第九章-微生物的遗传变异与菌种选育课件

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1、第九章第九章 微生物的遗传变异与菌微生物的遗传变异与菌种选育种选育遗传遗传：亲代与子代相似亲代与子代相似变异变异：亲代与子代、子代间不同个体不完全相同亲代与子代、子代间不同个体不完全相同遗传（遗传（inheritance）和变异（和变异（variation）是生命的最本质特性之一是生命的最本质特性之一遗传型遗传型：表型（表现型）表型（表现型）：生物的全部遗传因子及基因生物的全部遗传因子及基因具有一定遗传型的个体，在特定环境条件具有一定遗传型的个体，在特定环境条件下通过生长发育所表现出来的形态等生物下通过生长发育所表现出来的形态等生物学特征的总和。学特征的总和。表型是由遗传型所决定，但也和环境有

2、关。表型是由遗传型所决定，但也和环境有关。表型饰变：表型饰变：表型的差异只与环境有关特点：暂时性、不可遗传性、表现为全部个体的行为橘生淮南则为橘，生于淮北则为枳。遗传型变异（基因变异、基因突变）遗传型变异（基因变异、基因突变）：遗传物质改变，导致表型改变特点：遗传性、群体中极少数个体的行为 （自发突变频率通常为10-6-10-9）经典试验1.肺炎链球菌的转化试验一、遗传物质的鉴定一、遗传物质的鉴定经典试验2.噬菌体侵染试验经典试验3.植物病毒重建试验核酸是遗核酸是遗传物质。传物质。第一节第一节 基因突变和诱变育种基因突变和诱变育种一、一、基因突变基因突变（genemutation）一个基因内部

3、遗传结构或一个基因内部遗传结构或DNA序列的任何改变序列的任何改变 简称简称突变突变，是变异的一种，泛指细胞内（或病毒，是变异的一种，泛指细胞内（或病毒粒内）遗传物质的粒内）遗传物质的分子结构分子结构或或数量数量突然发生的可遗传突然发生的可遗传的变化，可自发或诱导产生。的变化，可自发或诱导产生。突变几率一般很低突变几率一般很低（1010-6-61010-9-9）从自然界分离到的菌株从自然界分离到的菌株，简称简称野生型野生型。野生型经突变后形成的带有新性状的菌株，野生型经突变后形成的带有新性状的菌株，又称又称突变体突变体或或突变型突变型。突变株突变株（mutant）野生型菌株野生型菌株（wild

4、 type strain）（一）突变类型（一）突变类型 凡能用凡能用选择性培养基选择性培养基（或其他选择性（或其他选择性培养条件）快速选择出来的突变株。培养条件）快速选择出来的突变株。选择性突变株选择性突变株（selective mutant）非选择性突变株非选择性突变株（non-selective mutant）反之。反之。表型表型基因型基因型这里主要介绍几种常用的由于基因突变而造成微生物这里主要介绍几种常用的由于基因突变而造成微生物表型变化表型变化的突变型及其分离的突变型及其分离link1突变株的表型突变株的表型非选择性突变株非选择性突变株选择性突变选择性突变株株抗性突变型（株）抗性突变型

5、（株）营养缺陷型（株）营养缺陷型（株）条件致死突变型（株）条件致死突变型（株）形态突变型（株）形态突变型（株）抗原突变型（株）抗原突变型（株）产量突变型（株）产量突变型（株）突突变变率率每一细胞在每一世代中发生某一性状突变的几率每一细胞在每一世代中发生某一性状突变的几率例如，突变率为例如，突变率为1010-8-8的，的，指该细胞在指该细胞在1 1亿次细胞分裂中，会发生亿次细胞分裂中，会发生1 1次突变。次突变。某一单位群体在每一世代（即分裂某一单位群体在每一世代（即分裂1 1次）中产生次）中产生突变株突变株（mutant，即即突变型突变型）的数目来表示的数目来表示例如，一个含例如，一个含101

6、08 8个细胞的群体，当其分裂为个细胞的群体，当其分裂为2 210108 8个个细胞时，即可平均发生一次突变的突变率也是细胞时，即可平均发生一次突变的突变率也是1010-8-8。（二（二）突变率突变率（mutation rate）突变一般是独立发生的。突变一般是独立发生的。某一基因发生突变不会影响其他基因的突变率。某一基因发生突变不会影响其他基因的突变率。同一细胞中同时发生两个基因突变的几率是极低的。同一细胞中同时发生两个基因突变的几率是极低的。（三（三）基因突变的特点基因突变的特点基因突变的基因突变的7个共同点个共同点（1）自发性自发性各种性状的突变，各种性状的突变，可在无人为的诱变因素处理

7、下自发地产生。可在无人为的诱变因素处理下自发地产生。（2）非对应性非对应性突变的性状与引起突变的原因间突变的性状与引起突变的原因间无直接的对应关系。无直接的对应关系。这是突变的一个重要特点，也是容易引起争论的问题这是突变的一个重要特点，也是容易引起争论的问题（3）稀有性稀有性自发突变虽可随时发生，自发突变虽可随时发生，但其突变率却是极低和稳定的，一般在但其突变率却是极低和稳定的，一般在1010-6-61010-9-9间。间。某基因的突变率不受它种基因突变率的影响。某基因的突变率不受它种基因突变率的影响。（5）可）可诱变性诱变性自发突变的频率可因自发突变的频率可因诱变剂诱变剂（mutagen）的

