生物制药细胞工程单克隆抗体课件

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1、生物制药-细胞工程单克隆抗体Emil von Behring,1901,antitoxinsGeoreges Kohler and Cesar Milstein,1984,monoclonal antibodySusumu Tonegama,1987,structure of Ig geneGerald Edelman and Rodney Porter,1972,structure of antibodyPaul Ehrlich,1908,production of antibodyNobel Prize winners生物制药-细胞工程单克隆抗体发明单克隆抗体技术发明单克隆抗体技术Nobe

2、l Prize in 1984Nobel Prize in 1984生物制药-细胞工程单克隆抗体抗体发展的三个阶段抗体发展的三个阶段单克隆抗体单克隆抗体基因工程抗体基因工程抗体多克隆抗血清多克隆抗血清生物制药-细胞工程单克隆抗体传统传统抗血清抗血清抗抗 原原免免 疫疫所有抗所有抗体体混合混合1 234BALB/c12341 234生物制药-细胞工程单克隆抗体细胞工程杂交瘤技术鼠单抗鼠单抗人单抗人单抗大鼠大鼠小鼠小鼠产量高、操作比产量高、操作比小鼠麻烦小鼠麻烦 少用少用易操作、多用易操作、多用HAMAHAMA反应反应人人杂交瘤人人杂交瘤人人B B细胞、骨髓瘤细胞、骨髓瘤细胞融合细胞融合人鼠杂交瘤

3、人鼠杂交瘤人人B B细胞、鼠骨髓细胞、鼠骨髓瘤细胞融合瘤细胞融合杂交瘤制备人单抗的问题：染色体易丢失、抗体分泌不稳定杂交瘤制备人单抗的问题：染色体易丢失、抗体分泌不稳定生物制药-细胞工程单克隆抗体n美国已上市美国已上市16种单克隆抗体药物种单克隆抗体药物n 2002年销售额年销售额 29亿美元亿美元n 2005年年 90亿美元亿美元n 我国的单克隆抗体药物市场还处于我国的单克隆抗体药物市场还处于起步阶段。起步阶段。生物制药-细胞工程单克隆抗体n2002年完全人源化单抗年完全人源化单抗humira获得批获得批准上市，这是单克隆抗体药物发展具有准上市，这是单克隆抗体药物发展具有里程碑意义大事，预示

4、着单克隆抗体药里程碑意义大事，预示着单克隆抗体药物一个迅猛发展的新时代的来临。物一个迅猛发展的新时代的来临。Humira是是Abbott/CAT公司开发的一种公司开发的一种治疗类风湿关节炎的单克隆抗体药物。治疗类风湿关节炎的单克隆抗体药物。生物制药-细胞工程单克隆抗体Avastin 是美国刚刚上市的治疗结肠癌的是美国刚刚上市的治疗结肠癌的抗体药物，也是第一个从抗体库中筛选抗体药物，也是第一个从抗体库中筛选出的出的 Fab 段抗体药物。段抗体药物。Avastin的上市的上市使公司的股价上升了使公司的股价上升了90亿美元。亿美元。生物制药-细胞工程单克隆抗体抗血小板凝集的原理图抗血小板凝集的原理图

5、生物制药-细胞工程单克隆抗体生物制药-细胞工程单克隆抗体全球有超过全球有超过200家上市或未上市公司正在研发用于临床家上市或未上市公司正在研发用于临床诊断和治疗的单克隆抗体诊断和治疗的单克隆抗体 正在进行临床试验的抗体公司（正在进行临床试验的抗体公司（38家）：家）：AbgenixAlexion PharmAltarexApplied Molecular EvolutionBASFBiogenBioTransplantCAT(Cambridge Ab Tech)CelltechCenteonCentocor(Johnson&Johnson)ElanElsaiEli LillyGenzyme T

6、ransgenicsGenentechGenmabHoffman-La RocheICOS PharmIDEC Pharm/MitsubishiImClone SysImmunotechKaneboKnoll PharmLeukoSiteMedarexMedimmuneNorvartisOrtho BiotechPasteur-MerieuxProgenicsProtein Design LabScheringSmithKline BeechamTanox BiosystemsTechnicloneXomaZenyaku生物制药-细胞工程单克隆抗体生物制药-细胞工程单克隆抗体生物制药-细胞工程

7、单克隆抗体生物制药-细胞工程单克隆抗体SDA批准进入临床的体内诊断用抗体批准进入临床的体内诊断用抗体 131I-抗人肝癌单克隆抗体抗人肝癌单克隆抗体(HAb18、Hepama-1）99mTc-抗人小细胞肺癌单克隆抗体（抗人小细胞肺癌单克隆抗体（2F7）生物制药-细胞工程单克隆抗体SDA批准进入临床的治疗用单抗批准进入临床的治疗用单抗抗抗T细胞免疫毒素细胞免疫毒素抗抗C-ALL免疫毒素免疫毒素131I-抗肝癌单克隆抗体抗肝癌单克隆抗体抗人抗人CD25单克隆抗体单克隆抗体抗乙脑单克隆抗体抗乙脑单克隆抗体抗流行性出血热抗体抗流行性出血热抗体抗人抗人CD3单克隆抗体单克隆抗体抗人抗人IL-8单克隆抗体

