志贺氏菌检测

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1、志贺氏菌的检验（国标法）一、增菌称取检样25g,加入装有225mLGN增菌液的500mL广口瓶内，固体食品用均质 器以8000-10000r/min打碎1min，或用乳钵加灭菌砂磨碎，粉状食品用金属匙或 玻璃棒研磨使其乳化，于36C培养68h。培养时间视细菌生长情况而定，当培养液出现轻微混浊时即应中止培养。二、分离和初步生化试验取增菌液1环，划线接种于HE琼脂平板或SS琼脂平板1个；另取1环划线接 种于麦康凯琼脂平板和伊红美蓝琼脂平板各1个，于36C培养1824h。志贺氏菌在这些培养基上呈现无色透明不发酵乳糖的菌落。挑取平板上的可疑菌落，接种三糖铁琼脂和葡萄糖半固体各1管。一般应多挑几 个菌落

2、，以防遗漏，经36C培养1824h，分别观察结果。下述培养物可以弃去：a. 在三糖铁琼脂斜面上呈蔓延生长的培养物；b. 在1824h内发酵乳糖、蔗糖的培养物；c. 不分解葡萄糖和只生长在半固体表面的培养物；d. 产气的培养物；e. 有动力的培养物；f. 产生硫化氢的培养物。凡是乳糖、蔗糖不发酵，葡萄糖产酸不产气（福氏志贺氏菌6型可产生少量气体）， 无动力的菌株，可做血清学分型和进一步的生化试验。三、血清学分型挑取三糖铁琼脂上的培养物，做玻片凝集试验。先用4种志贺氏菌多价血清检查，如果由于K抗原的存在而不出现凝集，应将 菌液煮沸后再检查；如果呈现凝集，则用A1、A2、B群多价和D群血清分别试验。

3、如系B群福氏志贺氏菌，则用群和型因子血清分别检查。福氏志贺氏菌各型和 亚型的型和群抗原见表1。可先用群因子血清检查，再根据群因子血清出现凝集 的结果，依次选用型因子血清检查。4种志贺氏菌多价血清不凝集的菌株，可用鲍氏多价1、2、3分别检查，并进一 步用115各型因子血清检查。如果鲍氏多价血清不凝集，可用痢疾志贺氏菌312 型多价血清及各型因子血清检查。四、进一步的生化试验在做血清学分型的同时，应做进一步的生化试验，即：葡萄糖铵西蒙氏柠檬酸盐赖氨酸和鸟氨酸脱羧酶pH7.2尿素KCN生长水杨苷和七叶苷的分解除宋内氏菌和鲍氏13型为乌氨酸阳性外，志贺氏菌属的培养物均为阴性结果。必要时还应做革兰氏染色

4、检查和氧化酶试验，应为氧化酶阴性的革兰氏阴性杆 菌。生化反应不符合的菌株，即使能与某种志贺氏菌分型血清发生凝集，仍不得 判定为志贺氏菌属的培养物。已判定为志贺氏菌属的培养物，应进一步做5%乳糖发酵甘露醇棉子糖甘油的发酵靛基质试验志贺氏菌属4个生化群的培养物，应符合该群的生化特性。但福氏6型的生化特 性与A群或C群相似。五、结果报告：综合生化和血清学的试验结果判定菌型并作出报告。志贺氏菌PCR检测技术进展志贺菌又称痢疾杆菌，能侵袭结肠膜上皮细胞，引起人类细菌性痢疾。按抗原结构和生化反 应的不同可分为痢疾、福氏、鲍氏和宋内氏志贺菌。传统的检测方法必须经过增菌培养、分 离培养和初步生化实验等步骤，操

5、作烦琐费时。分子杂交不但技术复杂，而且克隆培养时其 大质粒极易丢失和基因突变，阳性率不高。聚合酶链式反应(Polymerase chain reaction, PCR)， 是一种体外DNA扩增技术，在体外利用模板DNA、特定的寡聚核苷酸引物和DNA聚合酶， 通过DNA变性、复性和延伸过程合成一条互补的DNA链。反复重复这一过程，模板DNA 就可得到大量扩增。随着微生物基因组学的发展，对志贺菌的基因结构已经清楚，1987年 Buysse等1发现志贺菌侵袭性质粒抗原H (invasive plasmid, ipaH)存在于各型志贺菌， 同时多拷贝存在于染色体和侵袭性大质粒上，不随传代而丢失。199

6、5年，Fasano等2报 道两种志贺菌肠毒素SHET1、SHET2编码基因。根据志贺氏菌特异性基因片段中的开放框 架部分序列设计引物，可进行PCR检测。现将志贺氏菌PCR检测技术研究进展综述如下。1常规PCR常规PCR必须知道待扩增目的片段的序列，根据这一序列设计一对相应的 引物。1998年，Islam等3以志贺菌ipaH基因序列为靶目标，设计一对引物 (5,-GTTCCTTGACCGCCTTTCCGATAC-3,和 5-GCCGGTCAGCCACCCTA-3)，扩增产物 为700 bp,他们对临床上疑似菌痢的粪便标本进行检测，以PCR为金标准，培养法的敏感 性和特异性分别为72%和100%。

