植物的抗性评价测定实验方法

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1、植物的抗性（低温、高温）评价测定实验方法（张平贤收集）实验一植物体内游离脯氨酸含量的测定一、目的在逆境条件下（旱、热、冷、冻），植物体内脯氨酸的含量显著增加，植物 体内脯氨酸含量在一定程度上反映了植物的抗逆性，抗旱性强的品种积累的脯氨 酸多。因此测定脯氨酸含量可以作为抗旱育种的生理指标。另外，由于脯氨酸亲 水性极强，能稳定原生质胶体及组织内的代谢过程，因而能降低冰点，有防止细 胞脱水的作用。在低温条件下，植物组织中脯氨酸增加，可提高植物的抗寒性， 因此，亦可作为抗寒育种的生理指标。二、原理磺基水杨酸对脯氨酸有特定反应，当用磺基水杨酸提取植物样品时，脯氨酸 便游离于磺基水杨酸溶液中。然后用酸性茚

2、三酮加热处理后，茚三酮与脯氨酸反 应，生成稳定的红色化合物，再用甲苯处理，则色素全部转移至甲苯中，色素的 深浅即表示脯氨酸含量的高低。在520nm波长下测定吸光度，即可从标准曲线上 查出脯氨酸的含量。三、材料、仪器及试剂1. 材料：植物叶片。2. 仪器：分光光度计；电子分析天平；离心机；小烧杯；普通试管；移液管； 注射器；恒温水浴锅；漏斗；漏斗架；滤纸；剪刀；洗耳球。3 .试剂及配制：2.5 %酸性茚三酮溶液配制:将1.25g茚三酮溶于30ml冰醋酸和20ml 6mol -L -1磷酸中，搅拌加热（70C ）溶解，贮于4T冰箱中，2-3日有效。3%磺基水杨酸配配制：3g磺基水杨酸加蒸馏水溶解后

3、定容至100ml。10p gml-1脯氨酸标准母液配制：精确称取20mg脯氨酸，倒入小烧杯内， 用少量蒸馏水溶解，再倒入200ml容量瓶中，加蒸馏水定容至刻度（为100. g -ml -1脯氨酸母液），再吸取该溶液10ml,加蒸馏水稀释定容至100ml,即为10. g - ml-1脯氨酸标准液。100. gml 1脯氨酸母液:称10mg脯氨酸溶于少量的乙醇中，用蒸馏水定 容至100ml冰醋酸；甲苯。四、实验步骤1、脯氨酸标准曲线的制作1.1取6支试管，编号，按下表配制每管含量为012. g的脯氨酸标准液。 加入表中试剂后，置于沸水浴中加热30min。取出冷却，各试管再加入4ml甲苯， 振荡30

4、秒钟，静置片刻，使色素全部转至甲苯溶液。试剂管号01234510. gml-1脯氨酸标准液（ml）00.20.40.60.81.0蒸馏水（ml）21.81.61.41.21.0冰醋酸（ml）2222222.5%酸性茚三酮（ml）444444每管脯氨酸含量（p g）02468101.2用注射器轻轻吸取各管上层脯氨酸甲苯溶液至比色杯中，以甲苯溶液为 空白对照，在520mm波长处测定吸光度（A）值。1.3标准曲线的绘制以15号管脯氨酸含量为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线。2.样品的测定2.1脯氨酸的提取称取不同处理的植物叶片各0.5g，分别置大试管中，然后向各管分别加入 5ml 3%的磺基水

5、杨酸溶液，在沸水浴中提取10min （提取过程中要经常摇动）， 冷却后过滤于干净的试管中，滤液即为脯氨酸的提取液。2.2测定吸取2ml提取液于带玻塞试管中，加入2ml冰醋酸、2ml HO、4ml 2.5%酸 2性茚三酮试剂，在沸水浴中加热30min，溶液即呈红色。冷却后加入4ml甲苯， 摇荡30秒钟，静置片刻，取上层液至10ml离心管中，在3000r/min离心5min。用吸管轻轻吸取上层脯氨酸红色甲苯溶液于比色杯中，以甲苯溶液为空白对 照，在520mm波长处测定吸光度（A）值。五、计算结果从标准曲线上查出样品测定液中脯氨酸的含量，按下公式计算样品中脯氨酸含量：XX提取液总量（ml）脯氨酸含量

