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1、PCR技术及其延伸与运用刘红亮 05.03.08 聚合酶链反响或多聚酶链反(Polymerase Chain Reaction,PCR又称无细胞克隆技术(“free bacteriacloning technique)特定的DNA片段在体外进展快速扩增的新方法。在数小时内可使几个拷贝的模板序列甚至一个DNA分子扩增107108倍，大大提高了DNA的得率。PCR技术最早由美国Cetus公司人类遗传研讨室Kary Mullis及同事于1985年发现并研制胜利的；最早的运用报道是Saiki等1985年将PCR技术运用于-珠蛋白基因扩增和镰刀状红细胞贫血的产前诊断。运用1976年Chien等分别的热稳
2、定性Taq DNA聚合酶，使PCR操作大为简化，并使PCR自动化成为能够；1987年Kary Mullis等完成了自动化操作安装，使PCR技术进展适用阶段。PCR已获得广泛运用,目前，每年都有上千篇文章发表。1991年，期刊“PCR方法与运用PCR Methods and Application在美国创刊，使有关学者有了本人的论坛和参考的专业期刊。Kary Mullis因发明了“聚合酶链式反响而获得1993年度诺贝尔化学奖。(一名加拿大籍英国科学家Michael Smith因开创了“寡核苷酸基因定点诱变的方法而与Mullis同享此荣)瑞典皇家科学院说：“PCR方法曾经广泛运用于生物医学中,该方
3、法同DNA测序法结合起来很能够将成为研讨动植物分类学的一种革新工具。如今世界各地都在运用PCR检测病人血液中的微量遗传物质，这一成就为准确诊断艾滋病及其它病症铺平了道路。PCR技术作为一种方法学革命，必将大大推进分子生物学各有关学科的研讨，使其到达一个新的高度。PCR的根本原理和根本程序 变性:先将含有所需扩增分析序列的靶DNA双链经热变性处置解开为两个寡聚核苷酸单链，退火:参与上下游引物，与互补链杂交复性。延伸:在Taq DNA聚合酶的作用下以4种三磷酸脱氧核苷dNTP为原料按5到3方向将引物延伸、自动合成新的DNA链、使DNA重新复制成双链。循环扩增 每次循环使延伸的模板添加1倍，亦即扩增
4、DNA产物添加1倍，经反复循环，使靶DNA片段指数性扩增。预变性 非常钟延伸 保管 PCR扩增属于酶促反响，所以，DNA扩增过程遵照酶促动力学原理。平台效应 靶DNA片段的扩增最初表现为直线上升，随着靶DNA片段的逐渐积累，当引物模板/DNA/聚合酶到达一定比值时，酶的促化反响趋于饱和，此时靶DNA产物的浓度不再添加，即出现所谓平台效应 PCR的特点 特异性高-聚合酶 初次报导用大肠杆菌的DNAPolymerase I的Klenow大片段。90会变性失活，需每次PCR循环都要重新参与；同时引物是在37延伸 Taq DNA聚合酶 1988年Saiki等从温泉水中分别到的水生嗜热杆菌中提取的热稳定
5、的，扩增过程中，单核苷酸的错误参入程度很低、其错配率普通只需约万分之一 高度敏感：实际上PCR可以按2n倍数扩增DNA十亿倍以上。运用证明可以将极微量的靶DNA成百万倍以上地扩增到足够检测分析量的DNA。能从100万个细胞中检出一个靶细胞，或对诸如病人口液等只含一个感染细胞的标本或仅含0.01pg的感染细胞的特异性片段样品中均可检测。快速 简便 可扩增RNA或cDNA 试剂 引物：决议扩增的特异性。根据检测的DNA不同，选用不同引物。耐热的DNA聚合酶：10PCR缓冲液500mmol/lKCl;100mmol/L Tris-HCl(pH8.4,20)150mmol/L MgCl2,1mg/ml
6、明胶。dNTP贮备液 DNA模板 操作程序 试剂混合 PCR仪程序设计：94变性30s，55退火20s，然后在72延伸30s，共循环30-35次。最后一次循环终了后，再将反响管置72温育5min，以确保充分延伸。PCR反响根本条件及其对PCR的影响 模板核酸 有机溶剂酚 蛋白质污染 核酸污染 核酸的量 引 物 引物与PCR的特异性，引物限定扩增产物的大小。合成的引物必需经聚丙烯酰胺凝胶电泳或反向高压液相层析HPLC纯化。冻干引物于-20至少保管12-24个月，液体形状于-20可保管6个月。引物不用时应存于-20保管。缓冲液 缓冲液的目的：给Taq DNA聚合酶提供一个最适酶催反响条件。目前最为