7、他们对123株侵袭性大肠杆菌进行PCR检测，没有产生 阳性结果。常规PCR扩增后需做凝胶电泳鉴定，比较繁琐，而且扩增产物极易受到污染造 成假阳性。2多重PCR多重PCR是在同一个反应管中用多对引物同时扩增几条DNA片段的方 法，其反应原理、反应试剂和操作过程与一般PCR相同。由于志贺菌有4个种群，具不同 的抗原基因，只针对一种抗原基因的单一PCR，有时会漏检也不利于分群。多重PCR能全 方位高效率地检测志贺菌。Thong等4针对志贺菌的set1A、set1B、ial、ipaH基因，设 计不同的引物对，扩增序列分别为set1A (5-TCA CGC TAC CAT CAAAGA3和5-TAT C

8、CC CCT TTG GTGGTA-3)、set1B (5-GTG AAC CTG CTG CCGATA TC-3和口 5-ATT TGT GGA TAA AAATGACG-3)、ial(5-CTG GAT GGT ATG GTGAGG-3和口 5-GGA GGC CAA CAA TTATTTCC-3)、ipaH(5-TGG AAA AAC TCA GTGCCT CT-3和 5-CCA GTC CGT AAA TTCATT CT3)在同一 PCR反应体系内同时扩增set1A、set1B、ial、ipaH基因，对110株志 贺菌其中福氏84株、宋内氏15株、痢疾10株、鲍特氏1株进行检测。结果显

9、示，重现性 为100%，最低检测浓度为100 cfu/ml，并且不出现假阳性和假阴性。与其他常规方法相比， 多重PCR省时、省力、灵敏性更高，在做更多基因靶点时优势更突出，也可用于志贺菌的 鉴定。3免疫磁珠分离PCR (IMS-PCR)免疫磁珠(immunomagnetic bead, IMB)就是将直径 0.054 gm具有超顺磁性的微粒表面经化学修饰，使之与特异性抗体牢固结合，成为能与 特异性抗原结合且有磁性的磁珠。被检测样品在磁板背景下与IMB混合，若有相应的抗原 存在，IMB就会将其捕获，利用磁性将IMB聚集，然后进行分离，用于PCR测定。Islam 等5用志贺菌单克隆抗体包被环氧超顺

10、磁珠，然后再采用IMB对标本中的志贺菌进行I MS， 用于下一步的PCR检测。他们根据志贺菌ial基因序列，设计一对引物 (5-CTGGATGGTATGGTGAGG3和 5-GGAGGCCAACAATTATTTCC3)，探针(5,-CCATCTATTAGAJTACCTGTG-3,)，预期的扩增产物为320 bp。对248份粪便标本进 行IMS-PCR检测，同时用基因探针平行检测。结果57份痢疾1型和68份福氏菌全部检出， 最低检出量分别为10个细菌/克。与探针检测结果相符。IMS-PCR技术最突出的优点是特异 性强，可以明显提高准确性，快速仅用7 h就能完成检测结果。4免疫捕捉PCR (Imm

11、unocapture PCR)通过免疫捕捉结合PCR扩增来检测微量抗原的 方法。Peng等6在固相载体(聚苯乙烯)上包被志贺菌特异性抗体，捕获志贺菌后，用 于下一步的PCR检测。他们以志贺菌16 S核糖体rRND保守区域作为靶目标，设计引物 (5f-AAACTCAAAGGAATTGAC-3f 5-GACGGGCGGTGTGTACAA-3)，预期扩增片断为 500 bp，对35份样本进行检测，同时用常规PCR法和培养法平检测。结果Immunocapture PCR 有23份阳性，培养法5份阳性，该法灵敏度高于常规PCR 4倍以上。免疫捕捉PCR检测对 象是完整的病原体，具有非常高的特异性和敏感性

12、，在传染病的诊断、流行病学调查以及环境 微生物的检测等诸多领域有着广阔的应用前景。5实时荧光定量PCR实时荧光定量PCR包括探针类和染料类两种，探针类是利用与靶 序列特异杂交的探针来指示扩增产物的增加，染料类如SYBR Green I则是利用与双链DNA 小沟结合发光的理化特征指示扩增产物的增加。前者由于增加了探针的识别步骤，特异性更 高；但后者则简便易行，成本较低。荧光探针技术是基于标记基团的荧光共振能转移原理 (FRET )而实现的，当某个荧光基团的发射谱与另一个荧光基团的吸收光谱重叠，且两个 基团距离足够近时，能量可以从短波长(高能量)的荧光基团传递到长波长(低能量)的荧 光基团，相当于