8、单克隆抗体生物制药-细胞工程单克隆抗体抗体治疗疾病的机制抗体治疗疾病的机制n抗原失活n免疫效应细胞吞噬n抗原表面弱化易受补体破坏生物制药-细胞工程单克隆抗体单抗研发的演变历程单抗研发的演变历程鼠单抗鼠单抗100%鼠源鼠源OKT-3PanorexZevalin鼠鼠/人嵌合单抗人嵌合单抗(66-75%人源人源)ReoPro,RituxanRemicadeSimulect人源化单抗人源化单抗(90-95%人源人源)Zenapax,Mylotarg,Herceptin,CampathSynagis100%人源人源 生物制药-细胞工程单克隆抗体生物制药-细胞工程单克隆抗体生物制药-细胞工程单克隆抗体生物

9、制药-细胞工程单克隆抗体生物制药-细胞工程单克隆抗体每個每個 抗原決定基抗原決定基 至少誘生一種至少誘生一種專一性抗体專一性抗体生物制药-细胞工程单克隆抗体生物制药-细胞工程单克隆抗体1 多克隆抗血清多克隆抗血清对健康人用疫苗进行主动对健康人用疫苗进行主动免疫，免疫前（免疫，免疫前（a a）和免）和免疫后疫后1010天天 （b b）分别采血）分别采血并对血清蛋白进行凝胶电并对血清蛋白进行凝胶电泳分析。免疫前血清中的泳分析。免疫前血清中的g g 球蛋白条带较宽，免疫球蛋白条带较宽，免疫之后则相对集中。之后则相对集中。Bruton Bruton 氏病患者血清蛋白中的氏病患者血清蛋白中的 球蛋白条带

10、缺失（球蛋白条带缺失（c c）。）。a a1 a a2b b 白蛋白白蛋白球蛋白球蛋白（c）（a）（b）生物制药-细胞工程单克隆抗体来源来源:组织和细胞，其成分比较复杂。组织和细胞，其成分比较复杂。1.1.组织和细胞成分混合抗原制备组织和细胞成分混合抗原制备 2.2.蛋白质抗原制备蛋白质抗原制备 3.3.核酸抗原制备核酸抗原制备 4.4.类脂多糖抗原制备类脂多糖抗原制备 5.5.免疫球蛋白片段制备免疫球蛋白片段制备 6.6.纯化抗原的鉴定纯化抗原的鉴定 二、可溶性抗原制备及鉴定可溶性抗原制备及鉴定可溶性抗原可溶性抗原:蛋白质、糖蛋白、脂蛋白、酶类、蛋白质、糖蛋白、脂蛋白、酶类、补体、脂多糖、细

11、菌外毒素和核酸补体、脂多糖、细菌外毒素和核酸返回返回生物制药-细胞工程单克隆抗体 组织和细胞成分混合抗原制备程序组织和细胞成分混合抗原制备程序上清液上清液澄清澄清所用材料必须是新鲜或低温保存的所用材料必须是新鲜或低温保存的去除包去除包膜或结膜或结缔组织缔组织脏器进行灌洗脏器进行灌洗洗去血迹洗去血迹及污物及污物NSNS内含内含0.5g0.5gL NaNL NaN2 2冷浴中组织剪碎冷浴中组织剪碎装入捣碎机简内高速装入捣碎机简内高速粉碎制成组织匀浆液粉碎制成组织匀浆液3000r3000rminmin10min10min取上清液取上清液去除细胞碎片去除细胞碎片及微小组织及微小组织离心离心生物制药-细

12、胞工程单克隆抗体 绵羊红细胞的制备流程图绵羊红细胞的制备流程图 摇动摇动15-20min15-20min 44可保存可保存3 3周周 取适量取适量 NSNS洗涤洗涤3 3次次2000r/min2000r/min 10min 10minNSNS稀释至稀释至 2 25%5%生物制药-细胞工程单克隆抗体 细菌细胞抗原的制备流程细菌细胞抗原的制备流程图图液体培养或液体培养或 斜面培养斜面培养 3724h3724h100100水浴水浴 2 22.5h2.5h 杀菌杀菌无菌试验无菌试验NSNS稀释成稀释成8 81010亿亿/ml/mlO O菌体抗原菌体抗原返回返回生物制药-细胞工程单克隆抗体杂交瘤技术过程

