从分子到行为学解密医用大麻和药物成瘾的控制机理课件

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1、张张 遐遐加拿大加拿大渥太华渥太华大学大学精神精神卫生研究所卫生研究所 从分子到行为学从分子到行为学 解密解密 医医用大麻用大麻和和药物成瘾的控制机理药物成瘾的控制机理 从分子到行为从分子到行为:分子生物分子生物 神经解剖神经解剖 行为行为检测检测 电生理电生理 细胞培养细胞培养 二项研究：二项研究：1、用大麻素促进海马新生神经元从而抑制焦虑、用大麻素促进海马新生神经元从而抑制焦虑 和抑郁和抑郁 2、解密药物成瘾的控制机理解密药物成瘾的控制机理用大麻素促进海马新生神经元用大麻素促进海马新生神经元从而抑制焦虑和抑郁从而抑制焦虑和抑郁江江文文,张芸张芸,肖兰肖兰,Jamie Van Cleempu

2、t,季少平季少平,白光白光,张遐张遐*“Journal of Clinical Investigation”2005,115:3104-3116 “临床研究杂志临床研究杂志”(2004年影响因子年影响因子14.2)脑研究的最重要发现之一脑研究的最重要发现之一:成年脑能新生神经细胞成年脑能新生神经细胞 2.海马齿状回下带海马齿状回下带(SGZ)1.室管膜下带室管膜下带(SVZ)Human BrainRat Brain为什么研究大麻素与成年海马为什么研究大麻素与成年海马神经元新生的关系？神经元新生的关系？-用大麻用大麻(大麻叶或大麻素大麻叶或大麻素)治疗呕吐、疼痛等治疗呕吐、疼痛等-大麻素作用于大

3、麻素作用于 CB1(脑脑)和和 CB2(免疫系统和脑免疫系统和脑)受体受体-包括可卡因、鸦片类海洛因、尼古丁及酒精包括可卡因、鸦片类海洛因、尼古丁及酒精等常见的滥等常见的滥 用药用药(毒毒)物可抑制成年脑海马神物可抑制成年脑海马神经干细胞经干细胞/前体细胞产前体细胞产 生新细胞生新细胞-大麻或大麻素能否调节成年脑海马神经干细胞大麻或大麻素能否调节成年脑海马神经干细胞/前体细前体细 胞？胞？胚胎脑海马内的神经干细胞胚胎脑海马内的神经干细胞/前体细胞前体细胞可表达可表达 CB1 受体受体(神经干细胞神经干细胞/前体细胞培养前体细胞培养)WesternblotPCR免疫荧光三标记免疫荧光三标记 成年

4、脑海马内的神经干细胞成年脑海马内的神经干细胞/前体细胞前体细胞可可也表达也表达 CB1 受体受体 免疫荧光免疫荧光双双标记标记(成年成年鼠接受鼠接受 BrdU 注射来标记干细胞注射来标记干细胞/前体细胞前体细胞)大麻素能够显箸促进胚胎脑大麻素能够显箸促进胚胎脑神经干细胞神经干细胞/前体细胞产生新细胞前体细胞产生新细胞1.01.02.02.03.03.04.04.05.05.06.06.00.00.00.10.10.20.20.30.30.40.40.50.50.60.6 Absorbance(450 nm)HU210 concentration *0 1 nM 10 nM 100 nM 1 M

5、 10 M +bFGF&EGF bFGF&EGF WST-8 kit assayEndogenous cannabinoid AEA produce similar effects该促进作用是通过顺序激活该促进作用是通过顺序激活 CB1 受体、细胞内受体、细胞内Gi/o 蛋白及蛋白及 ERK 信号传递系统来实现信号传递系统来实现:CB1Go/GiGsHU210ERK signalingAkt signaling proliferation ofneural stem cells慢性注射慢性注射(而非急性注射而非急性注射)HU210 可显箸促进可显箸促进海马的海马的 神经干细胞神经干细胞/前体细

6、胞产生新细胞前体细胞产生新细胞HU210 对神经干细胞对神经干细胞/前体细胞前体细胞的分化无显箸影响的分化无显箸影响(大部分新生细胞分化成神经元并融汇入海马齿大部分新生细胞分化成神经元并融汇入海马齿状回颗粒细胞层状回颗粒细胞层)Vehicle:78.5 2.4%BrdU/NeuN HU210:81.1 2.2%BrdU/NeuN-0.10.00.10.20.30.40.50.60.70.80.91.0002020404060608080100100120120140140160160180180200200 BrdU+cells(%of control)Treatment Vehicle HU

