中TM较低。肿瘤细胞的坏死和坏死程度：肿瘤

4、细胞坏死后， 释放出TM，使血液中TM升高，坏死程度越大，血液中TM升高越明显。TM在体 内的降解和排泄：若肝脏、肾脏功能差，排泄速度慢，贝何在体内明显升高。 假阳性和假阴性；有些疾病如炎性疾病，结缔组织病和生理变化如妊娠时，有些 标志物的表达也升高，可导致假阳性；而有些肿瘤标志物较少或肿瘤细胞被封闭， 抗原抗体形成免疫复合物，血循环差等都可导致肿瘤标志物不能被检出，导致假 阴性。生物学因素的影响：随年龄的增长PSA升高;老年人CA199、CA153、CEA 等可升高。部分妇女在月经期CA125和CA199可增高，妊娠期血液中AFP和CA125 含量明显升高；长期吸烟会使血液中CEA含量偏高。

5、非法表达与假基因转录： 非法表达指有些基因在肿瘤组织中表达，在正常组织中不应该表达而有少量表达； 假基因转录，指假基因转录为mRNA，一般情况下不翻译为蛋白质。在定性的检测 mRNA和蛋白质时，这两种情况都可以影响检测的准确性和特异性，导致假阳性。患者血液中有噬异性抗体存在，可导致TM假阳性结果，要将此抗体消除后再检 测。因此，肿瘤患者的肿瘤标志物基础测定值对于观察疗效、预测复发有非常重 要价值。对肿瘤标志物检测正常的肿瘤患者，还可以做如下解释：疗效显著、未 复发未转移；未选择到恰当的肿瘤标志物，提供错误信息；是一种目前还未发现 的肿瘤细胞亚型。三、肿瘤标志物检测的质量保证（一）肿瘤标志物检测

6、前的要求对病人的信息进行充分了解，确保实验结果的准确性。检测前样本的保存：血液标本采集后应及时离心，保存于4C冰箱中，24小 时内测定；如在短期内测定，则应-20C保存，长期保存应置于-70C冰箱，标本 应防止反复冻融。酶类和激素类肿瘤标志物不稳定，易降解，应及时测定或低温 保存。（二）肿瘤标志物分析检测的要求满意的测试结果来自于符合要求的标本以及经过室内质控（IQC）和实验室间 质量评价（EQA）监测评价的有效的实验方法。室内质控和室间质评的监测评价包 括实验的重复性、采用的标准、所用基质的影响、动力学范围、参考品、稳定性、 分析结果的理论数据、实验方法。肿瘤标志物测定方法很多，有放射免疫测

7、定法，酶联免疫测定法，化学发光 免疫测定法等，每种测定方法有自己的精密度和重复性，但手工操作的方法重复 性较差，误差比较大，操作时要特别认真；用自动化仪器进行测定，重复性好， 误差小，实验结果的分析内和分析间变异系数可以达到5%和10%，具有手工分析 难以比拟的优势。各实验室还应注意影响实验特异性的因素。不同的试剂盒测定也有差异，其原因是由于使用的单克隆抗体针对抗原的位 点不同所致。有时即使使用同一抗体，也可能因抗原异质性（如原发肿瘤转移后， 失去了原有的抗原性而停止分泌原有的肿瘤抗原）或基质的影响而得到不同的结 果。有研究报道，使用12种不同的CEA试剂盒检测某一混合血清中CEA的浓度， 结

8、果其差异超过100%。导致分析间误差的主要原因是没有测定的标准化，包括缺 乏统一的抗原、抗原成分、校正品和参考方法等。因此，在工作中要尽量使用同 一种方法，同一种仪器和同一厂家的试剂盒进行测定。1. 室内质量控制（IQC）的要求肿瘤标志物很少有参考方法，要坚持作室内质控图，以均值为靶值，来判断试验 的稳定性和重复性。 重复性：理想的分析批内误差应5%；批间误差10%。 建立测定认可的标准：选择合适的IQC标准。 样品与病人血清尽可能相似：仅仅采用试剂盒所附的质控品是不够的，还应包 括独立来源的可靠的血清基质质控品。 IQC样品的浓度适合临床应用：应包括肿瘤标志物的阴性和低值阳性质控品，需 要较