13、短波长荧光基团释放的荧光被屏蔽，这个过程称FRET。按其基团标记和能 量转移的方式，目前已经开发出几种相关的技术，如Taq Man TM探针、双杂交探针、分子 信标、Amplisensor 和 LUX TM Primers 等。5.1 Taq Man TM技术Taq Man TM技术是在一条20多bp的寡核苷酸探针的两端分别 标记上荧光发射基团和淬灭基团，在PCR反应中设立标准品模板系列和阴性对照，根据 FRET原理，探针完整时发射基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；当PCR扩增时，Taq酶 的5-3外切酶活性将探针酶切降解，使荧光发射基团和荧光淬灭基团分离，从而荧光监测系 统可接收到荧光信号，

14、即每扩增一条DNA链，就有一个游离的荧光分子形成，实现了荧光 信号的累积与PCR产物形成完全同步，并计算出Rn值、Rn值、Ct值和阈值。Ct值是指 样品管的荧光信号达到某一固定阈值的PCR反应循环数。同时利用标准品模板系列绘制出 标准曲线，结合各样品的Ct值，就可以确定样品的起初模板量Thiem等7以ipaH基 因为靶目标，设计引物(5，-CCT TTT CCG CGT TCC TTG A3f和 5，-CGG AAT CCG GAG GTA TTGC3)和TaqMan探针(6-carboxyfluorescein-CGCCTTTCCGATACCGTCTCTGCA-6-carboxytetram

15、ethylrhodamine 对 肛拭标本进行实时PCR检测，同进行细菌培养，结果实时PCR与培养法符合率为93%， 在培养法阴性的疑似细痢的标本中，实时PCR检出率为36%。5.2分子信标PCR分子信标技术是一种呈发夹结构的茎环双标记寡核苷酸探针，环形 部分的碱基可与目标核苷酸序列互补，一般为1530个核苷酸长；茎部是由互相配对的碱 基组成，不能与目标基因相配对结合，一般57个核苷酸长；在3和5端分别接上发光基 团和淬灭基团，当溶液中有特异模板时分子信标与模板杂交，从而破坏了发卡结构即实现了 FRET,释放出荧光信号，荧光的强度与溶液中分子信标的量成正比，从而实现了对目的基 因的定量检测。常

16、用的荧光基团有FAM和Texas Red。2006年，赵丽华等8根据GenBank 上公布的福氏志贺菌M32063株ipaH基因序列，设计引物和分子信标探针，扩增产物为150 bp，以4种细菌作对照，进行特异性和灵敏度分析，建立志贺菌的实时PCR快速检测，应 用于食物中毒和食品检测，结果：检测20个样本，志贺菌呈阳性，其它细菌呈阴性，时间 约2 h。同年，吴平芳等9在原来分子信标原理基础上设计引物和改良分子信标探针，扩 增产物为112bp，建立实时PCR-改良分子信标检测体系，应用于对志贺菌食物中毒的快速 诊断和门诊肠道致病菌的检测，结果：改良分子信标实时PCR反应体系DNA灵敏度为93 fg

17、/gl，菌液灵敏度为64 cfu / ml，无交*反应。此反应体系检测67株志贺菌，均出现特异的 荧光信号。对细菌性食物中毒样本等共657份样品进行志贺菌检测，42份志贺菌实时PCR 阳性，其中41份志贺菌细菌培养阳性。从样品处理到检测结果仅需2 h1 d时间。传统PCR 技术扩增后需做凝胶电泳鉴定，扩增产物极易受到污染造成假阳性。分子信标探针荧光定量 PCR反应是一种新的核酸定量技术，该技术将将荧光能量传递技术应用于常规多聚酶链式 反应仪中，可进行定量检测，具有实时监测、准确度强、效率高、无环境污染、假阳性低等 特点。5.3 染料能双重实时 PCR (Duplex Real-Time SYB

18、R Green PCR) SYBR Green I 是一种 只与DNA双链结合的荧光染料。当它与DNA双链结合时，发出荧光；从DNA双链上释放 出来时，荧光信号急剧减弱。因此，在一个体系内，其信号强度代表了双链DNA分子的数 量。SYBR Green荧光染料法定量PCR的基本过程是：(1)开始反应，当SYBR Green染料 与DNA双链结合时发出荧光。(2) DNA变性时，SYBR Green染料释放出来，荧光急剧减 少。在聚合延伸过程中，引物退火并形成PCR产物。聚合完成后，SYBR Green染料 与双链产物结合，定量PCR系统检测到荧光的净增量加大。Fukushima等10基于Ligh

19、t Cycler为平台，利用SYBR Green I染料能特异与双链DNA结合而发荧光的特性，建立一种 Real-time PCR方法来定量检测志贺菌等。他们以志贺菌virA基因为靶点设计引物(5-CTGCATTCTGGCAATCTCTTCACA3和5，-TGATGAGCTAACTTCGTAAGCCCTCC3，)，用该方法检测时，发现所有志贺菌都呈阳性。 SYBR Green I荧光染料能与所有的DNA双链相结合，对DNA模板没有选择性，所以特异 性不如TaqMan探针。要想用荧光染料法得到比较好的定量结果，对PCR引物设计的特异 性和PCR反应的质量要求就比较高。在此前提下，本法是一种成本低廉的选择。