6、（ g g-iFw）=样品鲜重（g）X测定时提取液用量（ml）公式中：X 一从标准曲线中查得的脯氨酸含量（p g）六、注意事项：1. 配置的酸性茚三酮溶液仅在24 h内稳定，因此最好现用现配。2. 测定样品若进行过渗透胁迫处理，结果会更显著。3.试剂添加次序不能出错。实虹植物体内丙二醛含量的测定一、目的通过实验，掌握植物体内丙二醛含量测定的原理及方法。二、原理丙二醛（MDA）是由于植物官衰老或在逆境条件下受伤害，其组织或器官膜 脂质发生过氧化反应而产生的。它的含量与植物衰老及逆境伤害有密切关系。测 定植物体内丙二醛含量，通常利用硫代巴比妥酸（TBA）在酸性条件下加热与组织 中的丙二醛产生显色反

7、应，生成红棕色的三甲川（3、5、5一三甲基恶唑2、4- 二酮），三甲川最大的吸收波长在532nm。但是测定植物组织中MDA时受多种物 质的干扰，其中最主要的是可溶性糖，糖与硫代巴比妥酸显色反应产物的最大吸 收波长在450nm处，在532nm处也有吸收。植物遭受干旱、高温、低温等逆境胁 迫时可溶性糖增加，因此测定植物组织中丙二醛与硫代巴比妥酸反应产物含量时 一定要排除可溶性糖的干扰。此外在532nm波长处尚有非特异的背景吸收的影响 也要加以排除。低浓度的铁离子能显著增加硫代巴比妥酸与蔗糖或丙二醛显色反 应物在532、450nm处的吸光度值，所以在蔗糖、丙二醛与硫代巴比妥酸显色反 应中需要有一定的

8、铁离子，通常植物组织中铁离子的含量为100 300gg 一 1Dw，根据植物样品量和提取液的体积，加入Fe3 +的终浓度为0.5nmolL1。 在532nm、600nm和450nm波长处测定吸光度值，即可计算出丙二醛含量。三、材料、仪器设备及试剂1. 材料：植物叶片。2. 仪器设备：离心机，分光光度计；电子分析天平；恒温水浴；研钵；试管; 移液管(1ml、5ml)、试管架；移液管架；洗耳球；剪刀。3. 试剂：10%三氯乙酸；0.6%硫代巴比妥酸(TBA)溶液：石英砂。四、实验步骤(1) 提取采用硫代巴比妥酸显色法(赵世杰等，2002)。取叶片，洗净擦干后去中脉。 称取0.5 g样品，加5%三氯

9、乙酸2 mL和少量石英砂，研磨至匀浆，再加8ml三氯 乙酸进一步研磨，匀浆后4000 rpm，离心10min。(2) 显色取上清液2 mL，口0.6% TBA 2 mL，混合后在100C水浴上煮沸30 min，迅速 在冰浴上冷却后再离心一次。分别测定上清液在532 nm和600 nm处的吸光度值，MDA质量摩尔浓度(nmol/g) = ( A532-A600) XVzXv/ (0.155XWXV2) 式中：Vz：反应液总量(4mL)；V1：提取液体积(10mL)；V:测定用用提取液量(2 mL)； W:取样叶鲜重(g) 0.155:为MDA的消光系数(nmol/l)五、结果计算由于蔗糖-TBA

10、反应产物的最大吸收波长为450nm，毫摩尔吸收系数为85.4x10 -3，MDA-TBA反应产物在532nm的毫摩尔吸收系数分别是7.4x10-3和155x10- 3,532nm非特异性吸光值可以在600nm处的吸光值为代表。A颂=(85.4x10 3) C糖A532-A600=(155x10-3)CMDA+(85-4X10-3)- C解，得。糖=A450/(85.4x10-3)=11.71 A50 (mmol/L)CMDA=6,45(A532 A600)-0,56 A450(umol/L)式子中，A颂在450nm波长下测得的吸光度值A532在532nm波长下测得的吸光度值A砌 在600nm波