9、宽的浓度范围；评价高浓度样本稀释后的测定准确度。 评价实验的干扰因素：要求对实验的干扰因素（嗜异性和其他抗体、血凝试管 中的凝血试剂等）进行检查。2. 实验室间质量评价（EQA）的要求 适宜浓度的EQA样本：EQA样本应具有适宜的工作浓度范围，但有时会需要较高 浓度的EQA样本来评价实验的稀释步骤。对于某些分析(如：AFP、hCG)用无分 析物血清检查基线的可靠性是很重要的。 实验“稳定性”的评价：在一定时间内(6-12个月)重复进行相同样本的测试， 对实验室内实验结果的重复性进行评价。 验证靶值的精确度和稳定性：指无现成参考方法时，需要对所使用的方法进行 以下验证：稳定性：对同一样本进行重复

10、测定；用已知浓度的相关国际标准品进 行回收率实验；对不同实验室间的检测结果(参考值范围、结果累计报告等)进 行比较。3. 肿瘤标志物测定的标准化问题要保证TM检测结果的准确性和各实验室之间的可比性,首先诊断产品要达到 国际标准(IS)，有统一的参考方法和国际参考品(IRR)。但目前尚无公认的参考方 法，能得到的国际标准品仅有AFP、CEA、HCG和PSA四种，而CA系列的TM至今还没有 国际标准，这为TM测定的准确性和质量控制带来了困难。涉及到免疫测定标准化的组织有世界卫生组织(WHO)生物学标准化专家委员 会 (The Expert Committee on Biological Stand

11、ardization， ECBS)，负责建 立生物物质的国际标准及参比材料。WHO通过国家生物学标准和质控物研究所(National Institute for Biological Standards and Control, NIBSCC)提供 大多数多肽激素和一些肿瘤标志物的国际标准品。一些地区性组织也制备标准品， 如美国的疾病控制中心(Centers of Disease Control, CDC)、美国病理学家协 会的国家委员会(National Committee of the College of AmericanPathologists)、国家卫生研究所(National In

12、stitute of Health NIH)等提 供用于研究目的的多肽激素标准品。国际癌症生物学和医学学会(International Society of Onco-developmental Biology and Medicine)已启动一个肿瘤标志 物抗原决定簇绘图计划。4. 抗原、抗体和基质效应对肿瘤标志物测定的影响抗原抗体反应是指抗原与相应抗体间所发生的特异性结合反应，受抗原抗体 的性质、活性、效价、反应比例及环境(如电解质,pH值,温度)等因素影响。在TM测定中应注意:确认样品中被检抗原和校准品中抗原的一致性。制备抗体时使 用的抗原和样品中抗原的一致性。抗原过剩的识别。试剂使用的

13、是多克隆抗 体，则抗体的纯度很重要；试剂使用的是混合单克隆抗体则每批抗血清内各单克 隆抗体的组成及相对比例很重要，并要保持恒定。另外，很多肿瘤标志物是糖蛋 白或粘蛋白，糖基化的不均一性可能导致其免疫反应性某些变化，从而引起测定 结果的差异。校准品稳定、无混浊。抗原抗体反应时所处的基体（基质）状 况应保持恒定和一致。免疫反应的基质效应是指干扰抗原、抗体反应而与分析物本身无关的所有非 特异性因素（即基质）对分析物反应的影响。基质效应通常由蛋白质、电解质、补 体、类风湿因子、抗人球蛋白抗体、药物、添加剂和各种污染物引起。标准品和 质控品的基质与待测血清标本不一样,标准品的基质通常是含蛋白的缓冲溶液；

14、标 准品和质控品都是经过加工处理的，如冰冻、冷冻干燥、加稳定剂或添加某些分析 物等，而临检所用的测定方法、仪器、试剂等都是以人新鲜血清标本为模板的，对 血清标本测定有可靠性，而对加工处理过的物质不一定可靠。对于基质效应，需要 注意以下几点：同一基质状态的基质效应随方法及检测条件而异。基质效应 是绝对的，只要处理过的样品和测定样品的基质状态不一，一定有基质效应；基 质效应又是相对的，只要认可某一方法的基质效应可忽略不计，或者由基质效应 对某方法引入的误差在可接受水平，那么衡量另一方法是否具有基质效应时，应 作方法学比较。若处理过的样品和测定样品的结果分布不同，说明基质效应明显。 反之属可接受。也