13、杂交瘤技术过程生物制药-细胞工程单克隆抗体生物制药-细胞工程单克隆抗体生物制药-细胞工程单克隆抗体多价抗原多价抗原单克隆单克隆（致敏的（致敏的B细胞）细胞）单克隆抗体单克隆抗体生物制药-细胞工程单克隆抗体生物制药-细胞工程单克隆抗体生物制药-细胞工程单克隆抗体生物制药-细胞工程单克隆抗体癌细胞可培养生长浆细胞B cell可分泌抗体融合瘤HybridomaYYYYYYYYYYYYYYYYYY细胞融合两组两组染色体混在一起染色体混在一起也可以培也可以培养养生長生長产产生生专专一性抗一性抗体体一個個 B cell 只只产产生一生一种种抗抗体体生物制药-细胞工程单克隆抗体 一一个个 B 细细胞只能生胞

14、只能生产产一一种种抗体，抗体，对对付某一付某一 抗原決定基。抗原決定基。BBBYYYY抗 原BYB11Y22Y33Y44生物制药-细胞工程单克隆抗体1234mmmm12341234单单抗抗细细胞融合胞融合取出脾細胞取出脾細胞+癌細胞癌細胞各抗各抗体体分分开开生物制药-细胞工程单克隆抗体1234mmmm1234YYYYYYYYY生物制药-细胞工程单克隆抗体mm核酸生物制药-细胞工程单克隆抗体 抗体X-a-b-c-d-a -b -c -d抗原決定基BALB/cabbcd传统抗体(抗血清)是所有抗体的混和 脾脏产生各种 B 細胞免疫前要先把抗原作成乳剂免疫 抗原采血后可得传统抗血清已建立之小鼠骨髓癌

15、细胞株由脾脏收集 B 細胞抗原通常有多个抗原決定基免疫后的脾脏约在两月內注射五到八次Ag X生物制药-细胞工程单克隆抗体-d细胞融合-a-b-c-dAgXAgXELISAHATPEG Cell fusionHybridoma cells 融合瘤细胞（Subcloning）(确定只有一种细胞)ddabcdabcd+-X-d-c-b-a+-dNS-1骨髓癌细胞B cell脾细胞分株培养筛选筛选单抗传统抗体(抗血清)试验专一性对抗原的反应无法分辨完全不同d旧有抗原d新的抗原生物制药-细胞工程单克隆抗体生物制药-细胞工程单克隆抗体抗体的结构抗体的结构生物制药-细胞工程单克隆抗体1 小分子抗体小分子抗体

16、3 鼠单抗人源化鼠单抗人源化基因工程改造的抗体基因工程改造的抗体2生物制药-细胞工程单克隆抗体123生物制药-细胞工程单克隆抗体小分子抗体小分子抗体FabFab：抗原结合片断抗原结合片断FvFv：可变区片段可变区片段ScFvScFv：单链可变区片段单链可变区片段SdAbSdAb：单区抗体单区抗体 生物制药-细胞工程单克隆抗体免疫球蛋白基因载体的构建H链表达载体链表达载体L链表达载体链表达载体共转染细胞共转染细胞Pr VH CH1 Pr VL CL图图5 Fab 抗体分子的制备抗体分子的制备I Fab antibody molecule生物制药-细胞工程单克隆抗体抗体分泌细胞抗体分泌细胞VHVL

17、CL-S-S-CH1图图5 Fab 抗体分子的制备抗体分子的制备生物制药-细胞工程单克隆抗体II Fv antibody molecule生物制药-细胞工程单克隆抗体双特异性抗体双特异性抗体 抗原抗原A A抗原抗原B B-S-S-FabVHCH1VL-S-S-CH1VHVLFvVHVL 许多抗原抗体反应要求双价的许多抗原抗体反应要求双价的抗原结合位点，使抗原分子上的两抗原结合位点，使抗原分子上的两个表位交联或使两个抗原分子连接。个表位交联或使两个抗原分子连接。将识别肿瘤抗原的抗体和识别细胞将识别肿瘤抗原的抗体和识别细胞毒性免疫效应细胞表面分子的抗体毒性免疫效应细胞表面分子的抗体连结在一起，可使

18、效应细胞更容易连结在一起，可使效应细胞更容易与肿瘤细胞结合识别，取得杀伤肿与肿瘤细胞结合识别，取得杀伤肿瘤细胞的作用。瘤细胞的作用。生物制药-细胞工程单克隆抗体CTLCD3TUMORCELL-S-S-VHCH1VL-S-S-CH1抗原抗原A A抗原抗原B B生物制药-细胞工程单克隆抗体 抗原结合部位与生物活性蛋白结合抗原结合部位与生物活性蛋白结合 含含FcFc段的抗体融合蛋白段的抗体融合蛋白免疫黏附素免疫黏附素 FcFc的作用：检测、纯化、的作用：检测、纯化、延长血清中半寿期延长血清中半寿期 生物学效应功能生物学效应功能生物制药-细胞工程单克隆抗体G-CSFFcFusion ProteinDN