11、长下测得的吸光度值C糖、孔分别是反应混合溶液中可溶性糖、MDA的浓度DA实验三SOD活力测定(NBT还原法)一、原理超氧物歧化酶(superoxidedismutase, SOD)普遍存在于动、植物体内，是 一种清除超氧阴离子自由基的酶。本实验依据超氧物歧化酶抑制氮蓝四唑(NBT) 在光下的还原作用来确定酶活性大小。在有氧化物质存在下，核黄素可被光还原， 被还原的核黄素在有氧条件下极易再氧化而产生02,可将氮蓝四唑还原为蓝色 的甲腙，后者在560nm处有最大吸收。而SOD可清除02,从而抑制了甲腙的形 成。于是光还原反应后，反应液蓝色愈深，说明酶活性愈低，反之酶活性愈高。 据此可以计算出酶活性

12、大小。二、材料、仪器设备及试剂(一) 仪器设备：1.高速台式离心机；2.分光光度计；3.微量进样器；4.荧光灯(反应试管处照度为4000Lx)； 5.试管或指形管数支。(二)试剂(1) 0.1 mol/L pH7.8 磷酸钠(Na2HPO4-NaH2PO4 )缓冲液：A 液(0.1 mol/L Na2HPO4 溶液)：准确称取 Na2HPO4 - 12H2O(MW=358.14) 3.5814g于100mL小烧杯中，用少量蒸馏水溶解后，移入100mL容量瓶中用蒸馏 水定容至刻度，充分混匀。4P冰箱中保存备用。B 液(0.1 mol/L NaH2PO4 溶液)：准确称取 NaH2PO4 - 2H

13、2O (MW=156.01) 0.780g于50mL小烧杯中，用少量蒸馏水溶解后，移入50mL容量瓶中用蒸馏水 定容至刻度，充分混匀。4P冰箱中保存备用。取上述A液183mL与B液17mL充分混匀后即为0.1 mol/L pH7.8的磷酸 钠缓冲液。4P冰箱中保存备用。(2) 0.026 mol/L蛋氨酸(Met)磷酸钠缓冲液准确称取L-蛋氨酸(C5H11NO2S，MW=149.21) 0.3879g于100mL小烧杯中， 用少量0.1 mol/L pH7.8的磷酸钠缓冲液溶解后，移入100mL容量瓶中并用0.1 mol/L pH7.8的磷酸钠缓冲液定容至刻度，充分混匀(现用现配)。4C冰箱中

14、保 存可用12d。(3) 7.5 X 10-4mol/L NBT 溶液准确称取 NBT (C4OH3OCl2N10O6, MW=817.7) 0.1533g 于 100mL 小烧杯中， 用少量蒸馏水溶解后，移入250mL容量瓶中用蒸馏水定容至刻度，充分混匀(现 配现用)。4C冰箱中保存可用23d。(4) 含 1.0. mol/L EDTA 的 2X 10-5 mol/L 核黄素溶液A液：准确称取EDTA (MW=292) 0.00292g于50mL小烧杯中，用少量蒸馏 水溶解。B液：准确称取核黄素(MW=376.36) 0.0753g于50mL小烧杯中，用少量蒸 馏水溶解。C液：合并A液和B液

15、，移入100mL容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度，此 溶液为含0.1mmol/L EDTA的2mmol/L核黄素溶液。4C冰箱中保存可用810d。 该溶液应避光保存，即用黑纸将装有该液的棕色瓶包好，置于4C冰箱中保存。当测定SOD酶活时，将C液稀释100倍，即为含1.0口 mol/L EDTA的2 X10 5 mol/L核黄素溶液。（5）0.05 mol/L pH7.8磷酸钠缓冲液取0.1 mol/L pH7.8的磷酸钠缓冲液50mL，移入100mL容量瓶中用蒸馏水 定容至刻度，充分混匀。4P冰箱中保存备用。三、实验步骤1. 酶液提取取一定部位的植物叶片（视需要定，去叶脉）0.5g于预冷的研钵中，

16、1ml 预冷的0.05 mol/L pH7.8磷酸缓冲液在冰浴上研磨成浆，加缓冲液使终体积为 5ml。于1000rpm下离心20min，上清液即为SOD粗提液。2. 显色反应取5ml指形管（要求透明度好）4支，2支为测定管，另2支为对照管，按 下列加入各溶液：依次加入0.05mol/L磷酸缓冲液1.5ml，130mmol/L Met溶液 0.3ml，750p mol/L NBT 溶液 0.3ml，100p mol/L EDTA Na2 液 0.3ml，20p mol/L 核黄素0.3ml，蒸馏水0.5ml。2支测定管加酶液0.1ml （2支对照管以缓冲液代替，加0.1ml），混匀后将1 支对照