15、即认为“无”基质效应。严格讲，不同批号试剂，它们产生 的基质效应也不一致。度量有无基质效应，或者了解不同方法间的可比性，最佳 样品是人新鲜样本。一定要懂得单一标准液，校准品，质控品和新鲜样品间的 区别，并正确使用。不应用质控品作为校准品去校准仪器，不仅是基质差异，而 且是校准品和质控品定值的水平不一。室内质控用的质控品仅用于各检验科日常 工作中重复性和精密度的控制。由于各检验科的检验方法和厂商定值的方法不一 致，不可将定值血清的靶值来定值。衡量某一方法或试剂是否准确可靠，唯一 可信的方法是使用人新鲜样本进行比较，仅以控制品测定值相似或等于定值，不 足以说明方法的准确度。校准品是公司指定用来校准

16、某测定系统（仪器+试剂 +方法程序）的，是考虑到它具有基质效应的情况下，人为赋予校准品的校准值。 因此校准品必须专用于某一测定系统。应鼓励检验科使用仪器厂商指定的试剂和 校准品。同一个校准品用于不同仪器时，应该有不同的校准值。不轻易使用某 一校准品的校准值对于各种仪器作校准。5. 引起肿瘤标志检测错误结果的潜在因素 高浓度hook效应：通常情况下，肿瘤标志物的浓度范围会有好几个数量级的差 别，因此有可能需要确认高浓度的样本产生的hook效应，以避免低值结果的错误 报告。这对于首次进行肿瘤标志物检测的病人犹为重要。（可以通过使用高结合 力的固相抗体、分析两个稀释度的样本、或通过后续的分析步骤包括

17、清洗步骤来 减少hook效应。） 样本间的携带：检测高浓度的样本会产生样本间携带的潜在问题，因此有必要 对此进行随时检查。 嗜异性或人抗鼠抗体（HAMA）的干扰：IgG抗体可以和测定中使用的抗体进行反 应。通常情况下，由于进行影像检查和治疗而使病人接触鼠单克隆抗体，由此而 产生的人抗鼠抗体会使肿瘤标志物的检测出现错误结果。（可以通过使用阻断剂 对样本进行前处理、在反应基质中加入非免疫的鼠血清或对样本进行稀释后再进 行分析的方法来减少HAMA的干扰。）（三）肿瘤标志物分析检测后的要求 通过询问医生获取病人的临床信息：有必要鼓励临床医生提供带有说明的简短 的临床信息（如手术后、化疗后等），这有助于

18、确认偶然误差（如可能出现的仪 器上加错标本等）。另外，当改变TM检测方法和试剂时,必须通知临床，避免对结 果的误判。实验室还应印发宣传资料介绍TM标本采集的注意事项，并提出TM检测 的合适频率供临床参考。这些措施对提高检测质量，用好TM非常有用。 参考值范围的有效性：通常来自相应的健康人群的参考值范围与初始治疗前的 肿瘤病人有很好的相关性。因此，病人自己的“基线”值对于肿瘤标志物的测定 结果具有非常重要的参考意义。只有基于有效的参考范围，增高甚至在参考范围 增高才有临床显著床意义，但须进行进一步的工作。 了解显著变化或临床相关变化的组成因素：应包括生物学变异和分析数据的变 异。一般病人的结果在

19、排除检测方法引起的误差后，上升或下降25%都有临床价 值。对于测定结果升高的标本必须复查，以防测定误差。 改变方法时应进行方案确认：有助于确认由于改变方法而引起的肿瘤标志物检 测结果的差异。（可能需要对以前检测过的样本再用新的方法进行检测来确认结 果的差异。） 必须知道肿瘤标志物的半寿期：TM的半寿期是指肿瘤组织被完全切除后血液循 环中TM浓度下降到50%的时间。这有助于选择TM的监测时间和解释TM浓度变化与临 床疗效和肿瘤复发的关系。若复查间隔时间太短，将误认为肿瘤未被完全切除；间 隔时间太长，将无法区分是肿瘤复发还是疗效欠佳。一般应在治疗结束后5个半寿 期采血为好，这时原有的TM约97%已

20、被清除。主要TM的生物半寿期：CA199为48天； CA153为57天；CA125为5天；CA724为37天；细胞角质蛋白19片段（CYFRA21）为 1天；AFP28天；CEA28天；PSA23天；fPSA1218小时；HCG1236小时；NSE 1天；SCC1 天。 肿瘤标志物临床应用的比较：首先需要得到有关肿瘤标志物临床应用的信息， 再由有关的专业组织进行考察比较。六、常用肿瘤标志物检测中的注意事项CA15-3分析测试前准备和样本贮存：进行CA15-3的检测可以采用新鲜分离的血清样本。 CA15-3在4C下可以稳定24小时。建议将血清贮存于-20C（短期）或-70C （长 期），以备复试