19、A ligationexpressionFcFc的作用：延长血清中半寿期的作用：延长血清中半寿期生物制药-细胞工程单克隆抗体将小鼠将小鼠IgIg基因敲除，转染人基因敲除，转染人IgIg基因，在基因，在小鼠体内产生人小鼠体内产生人AbAb，再经杂交瘤技术，再经杂交瘤技术，产生大量完全人源化抗体产生大量完全人源化抗体生物制药-细胞工程单克隆抗体鼠单抗人源化鼠单抗人源化生物制药-细胞工程单克隆抗体生物制药-细胞工程单克隆抗体生物制药-细胞工程单克隆抗体Pr 鼠鼠VH 人人 CH Pr 鼠鼠VL 人人 CL免疫球蛋白免疫球蛋白基因载体的构建基因载体的构建H链嵌合载体链嵌合载体L 链嵌合载体链嵌合载体共

20、转染细胞共转染细胞启动子启动子人人-鼠嵌合抗体基因工程改造策略鼠嵌合抗体基因工程改造策略 生物制药-细胞工程单克隆抗体鼠鼠VH鼠鼠VL人人CL人人CH抗体分泌细胞抗体分泌细胞人人-鼠嵌合基因工程抗体鼠嵌合基因工程抗体生物制药-细胞工程单克隆抗体定义：定义：指利用基因工程技术，将人抗体可变区（指利用基因工程技术，将人抗体可变区（V V）中互补决定簇（中互补决定簇（CDRCDR）序列改换成鼠源单抗）序列改换成鼠源单抗CDRCDR序列。序列。重构成既具有鼠源性单抗的特异性又保持抗体亲和重构成既具有鼠源性单抗的特异性又保持抗体亲和力的人源化抗体。力的人源化抗体。RAbRAb亦叫亦叫“重构型抗体重构型抗

21、体”，因其，因其主要涉及主要涉及CDRCDR的的“移植移植”，又可称为，又可称为“CDRCDR移植抗体移植抗体意义：意义：多种特异的鼠源单抗有可能应用于临床治疗多种特异的鼠源单抗有可能应用于临床治疗 人源化抗体又称人源化抗体又称CDRCDR移植抗体移植抗体生物制药-细胞工程单克隆抗体CDR序列序列 CDR序列序列 鼠单克隆抗体鼠单克隆抗体 人抗体人抗体人源化抗体人源化抗体图图4 鼠单克隆鼠单克隆V区人源化（区人源化（CDR移植）移植）生物制药-细胞工程单克隆抗体u 抗体库抗体库在原核系统功能性在原核系统功能性表 达 多 样 性 抗 体 基 因表 达 多 样 性 抗 体 基 因(repertoi

22、re)(repertoire)三三 基因工程方法研制新的单抗基因工程方法研制新的单抗生物制药-细胞工程单克隆抗体生物制药-细胞工程单克隆抗体生物制药-细胞工程单克隆抗体生物制药-细胞工程单克隆抗体接头接头DNADNAVH VLVH VL图图2 噬菌体表面呈现的小分子抗体噬菌体表面呈现的小分子抗体 基因基因IIIIII或或基因基因VIII VIII 外壳蛋白外壳蛋白 VHVHVL生物制药-细胞工程单克隆抗体生物制药-细胞工程单克隆抗体定义：定义：将体外克隆的抗体基因片段插入噬菌将体外克隆的抗体基因片段插入噬菌体载体，转染工程细菌进行表达，然后用抗体载体，转染工程细菌进行表达，然后用抗原筛选即可获

23、得特异的单克隆噬菌体抗体。原筛选即可获得特异的单克隆噬菌体抗体。利用这一技术可以得到完全人源性的抗体，利用这一技术可以得到完全人源性的抗体，在在HIVHIV等病毒感染和肿瘤的诊断与治疗方面有等病毒感染和肿瘤的诊断与治疗方面有其独特的优越性其独特的优越性噬菌体抗体库技术噬菌体抗体库技术生物制药-细胞工程单克隆抗体用用PCRPCR扩增人抗体重链可变区扩增人抗体重链可变区(VH)(VH)和轻链可变区和轻链可变区(VL)(VL)基因基因克隆到噬菌体载体并以融合蛋白的形式表达在其外壳表面克隆到噬菌体载体并以融合蛋白的形式表达在其外壳表面用抗原抗体反应筛选出表达所需要抗体的克隆并扩增。用抗原抗体反应筛选出

24、表达所需要抗体的克隆并扩增。使抗体基因以分泌的方式表达，获得可溶性的抗体片段。使抗体基因以分泌的方式表达，获得可溶性的抗体片段。抗体库：抗体库：组合抗体文库：在建库过程中如果将组合抗体文库：在建库过程中如果将VHVH和和VLVL随机组合随机组合 人天然抗体库：抗体人天然抗体库：抗体mRNAmRNA来源于未经免疫的正常人来源于未经免疫的正常人（一）基本原理和程序（一）基本原理和程序生物制药-细胞工程单克隆抗体噬菌体抗体库噬菌体抗体库生物制药-细胞工程单克隆抗体从外周血或脾、淋巴结等组织中分离从外周血或脾、淋巴结等组织中分离B B淋巴细胞，提取淋巴细胞，提取mRNAmRNA并逆转录为并逆转录为cD