8、影响的影响而大为提高（而大为提高（101010105 5倍）。倍）。（4）独立性独立性基因突变后的新遗传性状是稳定的、可遗传的。基因突变后的新遗传性状是稳定的、可遗传的。野生型菌株某一性状可发生野生型菌株某一性状可发生正向突变正向突变（forward mutation），也可发生相反的也可发生相反的回复突变回复突变（reverse mutation或或back mutation ，也称也称回变回变）。（7）可逆性可逆性（6）稳定性稳定性（四（四）基因突变自发性和不对应性基因突变自发性和不对应性的实验证明的实验证明如何证明基因突变的非对应性？如何证明基因突变的非对应性？1.1.变量试验变量试验（

9、fluctuation test）又称又称波动试验波动试验或或彷徨试验彷徨试验。19431943年，年，S.E.Luria和和M.Delbrck根据统计学的原理，设计实验。根据统计学的原理，设计实验。Salvador LuriaMax DelbruckThe Nobel Prize in Physiology or Medicine 1969甲管甲管乙管乙管（五（五）基因突变及其机制基因突变及其机制仅影响一对碱基仅影响一对碱基影响一段染色体影响一段染色体诱发突变诱发突变简称简称诱变诱变，是指通过人为的方法，是指通过人为的方法，利用物理、化学或生物因素显著提高基因自发突变利用物理、化学或生物因素

10、显著提高基因自发突变频率的手段。频率的手段。1.1.诱发突变诱发突变（induced mutation）凡具有诱变效应的任何因素，都称凡具有诱变效应的任何因素，都称诱变剂诱变剂（mutagen）。(1)(1)碱基的置换碱基的置换（substitution）碱基的置换只涉及一对碱基被另一对碱基所置换，碱基的置换只涉及一对碱基被另一对碱基所置换，属于典型的属于典型的点突变点突变（pointmutation）。染色体的染色体的微小损伤微小损伤（microlesion）碱基的置换碱基的置换转换转换（transition）颠换颠换（transversion）一个嘌呤一个嘌呤另一个嘌呤另一个嘌呤一个嘧啶一

11、个嘧啶另一个嘧啶另一个嘧啶一个嘌呤一个嘌呤另一个嘌呤另一个嘌呤一个嘧啶一个嘧啶另一个嘧啶另一个嘧啶置换的机制置换的机制 直接引起置换的诱变剂直接引起置换的诱变剂一类可一类可直接直接与核酸的碱基发生化学反应的化学与核酸的碱基发生化学反应的化学诱变剂，在体内（诱变剂，在体内（in vivo）或离体（或离体（in vitro）条件条件下均有作用。下均有作用。各种烷化剂各种烷化剂（alkylating agent）等等硫酸二乙酯（硫酸二乙酯（DESDES），），甲基磺酸乙酯（甲基磺酸乙酯（EMSEMS），），N-N-甲基甲基-N-N-硝基硝基-N-N-亚硝基胍，亚硝基胍，N-N-甲基甲基-N-N-亚硝

12、基脲，亚硝基脲，乙烯亚胺，环氧乙酸，氮芥等。乙烯亚胺，环氧乙酸，氮芥等。亚硝酸亚硝酸羟胺羟胺它们可与一个或几个碱基发生生化反应，它们可与一个或几个碱基发生生化反应，引起引起DNADNA复制时发生转换，复制时发生转换，能引起颠换的诱变剂很少。能引起颠换的诱变剂很少。间接引起置换的诱变剂间接引起置换的诱变剂引起这类变异的诱变剂都是一些引起这类变异的诱变剂都是一些碱基类似物碱基类似物（base analog）。5-5-溴尿嘧啶（溴尿嘧啶（5-5-BUBU）、）、5-5-氨基尿嘧啶（氨基尿嘧啶（5-5-AUAU）、）、8-8-氮鸟嘌呤（氮鸟嘌呤（8-8-NGNG）、）、2-2-氨基嘌呤（氨基嘌呤（2-

13、2-APAP）6-6-氯嘌呤（氯嘌呤（6-6-CPCP）等。等。它们的作用是通过活细胞的代谢活动掺入到它们的作用是通过活细胞的代谢活动掺入到DNADNA分子中分子中后而引起的，故是间接的。后而引起的，故是间接的。(2)(2)移码突变移码突变（frame-shift mutation，phase-shift mutation）指诱变剂使指诱变剂使DNADNA序列中的一个或少数几个核苷酸序列中的一个或少数几个核苷酸发生发生增添增添（插入插入）或）或缺失缺失，从而使其后面的全部，从而使其后面的全部遗传密码发生遗传密码发生阅读框阅读框发生改变，并进一步引起转录发生改变，并进一步引起转录和转译错误的一类

14、突变。和转译错误的一类突变。由移码突变所产生的突变株，称为由移码突变所产生的突变株，称为移码移码突变株突变株（frame-shift mutant）。DNADNA分子的分子的微小损伤微小损伤点突变点突变能引起移码突变的有效诱变剂能引起移码突变的有效诱变剂吖啶类染料吖啶类染料原黄素原黄素吖啶黄吖啶黄吖啶橙吖啶橙-氨基吖啶氨基吖啶ICRICR类的化合物类的化合物由吖啶类化合物诱发的由吖啶类化合物诱发的移码突变移码突变及其及其回复突变回复突变图示：图示：（双线部分代表正常密码子，单线部分表示不正常）（双线部分代表正常密码子，单线部分表示不正常）正常正常DNADNA链上的三联密码子：链上的三联密码子：

