多粮浓香型白酒生产过程中可培养酵母菌多样性分析与优质功能菌筛选

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1、多粮浓香型白酒生产过程中可培养酵母菌多样性分析与优质功能菌筛选崔小亮;邵小兵;钟和平;葛隐;杨洋;张贺【摘要】分析多粮浓香型白酒生产过程中可培养酵母菌多样性，基于ITS rD N A 序列构建其系统发育树对其进行鉴定,筛选优质酿酒功能酵母菌,并考察其发酵特性. 结果表明，共分离出43株酵母菌，分为12种形态类型編号为W Y 1W Y 12,其中, 菌株W Y 2、W Y 6、W Y 9为库德里阿兹威(氏)毕赤酵母(Pichia kudriavzevii); 菌株W Y 1、W Y 3为酿酒酵母(Saccharom yces cerevisiae);菌株W Y 4为海洋 嗜杀酵母(W icker

2、ham om yces anom alus);菌株W Y 5为扣囊复膜酵母菌 (Saccharom ycopsis fibuligera);菌株 W Y 7 为拜氏接合酵母(Zygosaccharom yces bailii);菌株 W Y 8 为葡萄牙棒抱酵母(C lavispora lusitaniae);菌株 W Y 10 为季也蒙毕赤酵母(G alactom yces geotrichum);菌株W Y 11、W Y 12为罗伦 隐球酵母(C ryptococcuslaurentii).功能酵母菌筛选结果表明，扣囊复膜酵母菌 (S.fibuligera)W Y 5-1和酿酒酵母(S.c

3、erevisiae)W Y 3-2具有良好的产乙醇特性； 库德里阿兹威氏毕赤酵母(Pichia kudriavzevii)W Y 6-3和W Y 9-2具有良好的产 酯特性、温度和pH耐受性，为浓香型白酒的工业生产中菌株的选择提供了更多可 能.【期刊名称】 中国酿造【年(卷),期】 2019(038)007【总页数】6页(P105-110)关键词】 多粮浓香型白酒;酵母菌;多样性;分子生物学鉴定;功能菌株;发酵特性作 者】崔小亮;邵小兵;钟和平;葛隐;杨洋;张贺 【作者单位】宜宾长江源酒业有限责任公司,四川宜宾 643000;宜宾长江源酒业有 限责任公司,四川宜宾 643000;宜宾长江源酒业

4、有限责任公司,四川 宜宾 643000; 宜宾长江源酒业有限责任公司,四川宜宾 643000;宜宾长江源酒业有限责任公司,四 川宜宾 643000;宜宾长江源酒业有限责任公司,四川 宜宾 643000【正文语种】中文【中图分类】TS261酵母菌是白酒生产过程中的主要功能微生物，其在淀粉的糖化、酒精的生成、香气 物质的形成、酒醅的发酵及终产品品质等方面都起着重要的作用1。因地域、环 境、气候、工艺等不同，不同香型白酒酿造过程中，酵母菌群种类分布有一定差异 如浓香型白酒酵母菌种类主要有产酯酵母、假丝酵母、酿酒酵母、接合酵母及伊萨 酵母等2-5；酱香型白酒酵母菌主要有扣囊复膜酵母、异常毕赤酵母、柠檬

5、形接 合酵母、东方伊萨酵母及毕赤酵母等6-8；清香型白酒酵母菌种类主要有酿酒酵 母、汉逊酵母及少量的假丝酵母9。目前，酿酒行业研究的酵母菌主要是从大曲、窖泥、糟醅及环境中分离筛选，根据 其特性及主要代谢产物种类将其分为酿酒酵母及产香酵母两大功能类别10-11。其中酿酒酵母糟醅中主要的乙醇产生菌，产酯酵母菌对基酒中主要酯类比例起着主 要作用。只有两类酵母菌具有适当的比例和较高的活性，才能保证糟醅中产乙醇和 产酯反应顺利进行，同时糟醅中较高的乙醇含量能够抑制杂菌的过度生长，从而使 糟醅酸度控制在适当范围。但是由于生产管理不当、菌群比例不断变化等问题导致 白酒生产行业长期普遍存在出酒率低、糟醅酸高、

6、基酒主要酯类比例失调等问题，严重阻碍了产品质量的进一步提升12。 近年来酵母菌在酿酒中的研究主要集中在酵母菌的产酒功能、产酯功能等，同时伴 随着耐酸、耐热等能力研究13-14。本研究从曲药、糟醅、窖泥、辅料抽取多个 样品，全面分析多粮浓香型白酒生产过程中可培养酵母菌多样性，基于ITS rDNA 序列构建其系统发育树对其进行鉴定；采用酒精度快速测定仪及气相色谱-质谱（gas chromatographymassspectrometry，GC-MS ）法分别检测菌株发酵液 乙醇含量及酯含量，借此筛选优质酿酒功能酵母菌，并考察其发酵特性。期望通过 对白酒生产过程中酵母菌的研究，为多粮浓香型白酒产质量