25、NAcDNA；应用抗体轻链和重链引物，根据建库的需要通过应用抗体轻链和重链引物，根据建库的需要通过PCRPCR技术扩技术扩增不同的增不同的IgIg基因片段；基因片段；构建噬菌体载体。噬菌体抗体库载体有构建噬菌体载体。噬菌体抗体库载体有噬菌体、丝状噬噬菌体、丝状噬菌体和噬菌粒三种，其中后二者是目前构建表面表达的噬菌体和噬菌粒三种，其中后二者是目前构建表面表达的噬菌体抗体库菌体抗体库(surface display antibody library)(surface display antibody library)常用载常用载体；体；表达载体转化细菌，构建全套抗体库。通过多轮的抗原亲表达载体转化

26、细菌，构建全套抗体库。通过多轮的抗原亲合吸附合吸附-洗脱洗脱-扩增，最终筛选出抗原特异的抗体克隆。扩增，最终筛选出抗原特异的抗体克隆。构建噬菌体抗体库构建噬菌体抗体库生物制药-细胞工程单克隆抗体模拟天然全套抗体库模拟天然全套抗体库抗体文库可以达到或超过抗体文库可以达到或超过10111011库容库容,能包含能包含B B细胞全部克隆细胞全部克隆建库的外源基因来自人体多克隆细胞的总建库的外源基因来自人体多克隆细胞的总mRNAmRNA通用引物具有人的种属普遍性通用引物具有人的种属普遍性抗体的抗体的VHVH和和VLVL基因的随机重组也增加了抗体的多样性基因的随机重组也增加了抗体的多样性避开了人工免疫和杂

27、交瘤技术避开了人工免疫和杂交瘤技术抗体库的大容量抗体库的大容量抗体库极高的筛选效率抗体库极高的筛选效率可获得高亲和力的人源化抗体可获得高亲和力的人源化抗体VHVH和和VLVL基因的随机重组模拟了体内抗体亲和力成熟的过程基因的随机重组模拟了体内抗体亲和力成熟的过程所用的抗体基因又来自人体所用的抗体基因又来自人体（二）噬菌体抗体库技术的特点（二）噬菌体抗体库技术的特点生物制药-细胞工程单克隆抗体生物制药-细胞工程单克隆抗体生物制药-细胞工程单克隆抗体生物制药-细胞工程单克隆抗体生物制药-细胞工程单克隆抗体13%21.7%52.3%13%生物制药-细胞工程单克隆抗体治疗性抗体的研发阶段治疗性抗体的研

28、发阶段n靶标发现靶标发现n抗体制备抗体制备n抗体筛选、确认和优化抗体筛选、确认和优化n中试工艺研究中试工艺研究n临床前研究临床前研究n临床研究临床研究生物制药-细胞工程单克隆抗体主要研究进展主要研究进展n靶抗原的发现靶抗原的发现n抗体人源化改造及人源抗体制备抗体人源化改造及人源抗体制备n提高抗体效应功能提高抗体效应功能n提高抗体表达量提高抗体表达量n其他其他生物制药-细胞工程单克隆抗体靶抗原的发现生物制药-细胞工程单克隆抗体TRAIL:TNF-related apoptosis-induced ligandTRAILR:DR4、DR5、DcR1、DcR2、OPG生物制药-细胞工程单克隆抗体Pr

29、otein extraction and digestionTreated/SickControl/HealthyMass SpectrometerProtein peptidesidentificationMS spectraquantificationcharacterizationKKYAAELHLVPOPhosphorylationKAVQQPDGLAOxidation post translational modifications(PTM)QFHFHWGSLDQPDGLAPeptides and MS/MS spectraHPLCProteomics生物制药-细胞工程单克隆抗体20

30、a5-6 Heavy ChainC5a新功能表位的确定20a5-6 Light Chain20a5-6 Fab20a5-6 Fab/C5a功能单抗识别表位可能是一个新的药靶？生物制药-细胞工程单克隆抗体生物制药-细胞工程单克隆抗体主要研究进展n靶抗原的发现n抗体人源化改造及人源抗体制备n提高抗体效应功能n提高抗体表达量n其他生物制药-细胞工程单克隆抗体治疗性抗体产生抗抗体的比例生物制药-细胞工程单克隆抗体抗体人源化的主要技术n嵌合抗体nCDR移植,FR移植,SDR移植n表面氨基酸残基人源化n抗原表位定向选择生物制药-细胞工程单克隆抗体嵌合抗体、CDR移植抗体生物制药-细胞工程单克隆抗体SDR人