15、第三个密码子中增添一个碱基后的三联密码子：第三个密码子中增添一个碱基后的三联密码子：在第二个密码子上缺失一个碱基在第二个密码子上缺失一个碱基A A后引起的变化：后引起的变化：增添一个碱基和缺失一个碱基后，其后的密码子增添一个碱基和缺失一个碱基后，其后的密码子又恢复正常：又恢复正常：如缺失三个碱基，也只引起一段密码子不正常：如缺失三个碱基，也只引起一段密码子不正常：增添三个碱基后，只引起一段密码子不正常：增添三个碱基后，只引起一段密码子不正常：吖啶类化合物引起移码突变的机制：吖啶类化合物引起移码突变的机制：在在DNADNA复制过程中使链上复制过程中使链上增添增添或或缺失缺失一个碱基，引起移码突变

16、一个碱基，引起移码突变。吖啶类化合物吖啶类化合物嘌呤嘧啶对嘌呤嘧啶对平面型三环分子平面型三环分子结结 构构 相相 似似嵌嵌入入两个相邻的两个相邻的DNADNA碱基对之间碱基对之间造成造成双螺旋的部分解开双螺旋的部分解开(3)(3)染色体畸变染色体畸变（chromosomal aberration）电离辐射电离辐射（X X射线等射线等）烷化剂烷化剂亚硝酸等亚硝酸等某些强烈理化因子某些强烈理化因子引引起起点突变点突变DNADNA的大损伤的大损伤（macrolesion）DNADNA的大损伤的大损伤（macrolesion）染色体畸变染色体畸变缺失缺失（deletion）重复重复（duplicati

17、on）插入插入（insertion）易位易位（translocation）倒位倒位（inversion）染色体结构上染色体结构上染色体数目的变化染色体数目的变化DNADNA序列通过序列通过非同源重组非同源重组的方式，的方式，从染色体某一部位转移到从染色体某一部位转移到同一染色体上另一部位同一染色体上另一部位或或其他染色体上某一部位其他染色体上某一部位的现象，的现象，称为称为转座转座（transposition）。凡具有转座作用的一段凡具有转座作用的一段DNADNA序列，称序列，称转座因子转座因子（transposible element，TE），），又称又称跳跃基因跳跃基因（jumping g

18、ene）、可移动基因可移动基因（moveable gene）、）、可移动遗传因子可移动遗传因子（mobile genetic element）。）。2.2.自发突变自发突变（spontaneous mutation）自发突变自发突变（spontaneous mutation）是指生物体是指生物体在无人工干预下自然发生的低频率突变。在无人工干预下自然发生的低频率突变。自发突变的原因自发突变的原因（1 1）背景辐射和环境因素）背景辐射和环境因素（3 3）DNADNA复制过程中碱基配对错误复制过程中碱基配对错误（2 2）微生物自身有害代谢产物）微生物自身有害代谢产物一个一个10001000bpbp的

19、基因自发突变频率约为的基因自发突变频率约为1010-6-6例如，过氧化氢等例如，过氧化氢等例如，天然的宇宙射线等例如，天然的宇宙射线等（六（六）紫外线对紫外线对DNADNA的损伤及其修复的损伤及其修复嘧啶（敏感性）嘌呤嘧啶（敏感性）嘌呤紫外线紫外线（ultraviolet ray，U.V.U.V.）嘧啶二聚体嘧啶二聚体（TTTT，TCTC，CCCC）和水合物和水合物 把经把经UVUV照射后的微生物照射后的微生物立即立即暴露于暴露于可见光可见光下时，下时，可明显降低其死亡率的现象，称为可明显降低其死亡率的现象，称为光复活作用光复活作用。1.1.光复活作用光复活作用（photoreactivati

20、on，photorestoration）最早是最早是A.Kelner（19491949）在在Streptomyces griseus（灰色链霉菌）中发现的。后来，在许多微生物中都灰色链霉菌）中发现的。后来，在许多微生物中都得到了证实。得到了证实。最明显的是在最明显的是在E.coliE.coli的实验的实验 对照：对照：8 810106 6个个mLmLE.coliE.coli 100 100个个mLmLE.coliE.coli 试验：试验：8 810106 6个个mLmLE.coliE.coli2 210106 6个个mLmLE.coliE.coliUVUVUVUV360360490nm490n

21、m可见光，可见光，3030minmin使使二聚体二聚体（dimer）重新分解成重新分解成单体单体（monomer）带有嘧啶二聚体的带有嘧啶二聚体的DNADNA分子分子DNADNA分子分子UVUV照射照射黑暗下结合黑暗下结合光激活酶光激活酶光解酶光解酶（光裂合酶光裂合酶，photolyase）复合物复合物300300500500nmnm可见光可见光获得光能而激活获得光能而激活释放光解酶释放光解酶 在一般的微生物中都存在光复活作用，在利用在一般的微生物中都存在光复活作用，在利用UVUV进行诱变育种等工作时，应在进行诱变育种等工作时，应在红光下红光下进行照射和进行照射和后续操作，并放置在后续操作，并

22、放置在黑暗条件下培养黑暗条件下培养。注注 意意2.2.切除作用切除作用（excision repair）是活细胞内一种用于修复被是活细胞内一种用于修复被UVUV等诱变剂（包括等诱变剂（包括烷化剂、烷化剂、X X射线和射线和射线等）损伤后射线等）损伤后DNADNA的修复方式的修复方式之一之一，又称又称暗修复暗修复（dark repair），通过通过酶切作酶切作用用去除嘧啶二聚体，随后重新合成一段正常去除嘧啶二聚体，随后重新合成一段正常DNADNA链链的核酸修复方式。的核酸修复方式。酶酶切切合合成成切开切开切除切除聚合聚合连接连接 二、二、突变与育种突变与育种 （一（一）自发突变与育种自发突变与育

