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1、外周血单个核细胞分离外周血单个核细胞分离实验原理实验原理 外周血中的单个核细胞（外周血中的单个核细胞（PBMCPBMC）包括单核细胞和淋巴细胞，）包括单核细胞和淋巴细胞，其常用的分离方法为密度梯度离心法，采用其常用的分离方法为密度梯度离心法，采用ficollficoll分层液分层液作为分离液。作为分离液。FicollFicoll分层液即为聚蔗糖分层液即为聚蔗糖-泛影葡胺分层液，其密度为泛影葡胺分层液，其密度为1.0771.0770.0010.001。外周血中的红细胞和粒细胞密度较大，为。外周血中的红细胞和粒细胞密度较大，为1.0901.090左右，而左右，而PBMCPBMC密度为密度为1.05
2、01.0501.0771.077，血小板为，血小板为1.0301.0301.0351.035。红细胞和粒细胞比重大，离心后沉于管底；红细胞和粒细胞比重大，离心后沉于管底；PBMCPBMC的比重的比重小于或等于分层液，离心后漂浮于分层液的液面上，也可小于或等于分层液，离心后漂浮于分层液的液面上，也可有少部分细胞悬浮在分层液中。吸取分层液液面上的细胞，有少部分细胞悬浮在分层液中。吸取分层液液面上的细胞，就可从外周血中分离到单个核细胞。就可从外周血中分离到单个核细胞。主要的试剂和器材主要的试剂和器材 FicollFicoll分层液分层液 250U/ml 250U/ml 肝素溶液肝素溶液 5g/L5g
3、/L台盼兰台盼兰 HanksHanks液、含液、含2020灭活小牛血清的灭活小牛血清的HanksHanks液液 注射器、一次性试管、一次性吸管、注射器、一次性试管、一次性吸管、细胞计数板细胞计数板、载玻片、盖玻片、加样枪、一次性枪头载玻片、盖玻片、加样枪、一次性枪头 水平离心机、显微镜水平离心机、显微镜（注：绿色字体的物品三组一份，放在中间组；一（注：绿色字体的物品三组一份，放在中间组；一次性的物品请适量取材。）次性的物品请适量取材。）实验步骤实验步骤 抽取静脉血抽取静脉血1.5ml1.5ml，打到肝素抗凝管中，再加等量的，打到肝素抗凝管中，再加等量的HanksHanks液，混液，混匀，称为稀
4、释的全血匀，称为稀释的全血 将稀释的全血将稀释的全血沿管壁缓缓沿管壁缓缓地加到分层液上地加到分层液上 水平水平离心，离心，2000rpm2000rpm20min20min 吸取白色云雾状的那一层到另一玻璃管中吸取白色云雾状的那一层到另一玻璃管中 加入加入4ml Hanks4ml Hanks液，混匀，液，混匀，1000rpm1000rpm5min 5min，弃上清（洗涤细胞），弃上清（洗涤细胞）将细胞重复洗涤将细胞重复洗涤2 2次（末次用含次（末次用含2020灭活小牛血清的灭活小牛血清的HanksHanks液洗）液洗）末次洗涤后，弃上清，留在管底的即为末次洗涤后，弃上清，留在管底的即为PBMCP
5、BMC，用含，用含2020灭活小牛灭活小牛血清的血清的HanksHanks液液0.5ml0.5ml重悬细胞重悬细胞 充池、计数，将细胞调节充池、计数，将细胞调节成成1 12 210106 6/ml/ml 取取1d1d细胞悬液和细胞悬液和1d1d台盼兰于玻片上，混匀，计数台盼兰于玻片上，混匀，计数100100个细胞，计个细胞，计算细胞活力算细胞活力实验结果实验结果 PBMCPBMC计数结果记录和计算计数结果记录和计算 单个核细胞活力计数结果记录和活力计算单个核细胞活力计数结果记录和活力计算 注：死细胞染成蓝色，活细胞不染色注：死细胞染成蓝色，活细胞不染色注意事项注意事项将血液进行稀释可降低血液黏
6、稠度和红细胞的聚集，提高将血液进行稀释可降低血液黏稠度和红细胞的聚集，提高单个核细胞的收获量。单个核细胞的收获量。分层液应直接加入管底，防止浸沾四周管壁。分层液应直接加入管底，防止浸沾四周管壁。将稀释的全血加于分层液上时务必小心，不要扰乱界面以将稀释的全血加于分层液上时务必小心，不要扰乱界面以影响分离效果。影响分离效果。温度变化可直接影响分层液的密度，从而影响细胞的收获温度变化可直接影响分层液的密度，从而影响细胞的收获率和纯度，故应在室温（率和纯度，故应在室温（18182525）下进行实验，分层液）下进行实验，分层液使用之前应预温至室温。温度过低，淋巴细胞丢失增多，使用之前应预温至室温。温度过