7、提高提供理论支撑。1 材料与方法1.1 材料与试剂1.1.1 样品 从五粮液制曲车间、酿酒车间取样11个，其中大曲3个、糟醅3个、窖泥3个、 辅料2个。1.1.2 试剂酵母菌基因组脱氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）抽提试剂盒、聚合 酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）扩增试剂盒（B639285 ）:生工 生物工程（上海）股份有限公司；无水葡萄糖（分析纯）、琼脂粉（生化试剂）： 天津大茂化学试剂有限公司。1.1.3 培养基 麦芽汁液体培养基：麦芽汁130.1g，加水定容至1000mL ,12FC灭菌20 min ,备用。麦芽汁固体

8、培养基：琼脂粉20 g，麦芽汁130.1g，加水定容至1 000 mL ,121C 灭菌20 min，倒平板，备用。麸皮培养基：5%麸皮煮沸1 h，用纱布过滤掉麸皮后加入葡萄糖20 g，加水定容 至 1 000 mL ,121C灭菌 20 min，备用。1.2 仪器与设备HZQ-F100摇床、LRH-250恒温培养箱、HW326恒温水浴锅：上海一恒科学仪 器有限公司；DM-500显微镜：日本尼康公司；4920 000.016移液枪：德国 Eppendorf公司；M367983 PCR扩增仪：美国伯乐公司；Dyy-12电泳仪：北京 市六一仪器厂；MOD.Super Alcomat酒精度快速测定仪

9、：意大利GIBERTINI公 司；ZF-670凝胶成像系统：上海嘉鹏科技有限公司；6890N-5973气相色谱-质 谱仪：美国安捷伦公司；LD5-2A离心机：北京京立离心机有限公司；SJIA-10N- 50A冷冻干燥机：上海秋佐科学仪器有限公司。1.3 方法1.3.1 酵母菌分离纯化与保藏称取5.00 g样品，倒入装有50 mL已灭菌麦芽汁液体培养基的锥形瓶中，160 180 r/min、28C富集培养24 h。按10倍稀释法对富集液进行梯度稀释，移取稀 释液0.5 mL均匀涂布于麦芽汁固体培养基上，28C恒温倒置培养48-72 h。挑 取单菌落在麦芽汁固体培养基上纯化1-2次，获得纯化菌株1

10、5。纯化菌株采用麦芽汁固态培养基斜面培养短时间保存16，用冷冻干燥机将菌株冷 冻干燥，保护剂为20%甘油，预冻温度为-80C,预冻时间为3 h，冻干时间为8 h，菌株干粉在-80C条件下长期保存。1.3.2 菌株鉴定（1）菌株形态观察将筛选到的酵母菌接种在麦芽汁固体平板培养基上，28C恒温培养2d，观察并记 录酵母菌株在麦芽汁固体培养基上的菌落及细胞形态。（2）菌株的分子生物学鉴定DNA提取：按照上海生工酵母菌基因组DNA抽提试剂盒说明书的实验步骤提取 目的菌株的总DNA。ITS rDNA序列扩增与序列分析：上游引物ITS1 :5CTTggTCATTTAgAggAAgTAA3 ；下游引物 IT

11、S4 : 5TCCTCCgCTTATTgATATgC3： PCR 扩增体系(50pL):ddH2O 22 pL, 2xPCR master 25 pL,Primer 1 2 pL,Primer 2 2 pL,模板 1pLo PCR扩增程 序：94C、5min ;94C、30s ,55C、30s ,72 C、1 min ,共 35 个循环， 72 C、10 min。扩增的ITS rDNA序列产物送至生工生物工程(上海)股份有限公司测序，测序结 果登录美国国立生物技术信息中心(national center for biotechonology information , NCBI )网站用基本局

12、部比对搜素工具(basic local alignment search tool , BLAST )进行序列比对，通过MEGA5软件中的邻接(neighborjoining ,NJ)法构建系统进化树。1.3.3 优质功能酵母菌筛选将分离到的酵母菌分别接种于麸皮培养基,接种量 5%,装液量 250 mL/500 mL, 28C、160 180 r/min条件下摇床培养72 h后，分别用酒精度快速测定仪测定 发酵液中乙醇含量17-18，用气相色谱-质谱(GC-MS )法测定发酵液中己酸乙 酯、乙酸乙酯含量19-20。气相色谱条件：DB-WAX毛细管色谱柱(60mx250pm, 0.25 pm);