23、种 （breeding by spontaneous mutation）1.1.从生产中育种从生产中育种在生产第一线易获得较优良的生产菌株。在生产第一线易获得较优良的生产菌株。2.2.定向培育优良菌株定向培育优良菌株 定向培育定向培育是一种利用微生物自发突变，并采用是一种利用微生物自发突变，并采用特定的选择条件，通过对微生物群体不断移植以选育特定的选择条件，通过对微生物群体不断移植以选育出较优良菌株的古老方法。出较优良菌株的古老方法。（二（二）诱变育种诱变育种（breeding by induced mutation）诱变育种诱变育种是指利用物理、化学等诱变剂处理均是指利用物理、化学等诱变剂处

24、理均匀而分散的微生物细胞群，在促进其突变率显著提匀而分散的微生物细胞群，在促进其突变率显著提高的基础上，采用简便、快速和高效的高的基础上，采用简便、快速和高效的筛选方法筛选方法，从中挑选出从中挑选出少数符合育种目的的突变株少数符合育种目的的突变株，以供科学，以供科学实验或生产实践使用。实验或生产实践使用。筛选筛选诱变诱变诱诱变变育育种种定向的定向的更重要更重要随机的随机的可获得供工业和实验室应用的各种菌株；可获得供工业和实验室应用的各种菌株；提高有用代谢产物的产量；提高有用代谢产物的产量；减少杂质、提高产品质量、扩大品种和简化工艺等。减少杂质、提高产品质量、扩大品种和简化工艺等。诱变育种具有重

25、大的实践意义诱变育种具有重大的实践意义诱变育种的特点诱变育种的特点（1 1）提高突变率，扩大突变谱）提高突变率，扩大突变谱 （2 2）有效地改良个别、单一性状）有效地改良个别、单一性状 （3 3）缩短育种年限）缩短育种年限 （4 4）定向变异和有益突变的频率低）定向变异和有益突变的频率低 1.1.诱变育种的基本环节诱变育种的基本环节出发菌株出发菌株纯化、同步培养纯化、同步培养培养液培养液离心收集细胞，洗涤，制菌悬液玻璃珠打散，过滤离心收集细胞，洗涤，制菌悬液玻璃珠打散，过滤细胞或孢子悬液细胞或孢子悬液诱变处理诱变处理平板分离平板分离初筛初筛复筛复筛保藏及扩大试验保藏及扩大试验活菌计数，诱变预备

26、试验活菌计数，诱变预备试验存活细胞计数，致死率计算存活细胞计数，致死率计算变异率计算变异率计算 2.2.诱变育种中的原则诱变育种中的原则 （1 1）选择简便有效的诱变剂）选择简便有效的诱变剂诱变剂诱变剂（mutagen）物理因素物理因素化学诱变剂化学诱变剂非电离辐射类的非电离辐射类的紫外线紫外线、激光激光和和离子束离子束（ion beam，有小型加速器提供）等有小型加速器提供）等引起电离辐射的引起电离辐射的X X射线射线、射线射线和和快中子快中子等等主要有主要有烷化剂烷化剂、碱基类似物碱基类似物和和吖啶类化合物吖啶类化合物 烷化剂烷化剂可与巯基、氨基和羧基等直接发生反应，可与巯基、氨基和羧基等

27、直接发生反应，更易引起基因突变。更易引起基因突变。最常用的烷化剂最常用的烷化剂N-N-甲基甲基-N-N-硝基硝基-N-N-亚硝基胍（亚硝基胍（NTGNTG）、）、甲基磺酸乙酯（甲基磺酸乙酯（EMSEMS）、）、甲基亚硝基脲（甲基亚硝基脲（NMUNMU）、）、硫酸二乙酯（硫酸二乙酯（DESDES）、）、氮芥、乙烯亚胺和环氧乙烷等。氮芥、乙烯亚胺和环氧乙烷等。拟辐射物质拟辐射物质氮芥、硫芥和环氧乙烷等氮芥、硫芥和环氧乙烷等各种点突变各种点突变一般只有辐射才能诱发的一般只有辐射才能诱发的染色体畸变染色体畸变诱诱发发 出发菌株出发菌株（original strain）是指用于育种的原始是指用于育种的原

28、始菌株，选用合适的出发菌株有利于提高育种的效率。菌株，选用合适的出发菌株有利于提高育种的效率。（2 2）挑选优良的出发菌株）挑选优良的出发菌株合适的出发菌株来源：合适的出发菌株来源：由自然界直接分离获得的野生型菌株；由自然界直接分离获得的野生型菌株；在生产中经历生产条件考验的菌株；在生产中经历生产条件考验的菌株；已经过诱变甚至多次改造的菌株；已经过诱变甚至多次改造的菌株；选用对诱变剂敏感性较高增变变异株；等等。选用对诱变剂敏感性较高增变变异株；等等。在诱变育种中，所处理的细胞必须是单细胞、在诱变育种中，所处理的细胞必须是单细胞、均匀的均匀的悬液状态悬液状态。（3 3）处理单细胞或单孢子悬液）处

29、理单细胞或单孢子悬液菌悬液制备目的在于提高诱变处理的效果菌悬液制备目的在于提高诱变处理的效果因为因为:一方面一方面，分散状态的细胞可以均匀地接触诱变剂，分散状态的细胞可以均匀地接触诱变剂，另一方面另一方面，又可避免长出不纯菌落。，又可避免长出不纯菌落。诱变剂一般只作用于诱变剂一般只作用于DNADNA双链中的某一条单链，双链中的某一条单链，故某一突变还是无法反映在当代的表型上。只有当故某一突变还是无法反映在当代的表型上。只有当经过经过DNADNA的复制的复制和和细胞分裂细胞分裂后，这一变异才会在表后，这一变异才会在表型上表达出来，于是出现了不纯菌落，这就叫型上表达出来，于是出现了不纯菌落，这就叫