7、210 100 g/kg *HU210 诱导的新生海马细胞并非诱导的新生海马细胞并非由成熟神经元死亡引起由成熟神经元死亡引起 Stereologycell counting:no cell deathTUNEL stain:no apoptotic cell deathFJB stain:no necrotic cell death检测大鼠的焦虑检测大鼠的焦虑 Come on!Tell me which one is anxious?新环境抑制进食实验新环境抑制进食实验 (NSF)禁食禁食2天天 检测开始检测开始进食潜伏进食潜伏时程时程 慢性注射慢性注射 HU210 后一个月后一个月，HU21

8、0 产生了显箸的抗焦虑疗效产生了显箸的抗焦虑疗效Days 1-10(injections)N S FDay 380.91.01.11.21.31.41.51.61.71.81.92.02.12.22.32.42.52.62.72.82.9005050100100150150200200250250300300350350400400450450 Latency to eat(sec)Environment Novel environment Home cage Vehicle AM281 HU210 *检测大鼠的抑郁检测大鼠的抑郁Swimming-immobility.wmvSwimming-

9、immobility.wmvA depressed rat?强制游泳实验强制游泳实验(FST)不动不动 游泳游泳攀爬攀爬38 cm慢性注射慢性注射 HU210 后一个月，后一个月，HU210产生了显箸的抗抑郁疗效产生了显箸的抗抑郁疗效 Days 1-10(injections)F S TDay 450.81.01.21.41.61.82.02.22.42.62.83.03.23.43.63.8002020404060608080100100120120140140160160 Duration of immobility(sec)Treatment Vehicle AM281 HU210 *关

10、健关健问题是问题是:X射射线线(5 Gy x 2)铅板铅板SGZSVZ小脑小脑 Santarelli L.et al.,Science 301,805-809(2003):“慢性注射慢性注射 HU210 后后诱导的新生海马细胞是否与抗诱导的新生海马细胞是否与抗焦虑和抗抑郁有关？焦虑和抗抑郁有关？”X射射线照射损毁海马的神经干细胞线照射损毁海马的神经干细胞/前体细胞后，前体细胞后，慢性注射慢性注射 HU210 的抗焦虑和抗抑郁疗效消失的抗焦虑和抗抑郁疗效消失 Days 1-10(injections)N S FDay 380.91.01.11.21.31.41.51.61.71.81.92.02

11、.12.22.32.42.52.62.72.82.9005050100100150150200200250250300300350350400400450450500500 Latency to eat(sec)Environment Novel environment Home cage Vehicle HU210 HU210+X-ray *0.81.01.21.41.61.82.02.22.42.62.83.03.23.43.63.8002020404060608080100100120120140140160160180180 Duration of immobility(sec)Tre

12、atment Vehicle HU210 HU210+X-ray *0.81.01.21.41.61.82.02.22.42.62.83.03.23.43.63.8002020404060608080100100120120140140160160 BrdU+cells(%of control)Treatment Vehicle HU210 HU210 +X-ray *F S TDay 45kill结结 论论 1.大麻素能够显箸促进海马神经干细胞大麻素能够显箸促进海马神经干细胞/前体细胞产生新细胞；该促进作用是前体细胞产生新细胞；该促进作用是通过顺序激活通过顺序激活CB1受体、细胞内受体、细胞

13、内Gi/o蛋白及蛋白及ERK信号传递系统来实现信号传递系统来实现2.慢性注射大麻素可通过促进海马神经慢性注射大麻素可通过促进海马神经干细胞干细胞/前体细胞产生新神经元达到抗前体细胞产生新神经元达到抗焦虑和抗抑郁的疗效焦虑和抗抑郁的疗效“又要焦又要焦燥燥了，了，来支来支大麻大麻吧吧”新新 闻闻 报报 道道(2005年年10月月13 15日日)“加拿大新闻电视频道加拿大新闻电视频道”(CTV)，“环球邮环球邮报报”(美国美国)“国家地理杂志国家地理杂志”(National Geography)(美国美国)“发现发现”(Discovery)电视频道电视频道(美国美国)“今日今日”(Today)电视频

14、道电视频道“英英国国 广播公司广播公司”(BBC)电视频道电视频道科学杂志，自然杂志，科学杂志，自然杂志，等等等等“大麻使大脑变的聪明大麻使大脑变的聪明”:加拿大加拿大“环球邮报环球邮报”(2005年年10月月14日日):“Rose 和和 Heidi 昨天在温哥华大麻俱乐部昨天在温哥华大麻俱乐部享用大麻享用大麻”Google:xia zhang and marijuana二项研究：二项研究：1、用大麻素促进海马新生神经元从而抑制焦虑、用大麻素促进海马新生神经元从而抑制焦虑 和抑郁和抑郁 2、解密药物成瘾的控制机理解密药物成瘾的控制机理解密药物成瘾的控制机理并用特异干解密药物成瘾的控制机理并用特