7、常用的缓冲体系为10-50mmol/LTris-HCl(Tris是一种双极性离子缓冲液，pH变化于6.8-7.8之间。将Tris浓度加大到50mmol/L，pH8.9,有时会添加产量。50mmol/L以内的KCl，50 mmol/L以上的KCl那么抑制Taq DNA聚合酶的活性。有些反响液中以NH+4代K+。反响中参与小牛血洁白蛋白100g/ml或明胶0.01%或Tween 200.05%0.1%5mmol/l 的二硫苏糖醇DTT有助于酶的稳定，尤其在扩增长片段此时延伸时间长时。Mg2+Mg2+浓度直接影响着酶的活性与忠实性。影响着引物的退火，模板与PCR产物的解链温度引物二聚体的构成等。Mg
8、2+浓度过低时，酶活力显著降低；过高时，通常会导致非特异性扩增产物的累积。Taq DNA聚合酶需求的是游离Mg2+。DNA模板，引物和dNTP 的磷酸基团均可与Mg2+结合，降低Mg2+实践浓度。三磷酸脱氧核苷酸dNTP dNTP是DNA合成的根本原料。含量太低，PCR扩增产量太少、易出现假阴性。dNTP浓度过高会导致其错误掺入即所谓的“热力背信。普通以为最适的dNTP浓度为50200mol/L。dNTP的质量也直接影响PCR反响的成败。耐热DNA聚合酶 Taq DNA聚合酶取代了大肠杆菌DNA聚合酶I大片段使 PCR得到广泛运用。Taq DNA聚合酶是从水生栖热菌Thermus Aquati
9、cusTaq中分别出的热稳定性DNA聚合酶。Taq DNA聚合酶简化了PCR程序,添加了PCR特异性及PCR扩增效率。该酶的最适温度很高79，100l反响液中含1-2.5u Taq DNA聚合酶为佳，Taq DNA聚合酶保管不当而失活是PCR实验失败的常见缘由。温度循环参数 变性温度与时间 复性温度与时间 延伸温度与时间 循环数：PCR实验中常见问题对策 假阴性问题 假阳性问题。假阴性 Taq DNA聚合酶活力不够，或活性遭到抑制 引物设计不合理 提取的模板质量或数量不过关以及 PCR系统欠妥当 循环次数不够假阳性 微量的靶基因污染 标本间的交叉污染 样品中存在有靶基因的同源序列 PCR操作时
10、要隔离不同操作区、分装试剂、简化操作程序，运用一次性吸头。PCR技术的延伸 PCR是一种技术和方法，在运用中不同的人根据本人的实验目的、结合本人的知识背景、研讨、发明了不同的PCR方法，开辟了PCR运用的新领域。如今至少有15种不同的PCR用于不同的实验。反转录PCR-Reverse transcription PCR一种检测底丰度特异 的方法互补靶cDNA生成双链靶DNA扩增靶DNARTPCR反响体系 PCR的反响体系但是模板是RNA RNA酶抑制剂RNasin 反转录酶 禽酶禽类成髓细胞性白血病病毒(Avian myeloblastosis virus,AMV)鼠酶莫洛尼鼠白血病病毒(mo
11、loney murine leukemia virus)Touch down PCR 普通PCR的体系 普通PCR的设计原理 不同的PCR过程 目的：在不知道理想退火温度的条件下保证扩出产物梯度PCR 在特殊PCR仪上进展的普通PCR 目的：寻觅最正确的退火温度 与TouchDown PCR的区别 TD PCR：对同一PCR体系采用不同的退火 温度进展 PCR循环 梯度PCR：同时对多个PCR体系采用不同的退火温度进展PCR循环巢套式PCR-nested Primer PCR 不同的PCR体系两对引物 不同的PCR过程两段循环 目的：添加特异性和灵敏性复合PCRMultiplex PCR 采用多对引物扩增多条目的片断 目的：同时检测多种病原微生物 关键问题 不同引物Tm应相差不大 目的片断大小相差不大反向PCRReverse PCR 普通PCR的引物是相向的，而这里的引物是反向的。目的：扩增知序列两端的序列 方法：酶切衔接成环
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