31、源化方法生物制药-细胞工程单克隆抗体鼠抗体（红）和人源化抗体（绿）Fv结构的叠合图表面氨基酸残基人源化生物制药-细胞工程单克隆抗体鼠源抗体/抗原作用的复合物模型人源化抗体/抗原作用的复合物模型人源化抗体识别的抗原表位与親本抗体相同生物制药-细胞工程单克隆抗体抗原表位定向选择HL人抗体重链文库L HLLLLHL HLHHHH高亲和力人抗体抗原亲和筛选抗原亲和筛选+人抗体轻链文库人-鼠抗体库+鼠抗体生物制药-细胞工程单克隆抗体人源抗体制备技术n 人人杂交瘤技术n EB病毒转化技术n 人源抗体库 噬菌体抗体库 合成抗体库 核糖体展示抗体库n 转基因动物生物制药-细胞工程单克隆抗体生物制药-细胞工程单

32、克隆抗体人源抗体的生产过程人源抗体的生产过程生物制药-细胞工程单克隆抗体大容量抗体库10781089抗体亲和力10-610-710-710-8109抗体库容10910-810-9生物制药-细胞工程单克隆抗体合成抗体库生物制药-细胞工程单克隆抗体核糖体展示scFv文库生物制药-细胞工程单克隆抗体各种抗体库筛选方法生物制药-细胞工程单克隆抗体感染性筛选生物制药-细胞工程单克隆抗体抗原库对抗体库筛选方法生物制药-细胞工程单克隆抗体提高抗体特异性和亲和力Chain shuffling计算机模建技术定点突变技术生物制药-细胞工程单克隆抗体chain shuffling 原理示意图L HLLLLHL HL

33、HHHHHL更高亲和力抗体亲和筛选建抗体库亲和筛选+重链文库建抗体库轻链文库高亲和力抗体+亲本抗体生物制药-细胞工程单克隆抗体计算机模建预测抗体亲和力和识别表位HA2HA4HC4H22结合自由能分子间氢键识别区域表位是否漂移Z12-378.2-402.5-435.6-434.2-431.6182128383420-3223-30,70-8976-92136-147140-146是是是否生物制药-细胞工程单克隆抗体抗体分子间氢键相互作用能（KJ）主要识别区域mCH2238-427.44136-149CH2236-425.37136-149抗体H22计算机分子设计与直接进化生物制药-细胞工程单克隆

34、抗体00.20.40.60.811.21x10-7M2x10-8M4x10-9M 8x10-10M 1.6x10-10M3x10-11M 6x10-12M 1x10-12MCH22mCH22Z12RemicadeS-B (10-11M)Ka 6x1010L/molB/F抗体CH22m亲和常数测定ItemsZ12 Ka=8107M-1 1/750CH22 Ka=9109M-1 1/6.5mCH22 Ka=61010M-1 1Remicade Ka=11010M-1 1/6Antibody affinity生物制药-细胞工程单克隆抗体移植人免疫球蛋白的小鼠生物制药-细胞工程单克隆抗体抗体结构信息具

35、有重要的研究价值生物制药-细胞工程单克隆抗体PDBView抗体结构分析抗体序列分析抗体表达分析抗体分类管理BLAST系统日志管理用户权限管理Kabat本地数据库抗体分类系统参数设置系统字典设置外部数据接口PDBGENE BANKSwiss-ProtTRRDKABAT本实验室抗体数据库抗体分析系统主界面抗体专家分析系统生物制药-细胞工程单克隆抗体Her2靶点人源抗体（HF)的设计与验证Her2晶体结构D4SDS-PAGE非还原电泳155KDaHF人源表达抗体的纯化和功能鉴定HF人源抗体基因合成、构建、表达人源化抗体设计、虚拟筛选抗体专家分析系统抗原抗体复合物结构信息分析HF人源抗体对Her2+细

36、胞的ADCC杀伤效应分析HF人源抗体对Her2靶点的特异性识别生物制药-细胞工程单克隆抗体新抗体或抗体类似物的设计n以抗原抗体复合物的晶体结 构设计新抗体n以人抗体Fc为支架设计类抗体n以全人抗体为支架设计小抗体n以非Ig的人蛋白为支架设计功能分子生物制药-细胞工程单克隆抗体PT4LinkerFC融合蛋白的构象 PT4-Linker-FC与TNF-相互作用复合物的构象 拮抗肽linkerFc融合蛋白设计生物制药-细胞工程单克隆抗体nVH结构域能够保持一定的刚性；nVH在空间上能够将几个短肽展示在一定的区域内；n抗体可变区骨架展示的外源肽段长度可以改变。CDR3CDR1CDR2FR1 FR2 F

37、R3 FR4 生物制药-细胞工程单克隆抗体PTVH5与TNF形成的复合物模型生物制药-细胞工程单克隆抗体单域抗体 单链抗体(scFv)单链抗体（TSA1、TSA2）设计生物制药-细胞工程单克隆抗体主要研究进展n靶抗原的发现n抗体人源化改造及人源抗体制备n提高抗体效应功能n提高抗体表达量n其他生物制药-细胞工程单克隆抗体提高抗体效应功能偶联细胞毒物质双特异性抗体抗体Fc突变改变抗体糖基化细胞内抗体抗体融合蛋白生物制药-细胞工程单克隆抗体抗体药物的作用机理抗体药物的作用机理n直接效应直接效应 诱导凋亡诱导凋亡 抑制增殖抑制增殖 阻断生长因子或生长因子受体阻断生长因子或生长因子受体 干扰血管生成干扰