15、异干扰扰肽肽通过打断抑癌酶通过打断抑癌酶 PTEN 与与 5-HT2C 受体间的蛋白受体间的蛋白-蛋白连接来蛋白连接来抑制药物奖赏和成瘾抑制药物奖赏和成瘾季少平季少平,张芸张芸,Jamie Van Cleemput,江江文文,辽梅辽梅,吕垒吕垒,万其万其,Jon Backstrom,张遐张遐*“Nature Medicine”2006,12:324-329 “自然医学自然医学”(2004年影响因子年影响因子 31.2)背景背景 大麻大麻海洛因海洛因 尼古丁尼古丁 酒精酒精 可卡因可卡因腹侧被盖区腹侧被盖区(VTA)伏膈核伏膈核 背景背景 大麻大麻海洛因海洛因 尼古丁尼古丁 酒精酒精 可卡因可卡

16、因腹侧被盖区腹侧被盖区(VTA)伏膈核伏膈核 5-HT2C 受体激动剂可通过降低受体激动剂可通过降低 VTA 多巴胺能神经元活动来抑制多巴胺能神经元活动来抑制滥用药滥用药(毒毒)物的奖赏效应物的奖赏效应背景背景 大麻大麻海洛因海洛因 尼古丁尼古丁 酒精酒精 可卡因可卡因腹侧被盖区腹侧被盖区(VTA)伏膈核伏膈核 5-HT2C 受体激动剂可通过降低受体激动剂可通过降低 VTA 多巴胺能神经元活动来抑制多巴胺能神经元活动来抑制滥用药滥用药(毒毒)物的奖赏效应物的奖赏效应推论推论:在脑内广泛分布的抑癌酶在脑内广泛分布的抑癌酶 PTEN 可通过可通过蛋白蛋白-蛋白连接来抑制蛋白连接来抑制5-HT2C

17、受体受体PTEN 和和 5-HT2C 受体之间是否有受体之间是否有蛋白蛋白-蛋白连接？蛋白连接？用用 PC12 培养细胞作免疫共沉淀培养细胞作免疫共沉淀(Co-IP)PTEN 和和 5-HT2C 受体间的蛋白受体间的蛋白-蛋白连接发生在蛋白连接发生在 5-HT2C 受体分子的什么部位？受体分子的什么部位？Pull-down assay:细胞细胞内内C-末端末端细胞细胞膜膜细胞外细胞外PTEN 和和 5-HT2C 受体间的蛋白受体间的蛋白-蛋白连接发生在蛋白连接发生在 5-HT2C 受体分子的什么部位？受体分子的什么部位？胞内第三环胞内第三环 C-末端末端细胞外细胞外Pull-down assa

18、y:PTEN 和和 5-HT2C 受体间的蛋白受体间的蛋白-蛋白连接发生在蛋白连接发生在 5-HT2C 受体胞内第三环的哪段蛋白序列？受体胞内第三环的哪段蛋白序列？Pull-downassay命名为命名为“3L4F”,即即“3环环4段段”3L4F 是是 PTEN 和和 5-HT2C 受体间蛋白受体间蛋白-蛋白连蛋白连接的关键蛋白序列吗？接的关键蛋白序列吗？在免疫共沉淀前加入在免疫共沉淀前加入 3L4F:PTEN 是怎样调控是怎样调控 5-HT2C 受体的功能？受体的功能？建立建立4个稳定转染细胞系：个稳定转染细胞系：siRNA 和和 wild-type PTEN,129R,129E。然后用然后

19、用Band-shift assay 检测检测:-PTEN 是通过其蛋白磷酸酶将由特异激动剂诱导的磷酸是通过其蛋白磷酸酶将由特异激动剂诱导的磷酸化化 5-HT2C 受体去磷酸化受体去磷酸化-用用 3L4F 肽打断肽打断 PTEN 与与 5-HT2C 受体受体间的蛋白间的蛋白-蛋白连蛋白连接可阻断接可阻断 PTEN 对对 5-HT2C 受体的去磷酸化作用受体的去磷酸化作用 PTEN整体动物实验整体动物实验1.取出取出VAT2.在免疫共沉淀前加在免疫共沉淀前加入入3L4F3L4F 是是 VTA 中中 PTEN 和和 5-HT2C 受体间蛋白受体间蛋白-蛋白连的蛋白连的关键蛋白序列关键蛋白序列VTA