21、时使用。若需长期贮存，则不能使用变性胶（CA15-3在变性胶的 存在下表现出明显的不稳定）。分析中的注意事项：每个实验室都应对CA15-3的分析方法、分析精密度和参考值 范围进行验证，以确定临床诊断的界限值。分析后结果报告的注意事项：应进行进一步的研究来确认性别、种族、年龄和绝经情况对正常人和乳腺癌病人CA-153表达的影响，制订出肿瘤标志物的参考值范 围。CA125分析前注意事项：含糖的血清肿瘤标志物一般在常规实验室室温条件下有一定程 度的稳定性。然而样本的快速处理对于减少分解是十分必要的。新鲜分离的血清 应该立即进行CA125的测定。血清样本应于4C下存放或冻存于-20C（短期）或 -70

22、C（长期），以备复试时使用。分析中的注意事项：NACB认为，CA125的测定结果用于病情监测，CV值应15%。 在此CV值下，95%可信限的范围是2139U/ml，平均30U/ml。EGTM建议，肿瘤标 志物自动化测定的批内变异应10%，并应考虑生物变异和分析的不精确度。分析后结果报告的注意事项：由于各厂家的检测试剂盒检测结果略有不同，因此 应在报告中附加试剂盒标明的正常值范围。SCCA分析前注意事项：由于唾液、汗液和呼吸分泌物中存在大量SCCA，因此血样应避 免暴露于皮肤和唾液。分析中的注意事项：SCCA测定的平均日间变异为24%，因此在监测疾病复发时， 应分别考虑其Cut-off值。分析后

23、结果报告注意事项：应同时报告试剂盒生产厂家标明的正常值范围。PSA分析前注意事项：NACB对用于PSA测定的标本的采集和处理作出如下建议：因为 有许多因素都会影响PSA的含量，所以应确保在任何有关前列腺的活动之前进行 血样的抽取，也就是说，在射精后至少24小时（如果在24小时以内，应注意最 后一次射精的时间）、前列腺炎症消退、前列腺活检、经尿道的前列腺切除后数 周再进行游离PSA的检测。由静脉抽取的血样应在3小时内离心分离出血清。血 清样本在冰箱中可保存24小时以上，但应于24小时内进行测定，否则就应将样 本冻存于-20C以下（最好在-30C以下避免结晶），长期保存温度应在-70C以下。 考虑

24、到以上对样本的要求在日常工作中可能较难达到，EGTM建议根据采集样本时 病人的情况而使用特定的分析参考值。分析和结果报告注意事项：结果报告中应注明，单次PSA的检测结果不能用于前 列腺癌的诊断和判定，应该和物理检查结合使用。结果报告中还应分别注明分析 实验的灵敏度和正常值参考范围，并说明结果不能用作评判恶性肿瘤是否存在的 证据，除非有另外一些检测结果说明一定程度上升高的PSA水平不是由于良性前 列腺组织疾病所引起的。报告中还应注明PSA分析（试剂、仪器）的生产商，并 声明测定结果不能和用其他方法得到的结果进行互换。对病人的治疗后监测，单 次PSA检测结果不能用于前列腺癌复发的诊断。根部前列腺切

25、除手术后，PSA的持 续升高（基于多次PSA的检测结果）指示疾病的复发，若用超灵敏度分析进行根 部前列腺切除手术后的跟踪随访（超灵敏度分析唯一的临床应用），应对实验的 灵敏度进行验证，并将其报告给临床医生，更重要的是要研制出质控品并达到要 求的灵敏度。有些较低的检测结果在生物学变异范围内可能会变得很高，因此持 续升高的PSA水平应该引起高度重视。EGTM的观点是PSA超灵敏度分析实验的结 果不应用于决定临床治疗方案。肺癌标志物分析测试前的注意事项：用于肺癌肿瘤标志物检测的样本应存放于4C （短期）和 -70C （长期）。当融化冰冻样本进行细胞角蛋白测定时，应避免样本的剧烈混合， 因为剧烈震荡后细胞角蛋白可能会附着在试管壁上。用于NSE检测的样本应在采 集的血液凝集后60分钟内进行分离，注意避免存在于红细胞内的NSE漏出。溶血 的样本不能进行NSE检测。用于SCCA检测的样本应避免皮肤和唾液的污染，因为 这可能导致结果的错误升高。肾功能障碍会显著影响CYFRA21-1和SCCA的检测结 果，因此，对高检测结果的病人应观察其身体状况。