38、血管生成n间接效应间接效应 依赖补体的细胞毒（依赖补体的细胞毒（CDC）依赖抗体的细胞毒（依赖抗体的细胞毒（ADCC)作为毒素、放射性同位素和细胞作为毒素、放射性同位素和细胞 毒药物的载体毒药物的载体 形成抗独特型抗体形成抗独特型抗体 通过双特异性抗体靶向效应细胞通过双特异性抗体靶向效应细胞生物制药-细胞工程单克隆抗体抗体偶联细胞毒物质生物制药-细胞工程单克隆抗体TUMORCELL-S-S-Fab免疫毒素(植物和细菌)同位素(I131,I125,In111)抗体导向化学疗法（甲氨喋呤,长春新碱,阿霉素）裂解药物的酶抗体偶联细胞毒物质抗体偶联细胞毒物质-S-S-生物制药-细胞工程单克隆抗体（链亲

39、和素）生物制药-细胞工程单克隆抗体免疫毒素免疫毒素（白喉毒素白喉毒素 蓖麻毒素蓖麻毒素 相思豆毒素相思豆毒素）CCVCVCCCSPDPSPDPRicin ARicin A（-FcRI-Ricin A）生物制药-细胞工程单克隆抗体抗体融合蛋白生物制药-细胞工程单克隆抗体抗体融合蛋白抗体融合蛋白 抗人抗人Her2/neu单抗单抗-IL-2 CTLA-4-Ig 抗纤维蛋白抗纤维蛋白-ProUK抗活化血小板抗活化血小板-UK生物制药-细胞工程单克隆抗体双功能抗体作用原理生物制药-细胞工程单克隆抗体BsAbBsAb效应细胞靶细胞触发受体膜表面分子 NK细胞 CD16肿瘤细胞HER2/neu抗HER2/n

40、eu抗CD16 BsAbBsAb双特异性抗体介导的杀伤作用机制（a),BsAb桥连效应细胞和靶细胞；(b),连接的触发分子启动细胞毒反应；(c),效应细胞对靶细胞产生致死性杀伤反应。细胞毒反应生物制药-细胞工程单克隆抗体细胞内抗体：在细胞内合成并作用于细胞内组分的抗体细胞核EGFREGFREGFR生物制药-细胞工程单克隆抗体生物制药-细胞工程单克隆抗体生物制药-细胞工程单克隆抗体如 抗HIV 外壳蛋白 gp120抑制艾滋病毒复制 生物制药-细胞工程单克隆抗体生物制药-细胞工程单克隆抗体抗体的ADCC和CDC效应生物制药-细胞工程单克隆抗体提高提高ADCC和和CDC的策略的策略n抗体抗体FcFc

41、突变突变n改变抗体糖基化改变抗体糖基化生物制药-细胞工程单克隆抗体Rituximab Fc的三维结构生物制药-细胞工程单克隆抗体Rituximab突变体与C1q的结合生物制药-细胞工程单克隆抗体主要研究进展n靶抗原的发现n抗体人源化改造及人源抗体制备n提高抗体效应功能n提高抗体表达量n其他生物制药-细胞工程单克隆抗体提高表达量的方法n应用扩增系统 GS/DHFRn弱化选择标记基因n应用有利于基因表达的元件 强启动子 强增强子 反式作用元件n位置效应（position effects)生物制药-细胞工程单克隆抗体生物制药-细胞工程单克隆抗体Cre-LoxP定点整合系统生物制药-细胞工程单克隆抗体

42、生物制药-细胞工程单克隆抗体生物制药-细胞工程单克隆抗体抗体的糖基化生物制药-细胞工程单克隆抗体主要研究进展n靶抗原的发现n抗体人源化改造及人源抗体制备n提高抗体效应功能n提高抗体表达量n其他生物制药-细胞工程单克隆抗体抗体可变区和框架区的影响 抗体稳定性 可溶性 折叠动力学 表达生物制药-细胞工程单克隆抗体PEG化的抗体或抗体片段生物制药-细胞工程单克隆抗体重组多克隆抗体生物制药-细胞工程单克隆抗体 重组多克隆抗体n优点：可大量生产，批间稳定性好 结合抗原的亲合力高 识别多个抗原表位，对复杂靶抗原的 治疗效果好 对于易变的抗原也能有效 生物制药-细胞工程单克隆抗体 二、单克隆抗体的应用二、单