30、表型表型延迟延迟（phenotypiclag）。表型延迟表型延迟（phenotypiclag）用于诱变育种的细胞应尽量选用单核细胞用于诱变育种的细胞应尽量选用单核细胞，例如，细菌的芽孢；例如，细菌的芽孢；霉菌或放线菌的分生孢子。霉菌或放线菌的分生孢子。诱变剂诱变剂的作用有三条：的作用有三条：一是提高诱变的频率一是提高诱变的频率二是扩大变异的幅度二是扩大变异的幅度三是使变异向正变的方向移动（产量提高）三是使变异向正变的方向移动（产量提高）（4 4）选用最适的诱变剂量）选用最适的诱变剂量 凡在提高诱变率的基础上，既能扩大变异幅度，又凡在提高诱变率的基础上，既能扩大变异幅度，又能促使变异移向正变范围

31、的剂量，就是能促使变异移向正变范围的剂量，就是合适的剂量合适的剂量。两条重要的实验曲线两条重要的实验曲线横坐标横坐标纵坐标纵坐标 剂量存活率曲线剂量存活率曲线诱变剂的诱变剂的剂量剂量细胞存活数的细胞存活数的对数值对数值 剂量诱变率曲线剂量诱变率曲线诱变剂的诱变剂的剂量剂量诱变后获得的诱变后获得的突变细胞数突变细胞数通过比较上述两曲线，可找到通过比较上述两曲线，可找到某某诱变剂的剂量诱变剂的剂量存活率存活率诱变率诱变率三者的最佳结合点。三者的最佳结合点。通常采用低剂量、长时间处理。通常采用低剂量、长时间处理。诱变剂的诱变剂的复合处理复合处理常常表现出明显的常常表现出明显的协同协同效应效应，这对育

32、种工作是有利的。，这对育种工作是有利的。（5 5）充分利用复合处理的协同效应（）充分利用复合处理的协同效应（synergism）复合处理有几类：复合处理有几类：两种或多种诱变剂的先后使用；两种或多种诱变剂的先后使用；同一种诱变剂的重复使用；同一种诱变剂的重复使用；两种或多种诱变剂的同时使用。两种或多种诱变剂的同时使用。为了大大提高育种时初筛的效率，必须进行为了大大提高育种时初筛的效率，必须进行大量的分析测定和统计工作，并找到大量的分析测定和统计工作，并找到形态变异形态变异与与产量变异产量变异两者间的相关性。两者间的相关性。（6 6）利用和创造形态、生理与产量间的相关指标）利用和创造形态、生理与

33、产量间的相关指标 利用鉴别性培养基的原理或其他途径，就可利用鉴别性培养基的原理或其他途径，就可有效地把原先肉眼无法观察的生理性状或产量性有效地把原先肉眼无法观察的生理性状或产量性状转化为状转化为可见的可见的“形态形态”性状性状。快速平板检出法快速平板检出法在琼脂平板上，通过观察测定某突变菌落周围在琼脂平板上，通过观察测定某突变菌落周围蛋白酶水解圈蛋白酶水解圈的大小、的大小、淀粉酶变色圈淀粉酶变色圈（用碘液使淀粉显色）的大小，（用碘液使淀粉显色）的大小，氨基酸显色圈氨基酸显色圈（将菌落用打孔机取下，转移到滤纸上，再用茚三酮试剂（将菌落用打孔机取下，转移到滤纸上，再用茚三酮试剂显色）的大小，显色）

34、的大小，柠檬酸变色圈柠檬酸变色圈（可在厚滤纸上培养，用溴甲酚绿作指示剂）的大小，（可在厚滤纸上培养，用溴甲酚绿作指示剂）的大小，抗生素抑制圈抗生素抑制圈的大小，的大小，指示菌生长圈指示菌生长圈的大小（测定生长因子产生），的大小（测定生长因子产生），纤维素酶对纤维素水解圈纤维素酶对纤维素水解圈（用刚果红染色）的大小，（用刚果红染色）的大小，外毒素的沉淀反应圈外毒素的沉淀反应圈的大小等，的大小等，均可为初筛工作中估计某突变株代谢产物量的均可为初筛工作中估计某突变株代谢产物量的“形态形态”指标指标。（7 7）设计高效筛选方案）设计高效筛选方案设计简便、高效的科学筛选方案。设计简便、高效的科学筛选方案

35、。初筛初筛筛选工作筛选工作复筛复筛以量为主（选留较多有生产潜力的菌株）以量为主（选留较多有生产潜力的菌株）以质为主（对少量潜力大的菌株的代谢产物量作精确测定）以质为主（对少量潜力大的菌株的代谢产物量作精确测定）常用的筛选方案常用的筛选方案第一轮：第一轮：第二轮：第二轮：第三轮：第三轮：同第二轮同第二轮第四轮：第四轮：同上同上 .直至获得较满意的结果为止直至获得较满意的结果为止初初 筛筛复复 筛筛对产量突变株生产性能的测定方法对产量突变株生产性能的测定方法粗测为主粗测为主在培养皿平板上在培养皿平板上在摇瓶中在摇瓶中（8 8）创造新型筛选方法）创造新型筛选方法较精确的测定较精确的测定摇瓶培养摇瓶培