17、管置暗处，其它各管于4000Lx日光下反应20min，然后立即遮光，以遮 光管为对照调零，于560nm下测定光密度。（要求各管受光情况一致，温度高时 间缩短，低时延长）。3.SOD活性测定与计算全反应结束后，以不照光的对照管做空白，分别测定其它各管的吸光度。四、结果计算已知SOD活性单位以抑制NBT光化还原的50 %为一个酶活性单位表示，按下式计算SOD活性。SOD 总活性=（Ack-AE）XV/（AckX0.5XWXVt）SOD比活力=SOD总活性/蛋白质含量上式中：SOD总活性以每克鲜重酶单位表示；SOD比活力：单位以酶单位/ mg蛋白表示Ack：照光对照管的吸光度AE：样品管的吸光度V：

18、样品液总体积（ml）W：样鲜重（g）Vt测定时样品用量（ml）蛋白质含量单位为：mg蛋白实验四 考马斯亮蓝G-250染色法测定蛋白质含量一、目的1、学习一种蛋白质染色测定的方法2、掌握考马斯亮蓝法测定蛋白质含量的基本原理和方法二、原理蛋白质的存在影响酸碱滴定中所用某些指示剂的颜色变化，从而改变这些染 料的光吸收。在些基础上发展了蛋白质染色测定方法。涉及的指示剂有甲基橙、 考马斯亮蓝、漠甲酚绿和漠甲酚紫。目前广泛使用的染料是考马斯亮蓝。考马斯亮蓝G-250在酸性溶液中为棕红色，当它与蛋白质通过范德华键结合 后，变为蓝色，且在蛋白质一定浓度范围内符合比尔定律，可在595nm处比色测 定。25分钟即

19、呈最大光吸收，至少稳定1小时。在0.011.0 mg蛋白质/ml 范围内均可。该法操作简便迅速，消耗样品量少，但不同蛋白质之间差异大，且 标准曲线线性差。高浓度的Tris、EDTA、尿素、甘油、蔗糖、丙酮、硫酸铵和 去污剂时测定有干扰。缓冲液浓度过高时，改变测定液pH值会影响显色。考马 斯亮蓝染色能力强，比色杯不洗干净会影响光吸收值，不可用石英怀测定。三、材料、试剂与器具1试剂1.1染色液：取考马斯亮蓝G-250 100mg溶于50ml 95%乙醇中，加100ml 85% 磷酸，加水稀释至1升。该染色液可保存数月，若不加水可长期保存，用前稀释。1.2标准蛋白溶液：0.5mg/ml牛血清白蛋白。

20、1.3未知浓度的蛋白质溶液用酪蛋白配制，浓度控制在1030mg/ml2器具2.1试管及试管架2.2 移液管（1ml,5ml）2.3可见光分光光度计四、操作步骤1标准曲线的制作1.1取7支试管，按下表加入试剂管编号 试剂（ml广01234561mg/ml牛血清蛋白00.10.20.40.60.81蒸馏水10.90.80.60.40.20考马斯亮蓝试剂55555551.2将试管摇匀，放置20分钟。1.3用分光光度计比色测定吸光值A595。1.4以A595nm为纵坐标，标准蛋白色质浓度为横坐标，绘制标准曲线。2 样品的测定2.1取一支试管，加入未知浓度的蛋白质溶液0.2ml，蒸馏水0.8ml考马斯 亮蓝试剂5ml.2.2将试管摇匀，放置20分钟。2.3比色测定吸光值A595nm，对照标准曲线求得蛋白质的浓度。五、 注意事项5951、由于染料本身的两种颜色形式的光谱有重叠，试剂背景值会因与蛋白质 结合的染料增加而不断降低，因而当蛋白质浓度较大时，标准曲线稍有弯曲，但 直线弯曲程度很轻，不致影响测定2、测定工作应在蛋白质染料混合后2min开始，力争1hr内完成，否则会因 蛋白质一染料复合物发生凝集沉淀而影响测定结果。六、结果分析绘制标准曲线，并将实验结果与其他蛋白质测定方法比较分析