实验诊断学：细胞免疫学检测和流式细胞术

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1、细胞免疫检测和流式细胞细胞免疫检测和流式细胞术术珠江医院珠江医院 检验医学部检验医学部一、简介为什么要检测免疫细胞珠江医院珠江医院 检验医学部检验医学部检测了有什么用？珠江医院珠江医院 检验医学部检验医学部免疫细胞功能是什么珠江医院珠江医院 检验医学部检验医学部珠江医院珠江医院 检验医学部检验医学部检测的重要性 对肿瘤患者的研究，免疫细胞分群的，研究，标志物，预后的关系珠江医院珠江医院 检验医学部检验医学部Note:This table contains samples prepared by enzyme digestion of solid tumor only except as not

2、ed%vaible of total%of viable cells%of viable leukocytesCommentSampleDate collectedtotaltumorleucoCD45+EpCam+CD45-T cellsB cellsmonoother17892011/2/980.880.680.218.412.181.628.40.747.423.517902011/2/966.953.683.857.618.842.442.73.436.017.917912011/2/1484.185.172.84.143.495.525.27.251.216.417922011/2/

3、2381.481.181.260.828.239.237.927.53.131.517932011/3/1187.491.841.26.01.194.026.85.14.963.2Breast Ca17942011/3/1677.672.081.961.522.938.557.116.911.114.917952011/3/1683.384.279.418.69.381.454.66.320.718.417962011/3/2120.619.655.110.239.589.84.71.660.133.6Belco prep17972011/3/2287.687.887.573.713.826.

4、318.211.314.456.1Ascites17972011/3/2256.551.372.034.529.165.524.47.636.031.9Tumor17982011/3/2972.176.569.748.818.051.236.813.422.527.3肿瘤治疗策略珠江医院珠江医院 检验医学部检验医学部珠江医院珠江医院 检验医学部检验医学部白血病免疫分群从1976年FAB分型M从2001年FAB分型MICM细胞形态学（Morphology）免疫学 （Immunology）细胞遗传学（Cytogenetics）分子生物学（Molecular biology）珠江医院珠江医院 检验医

5、学部检验医学部细胞分型的方法玫瑰花试验等-利用T淋巴上具有绵羊红细胞受体珠江医院珠江医院 检验医学部检验医学部白细胞分化抗原是白细胞（还包括血小板、血管内皮细胞等）在正常分化成熟不同谱系（lineage）和不同阶段以及活化过程中，出现或消失的细胞表面标记。它们大都是穿膜的蛋白或糖蛋白，含胞膜外区、穿膜区和胞浆区。有些白细胞分化抗原是以磷脂酰肌醇（inositol phospholipids,ip）连接方式“锚”在细胞膜上。少数白细胞分化抗原是碳水化合物半抗原。珠江医院珠江医院 检验医学部检验医学部珠江医院珠江医院 检验医学部检验医学部单克隆抗体技术(monoclonal antibody te

6、chnique)1975年英国科学家Milstein和Kohler所发明，并获得1984年诺贝尔医学奖。珠江医院珠江医院 检验医学部检验医学部生物发光现象珠江医院珠江医院 检验医学部检验医学部信号检测-荧光信号自发荧光 特异荧光特异荧光能量级激发激发态发射激光能量损失珠江医院珠江医院 检验医学部检验医学部珠江医院珠江医院 检验医学部检验医学部珠江医院珠江医院 检验医学部检验医学部流式细胞仪特点珠江医院珠江医院 检验医学部检验医学部0o(Axial Light Loss)scatter indicates 细胞大小7o-10o 中间角度的散射显示了细胞的复杂性 90o偏振光照射显示出细胞的分叶性

7、 90o去偏振散射可区分Neutrophils and EosinophilssizecomplexityLobularityDepolarizationThe relationship between cytometry and cell structureLASER LIGHTFLOWCELL珠江医院珠江医院 检验医学部检验医学部珠江医院珠江医院 检验医学部检验医学部流式细胞仪的工作原理珠江医院珠江医院 检验医学部检验医学部鞘液系统鞘液系统珠江医院珠江医院 检验医学部检验医学部液流系统：流动室、液流驱动系统液流系统：流动室、液流驱动系统珠江医院珠江医院 检验医学部检验医学部流式细胞仪检测范

8、围细胞大小细胞大小细胞粒度细胞粒度细胞表面面积细胞表面面积核浆比例核浆比例DNADNA含量与细胞周期含量与细胞周期RNARNA含量含量蛋白质含量蛋白质含量细胞结构细胞结构特异性抗原特异性抗原（细胞表面（细胞表面/胞浆胞浆/核）核）细胞内细胞因子细胞内细胞因子细胞活性细胞活性酶活性酶活性激素结合位点激素结合位点细胞受体细胞受体细胞功能细胞功能珠江医院珠江医院 检验医学部检验医学部 灵敏度：一般能测出单个细胞上灵敏度：一般能测出单个细胞上600CD15;onmaturingmyeloidcellsCD15CD11bCD11cLeuM5Monocytes;macrophages;NKcells;gr

9、anulocytesweaker;lymphoidsubsetsWeakonmanytumors;HairycellleukemiastrongCelladhesionmolecule;alphaintegrin;partofCD11/CD18VariablypresentonB-CLLbutbrightestonhairycell;mantlecellnegative.CD13My7;LeuM7Earlyandmaturegranulocytesandmonocytes;LGLsubsetMostAMLs(moreoftennegativeonM6b;M7);someALLsAminopep