13、手动无分 流进样，进样口温度230C;程序升温：初始温度40C,保留1 min ,以 3C/min的速率升至180C,再以2.5C/min的速率升至230C,保留10 min ; 汽化室温度230 C ;载气为氦气( He ) ,流速1 mL/min。质谱条件：电子电离(electronic ionization , EI )源，电子能量70 eV,扫描范 围20 500 u，离子源温度250C;接口温度230C。1.3.4 功能酵母菌的发酵特性将初筛到的4株酵母菌分别接种于麸皮培养基，接种量5%，装液量250mL/500mL,于温度分别为 20C、25C、30C、35C、40C,pH 值分别

14、为2、3、4、5、6条件下160180r/min振荡培养72 h后分别用酒精度快速测定 仪测定发酵液中乙醇含量，用气相色谱-质谱（GC-MS ）法测定发酵液中己酸乙酯、 乙酸乙酯含量，考察功能菌株在不同发酵温度及pH值条件下的发酵特性。2 结果与分析2.1 酵母菌分离纯化及形态特征 从多粮浓香型白酒生产过程中多次取样，经过反复分离纯化，共分离出43株酵母 菌，曲药中得到 15 株酵母菌，糟醅中得到 17 株酵母菌，窖泥中得到 7 株酵母菌， 辅料中得到4株酵母菌。通过麦芽汁培养基上菌落形态特征和菌落散发出的气味 特性，将筛选到的酵母菌分为12种类型，分别编号为WY1（6株，编号为WY1-16）

15、、WY2（6 株，编号为 WY2-16）、WY3（2 株，编号为 WY3-12）、WY4（6 株，编号为 WY4-16）、WY5（3 株，编号为 WY5-13）、WY6（5 株，编号为 WY6-15）、WY7（1 株，编号为 WY7-1）、WY8（2 株，编 号为 WY8-12）、WY9（7 株，编号为 WY9-17）、WY10 （ 3 株，编号为 WY10-1 3）、WY11 （1 株，编号为 WY11-1 ）、WY12 （1 株，编号为 WY12-1 ） 。 12种类型酵母菌的菌落及细胞形态见图1和表1。图1多粮浓香型白酒生产过程中可培养酵母菌菌落及细胞形态Fig.1 Colony and

16、 cell morphology of cultivatable yeast during the production of multi-grain strong-flavorBaijiu表1多粮浓香型白酒生产过程中可培养酵母菌菌落及细胞形态特征Table 1Colony and cell morphological characteristics of cultivatableyeast during the production of multi-grain strong-flavorBaijiu 编号菌落形态细胞形态WY1 WY2 WY3 WY4 WY5 WY6 WY7 WY8 WY9

17、 WY10 WY11 WY12 孚L白色， 有光泽、平坦、边缘整齐白色，表面干燥、有绒毛、边缘不整齐白色偏黄，有光泽、 平坦，边缘整齐乳白色，有光泽，表面光滑，边缘整齐白色偏黄，表面干燥，边缘 不整齐乳白色，表面干燥、有凸起，边缘不整齐白色偏黄，表面湿润，周边有小凸 起乳白色，表面平滑湿润，边缘整齐白色偏黄，表面干燥，不平坦，边缘不整齐白 色，表面干燥不光滑，边缘不整齐黄褐色，光滑湿润，凸起，边缘整齐黄色，光滑 湿润，凸起，边缘整齐20 30pm,卵圆形20 30pm,椭圆形25 30pm,卵 圆形2540pm,卵圆形3050pm,椭圆形2035pm,椭圆形2040pm, 椭圆形20 40pm

18、,椭圆形15 30pm,椭圆形3060pm,长椭圆形20 - 30pm,球形 2530pm,球形 在分离纯化菌株基础上，通过有效分析多粮浓香型白酒生产过程中可培养酵母菌多 样性，为后续菌株的分子生物学鉴定和优质功能酵母菌筛选奠定基础。2.2 酵母菌分子生物学鉴定 在酵母菌菌落形态及细胞形态观察基础上，从12种形态类型中各选择1株综合特 征能够代表本类酵母菌、长势健壮的模式菌株，提取其总DNA并进行ITS rDNA 基因PCR扩增，结果见图2。图2酵母菌基于ITS rDNA基因序列PCR扩增产物电泳图Fig.2Electrophoretogram of PCR amplification pro