43、克隆抗体的应用1.1.医学检验试剂：医学检验试剂：传染病的快速诊断传染病的快速诊断 寻找寻找TSATSA及检测及检测TAATAA 免疫细胞抗原检测免疫细胞抗原检测 激素测定激素测定 血中药物浓度监测血中药物浓度监测 HLAHLA分型监测分型监测2.2.导向治疗作用导向治疗作用3.3.抗原物质的分离和提纯抗原物质的分离和提纯生物制药-细胞工程单克隆抗体抗体靶向的酶前药治疗抗体靶向的酶前药治疗 ADEPTADEPT antibody directed enzyme rodrug therapy antibody directed enzyme rodrug therapy 生物制药-细胞工程单克隆

44、抗体-S-S-药物前体药物前体(无毒无毒)抗体与酶分子偶联 Tumor cell毒性药物毒性药物生物制药-细胞工程单克隆抗体n2、ADEPT体系的构成要素体系的构成要素 n抗体抗体 n选择有效靶抗原：肿瘤细胞表面表达，分泌进选择有效靶抗原：肿瘤细胞表面表达，分泌进入肿瘤细胞间质，常出现在血浆中，竞争入肿瘤细胞间质，常出现在血浆中，竞争 n以具有不同的抗原靶向性的多种抗体与相同酶以具有不同的抗原靶向性的多种抗体与相同酶构建构建 nIgGIgG1 1 IgG IgG2 2 或或F(ab)F(ab)2 2 Fab ScFv Fab ScFv重组的抗原结重组的抗原结合蛋白合蛋白 生物制药-细胞工程单克

45、隆抗体n酶酶 n不能用广泛存在于人体内的酶不能用广泛存在于人体内的酶 如：细菌、植物来源如：细菌、植物来源 有免疫原性有免疫原性 n3类酶：类酶：a a 无哺乳动物同源性的非哺乳动物来源无哺乳动物同源性的非哺乳动物来源 如羧肽酶、青霉素如羧肽酶、青霉素G（V）氨基化酶）氨基化酶 避避免内源性酶非特异性活化，可能诱发免疫反应免内源性酶非特异性活化，可能诱发免疫反应 生物制药-细胞工程单克隆抗体nb b 具哺乳动物同源性的非哺乳动物来源具哺乳动物同源性的非哺乳动物来源n 如如葡苷酸酶葡苷酸酶 人血液中低水平，催化能力弱，人血液中低水平，催化能力弱，n 最适最适PH5.4PH5.4 E.Coli B

46、-G最适最适PH6.8 羧肽酶羧肽酶A 大肠杆菌硝基还原酶（大肠杆菌硝基还原酶（NR）人体中人体中NR对底物结构要求不同于细菌对底物结构要求不同于细菌 c c 哺乳动物来源酶哺乳动物来源酶n碱性磷酸酶、碱性磷酸酶、a a半乳糖苷酶半乳糖苷酶 降低偶联物免疫原性降低偶联物免疫原性 影响特异性影响特异性n解决免疫原性：抗体或抗原结合域与酶或酶的催化部位解决免疫原性：抗体或抗原结合域与酶或酶的催化部位组成融合蛋白，由组成融合蛋白，由E.Coli以活性形式生产以活性形式生产 生物制药-细胞工程单克隆抗体Tumor necrosis therapy utilizes monoclonal antibod

47、ies targeting intracellular tumor antigens on necrotic(dead)tissue.This method overcomes some of the limitations of current antibody-based therapeutic approaches.生物制药-细胞工程单克隆抗体抗体药物的研究和应用抗体药物的研究和应用生物制药-细胞工程单克隆抗体理想的抗体药物的性质理想的抗体药物的性质高特异性和高亲和力（高特异性和高亲和力（Kd=1081010L/M）对人没有免疫原性，不诱导对人没有免疫原性，不诱导HAMA反应反应游离抗体

48、不激活补体游离抗体不激活补体一旦结合到靶抗原上，能诱导效应功能一旦结合到靶抗原上，能诱导效应功能细胞系稳定，适合在无血清培养基中进行细胞系稳定，适合在无血清培养基中进行 大规模培养大规模培养抗体符合生物制品标准抗体符合生物制品标准生物制药-细胞工程单克隆抗体目前我国抗体药物发展的瓶颈目前我国抗体药物发展的瓶颈规模化动物细胞培养技术规模化动物细胞培养技术工程抗体高效表达系统工程抗体高效表达系统生物制药-细胞工程单克隆抗体今后抗体药物发展的方向今后抗体药物发展的方向寻找新的靶抗原寻找新的靶抗原基于抗原立体结构设计抗体基于抗原立体结构设计抗体基于抗原基于抗原-抗体相互作用设计小分子抗体抗体相互作用设计小分子抗体 模拟物模拟物生物制药-细胞工程单克隆抗体 人源抗体制备技术日臻成熟，全分子人抗体研究具有诱人的前景，临床应用有望进一步扩大，我国在抗体工程研究中应注重原创性，力争在国际竞争中占有一席之地。生物制药-细胞工程单克隆抗体可用单抗治疗的疾病可用单抗治疗的疾病移植排斥移植排斥肿瘤肿瘤自身免疫病自身免疫病心血管疾病心血管疾病感染性疾病感染性疾病过敏性疾病过敏性疾病