10、tidaseN;cleavespeptidesboundtoclassIIFITCconjugatesmaynotshowpositivity.CD14Mo2;My4;LeuM3Strongonmonocytesandmacrophages;weakongranulocytesLeukemiaswithmonocyticdifferentiationEndotoxinreceptor;bindingtriggersactivationDifferentCD14antibodiesshowvariablereactivitywithmonocyticleukemiasCD15LeuM1Granu

11、locytes;monocytes;endothelialcellsReed-Sternbergcells;AMLswithdifferentiation,espgranulocyticCelladhesion(Lewis-Xantigen;carbohydrateX-hapten)andphagocytosisMonocytereactivityisclonedependent.AllantibodiesareIgM.BindingoftenalterslightscatterpropertiesCD16Leu11aNKcells;maturegranulocytesSameFcgammaR

12、III(IgGFcRIII);GPIanchoredCD18BetachainofintegrinsMac-1(11b/18;CR3);LFA-1(11a/18);(11c/18;CR4)Expressionasabove(withCD11)PMN¯ophageadhesionRarelyusedinphenotypingleukemiasCD19B4;Leu12Bcellsatallstagesofmaturation;folliculardendriticcells;maybelostinplasmacellsbutoftenweakNearly100%B-precursorALL

13、;mostBcelllymphomas;partialaberrantexpressiononsomeAMLsSignaltransductioninvolvedinBcelldifferentiationandactivation;ligationincreasesCa+;AMLM2witht(8;21)characteristicallypositiveCD20B1;Leu16Bcells,butnotonearliestBprecursorsMostBcelllymphomas;oftennegativeorvariableinB-precursorALL;Ca+channel;Bcel

14、lactivationCD21B2;OKB7MantleandmarginalzoneBcells;folliculardendriticcells;someepitheliaFolliculardendriticcelltumors;someBcelltumors;fewALLsCR2(complementreceptor);C3d/EBVreceptor;signaltransductioncomplexIgEheavychain(epsilon)noneAntigen-experiencedBcellsRareinB-celltumorsAntigenrecognition;Bcella

15、ctivation;hypersensitivityreactionsIgGheavychain(gamma)noneAntigen-experiencedBcellsManyB-celltumors;notlymphoplasmacytoidAntigenrecognition;Bcellactivation;humoralimmunityIgMheavychain(mu)noneNaveBcellsMostlowgradeBcelltumors;incytoplasmofsomeBprecursor)pre-B)ALLsBcellactivationKappalightchainNoneB

16、cellsB-celltumors;notB-precursorALLAntigenrecognition;Bcellactivation流式细胞的免疫分型流式细胞的免疫分型 是白血病分型的重要指标是白血病分型的重要指标 FAB标准，形态学和免疫表型结合标准，形态学和免疫表型结合 Minimal residual diseases(MRD)流式细胞白血病免疫分型流式细胞白血病免疫分型 First,it is necessary to identify an abnormal population.The second step is to describe its phenotype.Thir

17、d,the phenotype of the abnormal cells must be interpreted in the context of the morphology,in order to diagnose and classify the leukemia or lymphomaA display of CD45 vs RALS allows identification(and,with gating,quantitation)of most normal populations in bone marrow.The bright CD45+,low RALS cells

18、are lymphocytes;the moderate CD45+high RALS cells are granulocytes;and the cells which have higher CD45 than granulocytes but higher RALS than lymphocytes are monocytes.By convention,on any set of dual parameter displays,populations assigned the same arbitrary color are the same.Thus,the monocytes c

19、an also be recognized because they have considerably higher CD33 expression than the granulocytes(Note the green population on both the CD45/RALS and CD71/CD33 displays;).Nucleated red blood cells have low RALS and are dim to negative for CD45.Although debris,and unlysed red cells will have this pro

20、perty,nucleated red cells are brightly positive for CD71(Again color helps to demonstrate this).Acute lymphoblastic leukemia,B-precursor type(common ALL)Diagnosis:Acute lymphoblastic leukemia,B-precursor type(common ALL)Antigen Profile:Positive for CD71,CD19,CD10,CD22,HLADR,CD34;dimly positive for C

21、D33.Acutemyeloidleukemia(FABM1)AntigenProfile:StronglypositiveforHLADR,CD13,CD34,CD38;dimlypositiveforCD33,CD71;partlypositiveforCD7,CD11bDiagnosisAcutemyeloidleukemiawithdifferentiation(FABM2)AntigenProfile:PositiveforCD71,CD33,HLADR,CD7,CD38,CD13;partlypositiveforCD11b,CD15.Acutepromyelocyticleukemia(FABM3)AntigenProfile:PositiveforCD71,CD33,CD9,CD13,myeloperoxidase;partlypositiveforCD34,HLADR.珠江医院珠江医院 检验医学部检验医学部 流式细胞术是一种应用范围极广、灵活性很强、技术含量较高、具有众多开发潜能、富有挑战性的技术，需要掌握很多交叉学科知识，我们的宗旨是将这项高新技术灵活运用于临床、科研等领域，报告最科学、最真实的客观数据，以服务于全社会。小结珠江医院珠江医院 检验医学部检验医学部Thanks!