7、低，淋巴细胞丢失增多，温度过高，会影响淋巴细胞活性。温度过高，会影响淋巴细胞活性。分离时的转速与时间应根据不同样品作相应调整。离心速分离时的转速与时间应根据不同样品作相应调整。离心速度在度在200020002500rpm2500rpm，离心时间为，离心时间为15-20min15-20min，离心后若间，离心后若间白雾状细胞层中仍掺有红细胞，应该提高转速或延长离心白雾状细胞层中仍掺有红细胞，应该提高转速或延长离心时间，若淋巴细胞丢失过多，则应该适当降低转速或离心时间，若淋巴细胞丢失过多，则应该适当降低转速或离心时间。时间。应用与评价应用与评价 本方法操作简便、稳定。细胞本方法操作简便、稳定。细胞
8、回收率回收率达达80809090，单个核细胞，单个核细胞纯度纯度可达可达9595，细胞活力细胞活力可达可达9595以上。以上。该方法是目前最理想、最常用的分离淋巴细胞的该方法是目前最理想、最常用的分离淋巴细胞的手段，其制备的细胞（手段，其制备的细胞（主要是淋巴细胞，约占主要是淋巴细胞，约占90%90%95%95%）悬液已能满足许多细胞免疫实验要求，）悬液已能满足许多细胞免疫实验要求，也可用于进一步制备也可用于进一步制备T T细胞、细胞、B B细胞及单核细胞，细胞及单核细胞，故在免疫学实验中有广泛应用，是细胞免疫检测故在免疫学实验中有广泛应用，是细胞免疫检测中最基本的方法之一。中最基本的方法之一
9、。E E花环形成试验花环形成试验实验原理实验原理 人外周血中的人外周血中的T T细胞表面具有能与绵羊红细胞（细胞表面具有能与绵羊红细胞（SRBCSRBC）表面糖肽结合的受体，称为表面糖肽结合的受体，称为E E受体受体（CD2CD2）。已证实）。已证实E E受体是人类受体是人类T T细胞所特有的表面标志。当细胞所特有的表面标志。当T T细胞与细胞与SRBCSRBC混合后，混合后，SRBCSRBC便粘附于便粘附于T T细胞表面，呈现花环状。细胞表面，呈现花环状。通过花环形成通过花环形成检测检测T T细胞的方法细胞的方法，称为，称为E E花环形成试花环形成试验验。根据花环形成的多少，可测知。根据花环
10、形成的多少，可测知T T细胞的数目，从细胞的数目，从而间接了解机体细胞免疫功能状态，判断疾病的预而间接了解机体细胞免疫功能状态，判断疾病的预后，考核药物疗效等。后，考核药物疗效等。主要试剂和器材主要试剂和器材 0.50.5SRBCSRBC悬液悬液 0.80.8戊二醛戊二醛 瑞氏染液瑞氏染液（在水槽边）（在水槽边）一次性滴管、玻璃管、载玻片、盖玻片、加样枪、一次性滴管、玻璃管、载玻片、盖玻片、加样枪、一次性枪头一次性枪头 离心机、离心机、44冰箱、显微镜冰箱、显微镜（注：绿色字体的物品三组一份，放在中间组；一（注：绿色字体的物品三组一份，放在中间组；一次性的物品请适量取材。）次性的物品请适量取材
11、。）实验步骤实验步骤 取取1 12 210106 6/ml/ml的的PBMCPBMC悬液悬液0.2ml0.2ml和和0.50.5SRBC 0.2mlSRBC 0.2ml，混匀，混匀，3737水浴水浴5min5min。500rpm500rpm5min5min，放放44冰箱冰箱2h2h（午休时间）（午休时间）。轻轻吸去上清轻轻吸去上清0.2ml0.2ml，沿管壁轻轻沿管壁轻轻加入加入0.80.8戊二醛戊二醛0.2ml,0.2ml,放放44冰箱冰箱20min20min。轻轻吹吸轻轻吹吸均匀沉淀细胞。均匀沉淀细胞。结果观察结果观察湿片法：湿片法：取取1d1d细胞悬液滴加于玻片上，直细胞悬液滴加于玻片上
12、，直接高倍镜下观察。接高倍镜下观察。干片法：干片法：取细胞悬液涂片，自然干燥，瑞取细胞悬液涂片，自然干燥，瑞氏染色氏染色I I液（蓝色）液（蓝色）10s10s，IIII液（无色）液（无色）2min2min，流水轻轻冲洗，干燥后，油镜下，流水轻轻冲洗，干燥后，油镜下观察。观察。结果判断结果判断 淋巴细胞呈蓝紫色，淋巴细胞呈蓝紫色，SRBCSRBC淡蓝色，凡结合淡蓝色，凡结合3 3个或个或3 3个个以上以上SRBCSRBC的细胞则为的细胞则为E E花环形成细胞（花环形成细胞（ERFCERFC），计），计数数100100个淋巴细胞，求出个淋巴细胞，求出E E花环形成率。花环形成率。正常值：正常值：E