19、ducts based on ITS rDNA gene sequence of yeasts112 依次为菌株 WY1WY12 , M 为 DNAMarker。 由图2可知，12株酵母菌的ITS rDNA基因PCR扩增产物无杂条带，且均在 500-750 bp之间，这与目的DNA序列大小一致，说明引物设计、PCR扩增体 系合理，扩增效果比较理想，无需进行纯化，可直接送测序公司测序。测序结果在NCBI上进行Blast比对，用DNAMAN8.0软件将上述序列与扩增的 ITS 序列进行序列比对，并辅以人工修剪将开始和末尾处长短不同的序列剪切整齐， 基于Kimura双参数模型，用MEGA5软件中的邻

20、接（NJ）法进行系统关系分析 并构建系统发育树，结果见图3。图3基于ITS rDNA序列构建的多粮浓香型白酒生产过程中可培养酵母菌系统发 育树 Fig.3 Phylogenetic tree of cultivable yeasts during the production of multi-grain strong-flavorBaijiubased on ITS rDNA sequences由图3可知，系统发育树共分为8个分支，从上到下依次为第18分支，其中菌 株WY1和WY3位于第1分支，菌株WY2、WY6和WY9位于第7分支，菌株 WY11和WY12位于第8分支，其他筛选菌株与各自模

21、式菌株位于同一分支，系 统发育树的聚类结果与扩增的ITS序列测序结果在NCBI比对的同源性鉴定结果趋 于一致。-般 Bootstrap值达到95以上可以判断二者是同一种，因此本研究系统发育树前 7个分支同一分支上的酵母菌可初步判定为同一种，第8个分支上的酵母菌可以鉴 定到属。结合筛选酵母菌与模式酵母菌的形态和生理特性，筛选到的12种形态类 型酵母菌被鉴定为8种酵母菌，具体如下：菌株WY1和WY3为酿酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae );菌株 WY2、WY6 和 WY9 为库德里阿兹威 (氏)毕赤酵母(Pichia kudriavzevii);菌株WY11和WY12为罗

22、伦隐球酵 母(Cryptococcus laurentii);菌株WY4为海洋嗜杀酵母(Wickerhamomyces anomalus );菌株WY7为拜氏接合酵母(Zygosaccharomyces bailii);菌株WY5为扣囊复膜酵母菌(Saccharomycopsis fibuligera );菌株WY8为葡萄牙棒抱酵母(Clavispora lusitaniae );菌株 WY10 为季也蒙毕赤酵母(Galactomyces geotrichum)。2.3 功能酵母菌筛选 行业内大量研究证明，白酒生产中主要功能酵母菌为假丝酵母、酿酒酵母、接合酵 母、嗜杀酵母、伊萨酵母、扣囊复膜酵

23、母、毕赤酵母等5。因此结合2.2中鉴定 结果，选取菌株 WY1 和 WY3、WY4、WY5、WY2、W6 和 WY9、WY10 共 6 类酵母菌，探索其乙醇发酵特性和产酯特性。由于每个类别都包含有多个菌株，只 列出在每个组别酵母菌中性状表现较好的菌株，结果见表2。表2 13株酵母菌发酵液产乙醇和产酯(己酸乙酯和乙酸乙酯)测定结果Table 2 Determination results of ethanol and ester(ethyl caproate and ethyl acetate)production in the fermentation broth of 13 yeasts 菌

24、株编号乙醇含量 /%vol酯含量/(mg100mL-1 )菌株编号乙醇含量/%vol酯含量/(mg100mL-1) WY1-3 WY1-5 WY3-2 WY2-1 WY2-4 WY6-1 WY6-3 13 11 9 3 4 2 4 13 50 30 210 317 398 438 WY9-2 WY9-6 WY4-1 WY4-2 WY5-1 WY10-1 2 2 5 7 9 5 521 489 341 267 85 156由表 2 可知，菌株 WY1-3、WY5-1、WY3-2 发酵液中乙醇含量分别为 13%vol、 9%vol、9%vol，显著高于其他菌株乙醇产量，最高可达6.5倍；菌株WY6

25、-3、 WY9-2、WY4-1发酵液中己酸乙酯、乙酸乙酯总含量分别为438 mg/100 mL、 521 mg/100 mL、341 mg/100 mL，显著高于其他菌株发酵液中己酸乙酯、乙 酸乙酯总含量，最高可达40倍。因此筛选菌株WY1-3、WY5-1、WY3-2进一步 研究发酵温度和pH值对其乙醇发酵特性的影响；筛选菌株WY6-3、WY9-2、 WY4-1进一步研究发酵温度和pH值对其产酯特性的影响21-22。2.4 功能酵母菌的发酵性能研究发酵温度和pH值对菌株WY1-3、WY5-1、WY3-2乙醇发酵特性的影响以 及对菌株WY6-3、WY9-2、WY4-1产酯特性的影响，结果见图4。