36、养oror台式自控发酵罐培养台式自控发酵罐培养3.3.3 3类突变株的筛选方法类突变株的筛选方法 （1 1）产量突变株的筛选）产量突变株的筛选 1971 1971年，国外有人报道了筛选春日霉素年，国外有人报道了筛选春日霉素（kasugamycin，即即“春雷霉素春雷霉素”）生产菌）生产菌时所采用的一种时所采用的一种琼脂块培养法琼脂块培养法，一年内曾，一年内曾使该抗生素产量提高使该抗生素产量提高1010倍。倍。此法的关键是用此法的关键是用打打孔器孔器取出含有一个小菌取出含有一个小菌落的琼脂块作分别培养落的琼脂块作分别培养。这样，各琼脂块所含。这样，各琼脂块所含养料和接触空气面积基养料和接触空气面

37、积基本相同，且产生的抗生本相同，且产生的抗生素等代谢产物不致扩散素等代谢产物不致扩散出琼脂块外。出琼脂块外。数据精确，效率高数据精确，效率高（2 2）抗药性突变株的筛选）抗药性突变株的筛选 基因突变使菌株对某种或某几种药物，特别基因突变使菌株对某种或某几种药物，特别是抗生素，产生抗性。是抗生素，产生抗性。特点：特点：正选择标记正选择标记（突变株可直接从抗性平板上获得（突变株可直接从抗性平板上获得-在加有相应在加有相应抗生素的平板上，只有抗性突变能生长。所以很容抗生素的平板上，只有抗性突变能生长。所以很容易分离得到。）易分离得到。）梯度平板法梯度平板法（gradient plate）是是定向筛选

38、抗药定向筛选抗药性突变株性突变株的一种有效方法，通过制备琼脂表面存在药的一种有效方法，通过制备琼脂表面存在药物浓度梯度的平板、在其上涂布诱变处理后的细胞悬物浓度梯度的平板、在其上涂布诱变处理后的细胞悬液、经培养后再从其上选取抗药性菌落等步骤，就可液、经培养后再从其上选取抗药性菌落等步骤，就可定向筛选到相应抗药性突变株。定向筛选到相应抗药性突变株。表示方法：表示方法：所抗药物的前三个小写斜体英文字母加上所抗药物的前三个小写斜体英文字母加上“r”。strrstrs对链霉素的对链霉素的抗性抗性敏感性敏感性（3 3）营养缺陷型突变株的筛选）营养缺陷型突变株的筛选 营养缺陷型突变株营养缺陷型突变株（au

39、xotrophic mutant）在在生物学基础理论和应用研究以及生产实践上都有极其生物学基础理论和应用研究以及生产实践上都有极其重要的意义。重要的意义。营养缺陷型的表示方法：营养缺陷型的表示方法：基因型：基因型：所需营养物的前三个英文小写斜体字母表示：所需营养物的前三个英文小写斜体字母表示：hisC（组氨酸缺陷型，其中的大写字母组氨酸缺陷型，其中的大写字母C同一表型中不同基因的突变同一表型中不同基因的突变）表型：表型：同上，但第一个字母大写，且不用斜体：同上，但第一个字母大写，且不用斜体：HisC在具体使用时多用在具体使用时多用hisC-和和hisC+，分别表示缺陷型和野生型。分别表示缺陷型

40、和野生型。a.基本培养基基本培养基（MM，符号为）符号为）与筛选营养缺陷型突变株有关的与筛选营养缺陷型突变株有关的3类培养基类培养基 仅能满足某微生物的野生型菌株生长所需的仅能满足某微生物的野生型菌株生长所需的最低成分的组合培养基，称最低成分的组合培养基，称MM。b.完全培养基完全培养基（complete medium，CM，符号为）符号为）凡可满足一切营养缺陷型菌株营养需要的天然凡可满足一切营养缺陷型菌株营养需要的天然或半组合培养基，称为或半组合培养基，称为CM。一般可在基本培养基中加入一些富含氨基酸、一般可在基本培养基中加入一些富含氨基酸、维生素、核苷酸和碱基之类的天然物质，如蛋白维生素、

41、核苷酸和碱基之类的天然物质，如蛋白胨或酵母膏等配制而成。胨或酵母膏等配制而成。c.补充培养基补充培养基（supplemental medium，SM，符号为符号为A或或B等）等）凡只能满足相应的营养缺陷型突变株生长需凡只能满足相应的营养缺陷型突变株生长需要的组合或半组合培养基，称为要的组合或半组合培养基，称为SM。在基本培养基上再添加对某一营养缺陷型突在基本培养基上再添加对某一营养缺陷型突变株所不能合成的某相应代谢产物所组成，可专变株所不能合成的某相应代谢产物所组成，可专门选择相应的突变株。门选择相应的突变株。原养型原养型（prototroph）与营养缺陷型突变有关的与营养缺陷型突变有关的3类

42、遗传型个体类遗传型个体野生型野生型（wild type，wild strain）营养缺陷型营养缺陷型（auxotroph）从自然界分离到的原始菌株（从自然界分离到的原始菌株（AB）经诱变剂处理后的突变株（经诱变剂处理后的突变株（AB）经回复突变或重组后产生的菌株（经回复突变或重组后产生的菌株（AB）营养缺陷型的筛选方法营养缺陷型的筛选方法第一步，诱变剂处理第一步，诱变剂处理第二步，淘汰野生型第二步，淘汰野生型第三步，检出缺陷型第三步，检出缺陷型第四步，鉴定缺陷型第四步，鉴定缺陷型第三步，检出缺陷型第三步，检出缺陷型夹层培养法夹层培养法（layer plating method）限量补充培养法限