20、中的哪类神经元表达中的哪类神经元表达 PTEN 和和 5-HT2C？合成特异干扰肽合成特异干扰肽:TAT-3L4F穿膜干扰肽穿膜干扰肽:TAT(HIV启动子蛋白序列启动子蛋白序列)3L4F 5-HT2cRPTEN脑内脑内VTA皮下或静脉内注射皮下或静脉内注射通过血脑屏障通过血脑屏障活体动物电生理研究活体动物电生理研究:-5-HT2C 受体张力性抑制受体张力性抑制 VTA 多巴胺能神经元多巴胺能神经元 的活动的活动-打断打断 PTEN 与与 5-HT2C 受体间的蛋白受体间的蛋白-蛋白连蛋白连 接可模拟接可模拟 5-HT2C 受体激动剂对受体激动剂对 VTA 多巴胺多巴胺 能神经元的抑制效应能神

21、经元的抑制效应-全身或全身或 VTA 内注射内注射 TAT-3L4F 打断打断 PTEN 与与 5-HT2C 受体间的蛋白受体间的蛋白-蛋白连接后可抑制大蛋白连接后可抑制大 麻诱导的麻诱导的 VTA 多巴胺能神经元活动增加多巴胺能神经元活动增加 记录支配伏膈核的记录支配伏膈核的VTA多巴多巴胺能神经元的自发放电活动胺能神经元的自发放电活动行为学研究行为学研究(1):第第2、4、6、8天注射载体天注射载体后在黑盒子中停留后在黑盒子中停留30分钟分钟 第第9天未接受注射而天未接受注射而可自由选择在白或黑盒子中停留可自由选择在白或黑盒子中停留 条条件性件性位置偏爱位置偏爱 (CPP)(CPP)实验实

22、验第第1 1、3 3、5 5、7 7天注射大麻天注射大麻后在白盒子中停留后在白盒子中停留3030分钟分钟 行为学研究行为学研究(2):升高十字架测焦虑实验升高十字架测焦虑实验 阴茎竖起实验阴茎竖起实验 进食实验进食实验行为学研究行为学研究(3):运动功能测试运动功能测试 运动力测试运动力测试 僵直测试僵直测试 斜架测试斜架测试 行走空中梁道测试行走空中梁道测试结结 论论 1.抑癌酶抑癌酶 PTEN 能通过直接蛋白能通过直接蛋白-蛋白连接来调控蛋白连接来调控 5-HT2C 受体功受体功能能2.特异干扰肽特异干扰肽 Tat-3L4F 能通过打能通过打断抑癌酶断抑癌酶 PTEN 和和 5-HT2C

23、受受体间的蛋白体间的蛋白-蛋白连接来阻断大蛋白连接来阻断大麻和尼古丁奖赏效应麻和尼古丁奖赏效应;Tat-3L4F不会诱导不会诱导“副作用副作用”“哈哈，再也不吸毒了。哈哈，再也不吸毒了。谢谢了，魔肽。谢谢了，魔肽。”新新 闻闻 报报 道道(2006年年2月月14日日)“An international research team led by Dr.Xia Zhang from the University of Saskatchewan has discovered a universal strategy combating drug addiction”加拿大四大国家电视频道加拿大四大国

24、家电视频道:加拿大新闻加拿大新闻(CTV)加拿大广播公司加拿大广播公司(CBC)环球环球(Globe)Shaw 等等等等Google:xia zhang and drug addiction张遐和研究生张遐和研究生Jamie Van Cleemput-Jon Backstrom 教授教授(美国范德比尔特大学美国范德比尔特大学)-白白 光教授光教授 (美国马里兰大学美国马里兰大学)-万万 其教授其教授 (加拿大多伦多大学加拿大多伦多大学)-王雨田教授王雨田教授 (加拿大不列癫哥伦比亚大学加拿大不列癫哥伦比亚大学)致致 谢谢-加拿大卫生研究院加拿大卫生研究院(CIHR)杰出青年基金杰出青年基金-加

25、拿大卫生研究院加拿大卫生研究院(CIHR)科研基金科研基金-加拿大自然科学和工程研究委员会加拿大自然科学和工程研究委员会 (NSERC)发现基金发现基金-加拿大心脏和中风基金委加拿大心脏和中风基金委 (HSF)科研基金科研基金 欢迎到加拿大首都渥太华市欢迎到加拿大首都渥太华市 加拿大国会大厦加拿大国会大厦 国家美术馆国家美术馆 Does Tat-3L4F affect learning and short memory?Morris water maze testDoes Tat-3L4F affect long-term memory?Morris water maze testDoes T

26、at-3L4F affect the cannabinoid withdrawal syndrome(CWS)?HU210 x 5 daysCB1 antagonistCWSLithium blocked CWS,whereas Tat-3L4F did not produce significant effects on CWS.Tat-3L4F,Vehicle,or lithiumDoes Tat-3L4F affect nicotine relapse?Nicotinex 14 daysAbsencex 7 daysNicotine CPP x 3 daysTat-3L4F significant inhibited nicotine relapse.Absencex 5 daysCPP box with or without Tat-3L4F