13、tEt花环形成率为花环形成率为60608080注意事项注意事项 SRBCSRBC与淋巴细胞混合后离心速度不能过高，置与淋巴细胞混合后离心速度不能过高，置44应应至少至少1h1h以上或过夜。以上或过夜。SRBCSRBC以保存以保存1 1周以内最好，超过周以内最好，超过2 2周则与淋巴细胞结周则与淋巴细胞结合力下降，超过合力下降，超过5 56 6周，则不能再用。周，则不能再用。SRBCSRBC与淋巴细胞混合比例以与淋巴细胞混合比例以100:1100:1200:1200:1为宜；淋为宜；淋巴细胞离体后不能超过巴细胞离体后不能超过6h6h，否则会影响花环形成率。，否则会影响花环形成率。温度对实验结果影
14、响较大，故实验温度条件应该保温度对实验结果影响较大，故实验温度条件应该保持一致，从持一致，从44取出后应立即计数。取出后应立即计数。计数前将沉淀重悬时，使细胞团块松散即可，不可计数前将沉淀重悬时，使细胞团块松散即可，不可强力吹打，以免强力吹打，以免SRBCSRBC从淋巴细胞上脱落。从淋巴细胞上脱落。应用与评价应用与评价该试验可用于先天性细胞免疫缺陷病的检测；该试验可用于先天性细胞免疫缺陷病的检测；肿瘤病人疗效观察及预后判断；评价迟发型超肿瘤病人疗效观察及预后判断；评价迟发型超敏反应、某些感染和组织器官移植，了解机体敏反应、某些感染和组织器官移植，了解机体细胞免疫状态；探讨某些疾病发病机制；考核
15、细胞免疫状态；探讨某些疾病发病机制；考核药物疗效及研究药物作用机制；也可用于药物疗效及研究药物作用机制；也可用于T T淋巴淋巴细胞的分离。细胞的分离。该方法简便易行，曾被广泛应用，但影响因素该方法简便易行，曾被广泛应用，但影响因素较多，结果偏差较大，已经被较多，结果偏差较大，已经被CDCD抗原免疫检测抗原免疫检测法取代。法取代。同学们：同学们：中午离开前，请将细胞计数板冲洗中午离开前，请将细胞计数板冲洗干净，关闭显微镜光源。下午实验后，干净，关闭显微镜光源。下午实验后，请将使用过的一次性器材丢入垃圾桶，请将使用过的一次性器材丢入垃圾桶，使用过的玻璃器材冲洗干净后放入水槽使用过的玻璃器材冲洗干净
16、后放入水槽边上的回收桶中，整理好自己的台面再边上的回收桶中，整理好自己的台面再离开！离开！值日生请认真做好本职工作！值日生请认真做好本职工作！细胞计数细胞计数一一.实验原理实验原理 应用显微镜的成像原理，并借助血细胞计数板，计算单位应用显微镜的成像原理，并借助血细胞计数板，计算单位体积的细胞数量。体积的细胞数量。二实验步骤二实验步骤1.1.取细胞计数板，加盖玻片盖住两边的小槽。取细胞计数板，加盖玻片盖住两边的小槽。2.充液：用小滴管将一小滴细胞悬液滴在盖玻片边缘的玻充液：用小滴管将一小滴细胞悬液滴在盖玻片边缘的玻片上，使液体借毛细管作用自动渗透入计数室中。如滴片上，使液体借毛细管作用自动渗透入
17、计数室中。如滴入过多，溢出并流入两侧槽内，使盖玻片浮起，体积改入过多，溢出并流入两侧槽内，使盖玻片浮起，体积改变，会影响计数结果，需用纱布将计数池和玻片擦干，变，会影响计数结果，需用纱布将计数池和玻片擦干，重新充池。如滴入溶液过少，经多次充液，易产生气泡，重新充池。如滴入溶液过少，经多次充液，易产生气泡，也应重新充池也应重新充池。3.3.计数：充液后静置计数：充液后静置1min1min，待细胞下沉后，方可进行计数。，待细胞下沉后，方可进行计数。计数四角四个大方格中的细胞数，计数时为了防止重复计数四角四个大方格中的细胞数，计数时为了防止重复和遗漏，应按一定的顺序，先自左向右数到最后一格，和遗漏，
18、应按一定的顺序，先自左向右数到最后一格，下一行格子则自右向左，再下一行又自左向右，即呈下一行格子则自右向左，再下一行又自左向右，即呈S S形形计数计数。对于分布在刻线上的细胞，依照。对于分布在刻线上的细胞，依照“数上不数下，数上不数下，数左不数右数左不数右”的原则进行计数。的原则进行计数。4.4.求出细胞分布平均数求出细胞分布平均数=d1+d2+d3+d4/4 单个核细胞数单个核细胞数/ml=/ml=细胞分布平均数细胞分布平均数10104 4三三.注意事项注意事项 防止液体滴入过多，否则溢出并流入两侧槽内，会防止液体滴入过多，否则溢出并流入两侧槽内，会使盖玻片浮起，体积改变，会影响计数结果使盖玻片浮起，体积改变，会影响计数结果。四四.实验结果实验结果 本次实验的细胞密度控制在本次实验的细胞密度控制在12106/ml
临床免疫检验实验课件：外周血单个核细胞分离