43、量补充培养法逐个检出法逐个检出法影印平板法影印平板法第四步，鉴定缺陷型第四步，鉴定缺陷型借助借助生长谱法生长谱法（auxanography）进行。进行。1.1.营养缺陷型营养缺陷型（auxotroph）某一野生型菌株因发生基因突变而某一野生型菌株因发生基因突变而丧失丧失合成一种或合成一种或几种生长因子、碱基或氨基酸的能力，几种生长因子、碱基或氨基酸的能力，只有从周围环境只有从周围环境或培养基中获得这些或培养基中获得这些营养或其前体物营养或其前体物（precursor）才能才能正常生长繁殖的变异类型，称为正常生长繁殖的变异类型，称为营养缺陷型营养缺陷型。营养缺陷型突变株营养缺陷型突变株在遗传学、

44、分子生物学、遗传育种在遗传学、分子生物学、遗传育种和遗传工程等研究中和遗传工程等研究中十分重要十分重要表型判断的标准：表型判断的标准：在基本培养基上能否生长在基本培养基上能否生长营养缺陷型的表示方法：营养缺陷型的表示方法：基因型：基因型：所需营养物的前三个英文所需营养物的前三个英文小写斜体字母小写斜体字母表示：表示：hisC（组氨酸缺陷型，其中的大写字母组氨酸缺陷型，其中的大写字母C同一表型中不同基因的突变同一表型中不同基因的突变）表型：表型：同上，但同上，但第一个字母大写第一个字母大写，且不用斜体：，且不用斜体：HisCHisChisC缺陷型缺陷型hisC野生型野生型2.2.抗性突变型抗性突

45、变型（resistant mutant）指野生型菌株因发生基因突变，指野生型菌株因发生基因突变，使菌株对使菌株对对某化对某化学药物或致死物理因子学药物或致死物理因子，特别是抗生素，产生抗性，特别是抗生素，产生抗性的的抗性变异类型抗性变异类型。特特 点：点：正选择标记正选择标记（突变株可直接从抗性平板上获得（突变株可直接从抗性平板上获得在加有相应在加有相应抗生素的平板上，只有抗性突变能生长。所以很容抗生素的平板上，只有抗性突变能生长。所以很容易分离得到。易分离得到。）表示方法：表示方法：所抗药物的所抗药物的前三个小写斜体英文字母前三个小写斜体英文字母加上加上“r”表示。表示。strr对链霉素的对

46、链霉素的抗性抗性strs对链霉素的对链霉素的敏感性敏感性抗性突变菌株抗性突变菌株在遗传学、分子生物学、遗传育种在遗传学、分子生物学、遗传育种和遗传工程等研究中和遗传工程等研究中极为重要极为重要3.3.条件致死突变型条件致死突变型（conditional lethal mutant）某菌株或病毒经基因突变后，在某种条件下某菌株或病毒经基因突变后，在某种条件下可可正常正常地生长、繁殖并呈现其固有的表型，而在地生长、繁殖并呈现其固有的表型，而在另一种条件下却另一种条件下却无法无法生长、繁殖，这种突变类型生长、繁殖，这种突变类型称为称为条件致死突变型条件致死突变型。在在2525下可感染其下可感染其E.

47、coli宿主宿主在在3737却不能感染却不能感染TsTs突变株突变株即即温度敏感突变株温度敏感突变株（temperature sensitive mutant，Ts Ts mutant）是一类典型的条件是一类典型的条件致死突变株。致死突变株。E.coli的某些菌株的某些菌株在在3737下正常生长下正常生长不能在不能在4242下生长下生长某些某些T4T4噬菌体突变株噬菌体突变株产生产生TsTs突变的原因突变的原因在某特定的温度下具有功能在某特定的温度下具有功能在另一温度（一般为较高温度）下则无功能在另一温度（一般为较高温度）下则无功能突变使某些重要蛋白质的结构和功能发生改变，突变使某些重要蛋白质

48、的结构和功能发生改变，4.4.形态突变型形态突变型（morphological mutant）指由于突变而引起的个体或菌落形态的指由于突变而引起的个体或菌落形态的非选择性变异非选择性变异。个体变异个体变异孢子有无、孢子颜色、孢子有无、孢子颜色、鞭毛有无或荚膜有无等的突变鞭毛有无或荚膜有无等的突变菌落变异菌落变异菌落表面光滑、粗糙、菌落表面光滑、粗糙、噬菌斑的大小或清晰度等的突变噬菌斑的大小或清晰度等的突变特点：特点：非选择性突变非选择性突变突变株和野生型菌株均可生长，但可从形态突变株和野生型菌株均可生长，但可从形态特征上进行区分。特征上进行区分。举例：举例：菌落颜色变化菌落颜色变化半乳糖苷酶基

49、因的插入失活半乳糖苷酶基因的插入失活重组子菌落重组子菌落白色白色非重组子菌落非重组子菌落兰色兰色5.5.抗原突变型抗原突变型（antigenic mutant）指由于基因突变引起的细胞抗原结构发生的指由于基因突变引起的细胞抗原结构发生的变异类型，一般也属变异类型，一般也属非选择性突变非选择性突变。例如，例如，细胞壁缺陷变异（细胞壁缺陷变异（L L型细菌等）、型细菌等）、荚膜或鞭毛成分变异等。荚膜或鞭毛成分变异等。6.6.产量突变型产量突变型（metabolite quantitative mutant）通过基因突变而产生的在代谢产物产量上明显通过基因突变而产生的在代谢产物产量上明显有别于原始菌

50、株的突变株，称为有别于原始菌株的突变株，称为产量突变型产量突变型。“正变株正变株”（plus-mutant）产量产量高于高于原始菌株原始菌株“负变株负变株”（minus-mutant）产量产量低于低于原始菌株原始菌株筛选高产正变株的工作对生产实践极其重要筛选高产正变株的工作对生产实践极其重要在育种实践上在育种实践上诱变育种诱变育种重组育种重组育种遗传工程育种遗传工程育种平板法的优点：平板法的优点：快速简便，工作量小，结果直观性强（例如可用快速简便，工作量小，结果直观性强（例如可用上述变色圈、透明圈、抑制圈、生长圈或沉淀圈上述变色圈、透明圈、抑制圈、生长圈或沉淀圈等方法测定某代谢产物的量）；等方