26、由图4a、4c可知，3株产乙醇特性较好的酵母菌都具有一定的耐酸性，在pH值 为3的环境中依然能保持产乙醇能力，发酵结束时， 3株菌的发酵液中乙醇含量保 持2%vol以上，菌株WY5-1具有较好的温度适应性，且乙醇产生能力较强。菌 株WY3-2在较低温度条件下具有一定的乙醇产生能力，这两个菌株可作为强化功 能菌株应用于实际生产，有目的性的快速积累大量的乙醇，从而随着发酵温度的升 高，通过乙醇抑制杂菌的生长。由图4b、4d可知，菌株WY4丄 WY6-3、WY9-2这3株菌都具有一定的温度 适应性，在20工低温和35C高温环境中具有己酸乙酯、乙酸乙酯产生能力，在适 宜的温度环境中，发酵结束时， 3株

27、菌的发酵液中己酸乙酯、乙酸乙酯总含量保持 400 mg/100 mL以上，菌株WY9-2产酯能力最强，最高可达552 mg/100 mL , 菌株 WY6-3次之，但是3株菌的酸度耐受性稍差。图4温度和pH值对酵母菌发酵液中乙醇和酯含量的影响Fig.4 Effect oftemperature and pH on ethanol and ester contents in the yeast fermentation broth结合系统发育树及可培养酵母菌筛选情况，菌株WY6、WY9和WY2三者具有很 近的亲缘关系，ITS rDNA相似度为99%，且在本研究所筛选酵母菌中占有较高的 比例，菌株

28、WY6、WY9和WY2三类酵母菌共有18株菌，占所筛选酵母菌的 42%，从而有效解释浓香型白酒生产中乙酸乙酯偏高的原因。3 结论通过ITS序列扩增、测序，并构建系统发育树，本研究得到的12种形态类型酵母 菌被鉴定为8种酵母：菌株WY2、WY6、WY9为库德里阿兹威(氏)毕赤酵母(Pichia kudriavzevii);菌株 WY1、WY3 为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae );菌株 WY4 为海洋嗜杀酵母(Wickerhamomyces anomalus ); 菌株WY5为扣囊复膜酵母菌(Saccharomycopsis fibuligera );菌株WY7为 拜

29、氏接合酵母(Zygosaccharomyces bailii);菌株WY8为葡萄牙棒抱酵母(Clavispora lusitaniae )、菌株 WY10 为季也蒙毕赤酵母(Galactomyces geotrichum )、菌株 WY11、WY12 为罗伦隐球酵母(Cryptococcuslaurentii)。 功能酵母菌筛选结果表明，扣囊复膜酵母菌(Saccharomycopsis fibuligera )WY5-1和酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae ) WY3-2具有良好的产乙醇特 性；库德里阿兹威氏毕赤酵母(Pichia kudriavzevii) WY6-3

30、和WY9-2具有良好 的产酯特性。菌株WY5-1具有较好的温度适应性，且乙醇产生能力较强，WY3-2 在较低温度条件下具有一定的乙醇产生能力，在20工的环境中发酵结束时，发酵 液乙醇含量保持4%vol以上。菌株WY4-1、WY6-3、WY9-2这3株菌都具有一 定的温度适应性，但是3株菌的酸度耐受性稍差，菌株WY9-2产酯能力最强，最 高可达552 mg/100 mL，菌株WY6-3次之，最高含量为493 mg/100 mL。 本研究最终筛选到2株产乙醇特性较好菌株，扣囊复膜酵母菌(Saccharomycopsis fibuligera ) WY5-1 和酿酒酵母(Saccharomyces

31、cerevisiae ) WY3-2 ; 2株产己酸乙酯、乙酸乙酯特性较好的菌株，库德里阿兹威 氏毕赤酵母(Pichia kudriavzevii) WY6-3和WY9-2。4株功能酵母菌均具有较 好的温度适应性和一定的酸度耐受性，下一步通过深入研究优化这4株菌的生长 特性和代谢产物，并探索不同种类酵母菌的相互作用关系，以期为白酒生产产质进 一步提升提供理论基础。【相关文献】1 汤有宏酒醅中酵母的分离及其生理生长特性的研究J.酿酒，2011,38 ( 5 ): 45-47.2 赵爽，杨春霞，徐曼，等浓香型白酒生产中酿酒微生物研究进展J.食品与发酵科技，2012 , 48(1)：24-29.3

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