51、法测定某代谢产物的量）；平板法的缺点：平板法的缺点：在培养皿平板上固态培养的结果不一定能反映摇瓶在培养皿平板上固态培养的结果不一定能反映摇瓶培养或发酵罐中液体培养的结果。培养或发酵罐中液体培养的结果。back1性状稳定的菌种是微生物学工作最重要的基本要求，性状稳定的菌种是微生物学工作最重要的基本要求，否则生产或科研都无法正常进行。否则生产或科研都无法正常进行。二、微生物的菌种保藏二、微生物的菌种保藏根据菌种特性和保藏目的不同，根据菌种特性和保藏目的不同，给特定环境使其存活而得以保存。给特定环境使其存活而得以保存。由于自发突变导致某物种原有一系列生物学性状由于自发突变导致某物种原有一系列生物学性

52、状发生量变或质变的现象。发生量变或质变的现象。菌种衰退的表现：菌种衰退的表现：形态性状形态性状 生长速度生长速度 代谢能力代谢能力 侵染力侵染力 不良条件抗性不良条件抗性 控制传代次数控制传代次数 创造良好的培养条件创造良好的培养条件 利用不同类型细胞进行接种传代利用不同类型细胞进行接种传代 有效的菌种保藏方法有效的菌种保藏方法中国微生物菌种保藏委员会（中国微生物菌种保藏委员会（CCCCM)中国典型培养物保藏中心（中国典型培养物保藏中心（CCTCC）美国典型菌种保藏中心（美国典型菌种保藏中心（ATCC）等）等微生物的保藏技术微生物的保藏技术斜面保藏斜面保藏液体石蜡保藏液体石蜡保藏冷冻保藏冷冻保

53、藏干燥保藏法干燥保藏法 简单的短期保藏方法，适合于细菌、放线菌、酵母和简单的短期保藏方法，适合于细菌、放线菌、酵母和霉菌，一般霉菌，一般4保藏保藏1-61-6个月。个月。2.1 斜面保藏斜面保藏2.2 液体石蜡保藏液体石蜡保藏穿刺保藏法穿刺保藏法 常用于好气性细菌的保藏，常用于好气性细菌的保藏，4下保藏下保藏6-126-12个月。个月。液体石蜡油封藏法液体石蜡油封藏法 在生长良好的斜面菌种上倒入已灭菌的液体石蜡，液层在生长良好的斜面菌种上倒入已灭菌的液体石蜡，液层1cm，室温或，室温或4下保藏，下保藏，1-21-2年。一般用于丝状真菌。年。一般用于丝状真菌。使微生物处于冷冻状态，使微生物处于冷

54、冻状态，代谢作用停止代谢作用停止以达到保以达到保藏目的。藏目的。F微生物细胞对微生物细胞对低温敏感低温敏感，可用速冻、快速降温和添，可用速冻、快速降温和添加各种保护剂等手段。加各种保护剂等手段。F液氮保藏或液氮保藏或-70低温保藏。低温保藏。F用用普通冰箱普通冰箱冷冻保存菌种的效果往往远低于低温冰冷冻保存菌种的效果往往远低于低温冰箱，应注意箱，应注意经常检查保藏物的存活情况，随时转种经常检查保藏物的存活情况，随时转种。2.3 冷冻保藏冷冻保藏水分对各种生化反应和一切生命活动至关重要，水分对各种生化反应和一切生命活动至关重要，因此，干燥，尤其是深度干燥是微生物保藏技术因此，干燥，尤其是深度干燥是

55、微生物保藏技术中另一项经常采用的手段。中另一项经常采用的手段。沙土管保存沙土管保存和和冷冻真空干燥保藏冷冻真空干燥保藏是常用的微生物是常用的微生物干燥保藏技术。干燥保藏技术。2.4 干燥保藏法干燥保藏法F沙土管保存沙土管保存 主要适用于产芽孢或分生孢子的细菌主要适用于产芽孢或分生孢子的细菌，如芽孢，如芽孢杆菌、放线菌等。菌种培养长出大量的芽孢或孢子，杆菌、放线菌等。菌种培养长出大量的芽孢或孢子，洗下孢子制备孢子悬液，加入无菌的沙土试管中，洗下孢子制备孢子悬液，加入无菌的沙土试管中，减压干燥，抽干水分，最后用石蜡、胶塞等封闭管减压干燥，抽干水分，最后用石蜡、胶塞等封闭管口，置冰箱保存。芽孢可常温

56、保存。口，置冰箱保存。芽孢可常温保存。此法简便易行，并可以将微生物保藏较长时间。此法简便易行，并可以将微生物保藏较长时间。F冷冻真空干燥保藏冷冻真空干燥保藏将加有保护剂的样品预先冷冻，抽真空除水分，将加有保护剂的样品预先冷冻，抽真空除水分，干燥的样品可在真空或惰性气体密闭环境中置低干燥的样品可在真空或惰性气体密闭环境中置低温保存，温保存，使微生物处于干燥、缺氧及低温、休眠使微生物处于干燥、缺氧及低温、休眠状态，状态，可达到长期保藏目的。可达到长期保藏目的。此法是目前使用最普遍，也是最重要的微生物保此法是目前使用最普遍，也是最重要的微生物保藏方法，为大多数专业的菌种保藏机构均采用。藏方法，为大多数专业的菌种保藏机构均采用。