第5章微生物遗传育种课件

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1、第第5 5章章 微生物的遗传与育种微生物的遗传与育种 遗传学的几个概念遗传学的几个概念遗传遗传：亲代将自身一整套遗传因子传递给下一：亲代将自身一整套遗传因子传递给下一代的行为和功能。代的行为和功能。变异变异：生物体的遗传物质结构和数量的改变。：生物体的遗传物质结构和数量的改变。遗传型遗传型（genotypegenotype）：一个生物体所含有的基）：一个生物体所含有的基因的总和。因的总和。表型表型（phenotypephenotype）：一个生物体所具有的一）：一个生物体所具有的一切外表特征和内在特性的总和。切外表特征和内在特性的总和。微生物的独特生物学特性：微生物的独特生物学特性：（1 1）

2、个体的体制极其简单；）个体的体制极其简单；（2 2）营养体一般都是单倍体；营养体一般都是单倍体；（3 3）易于在成分简单的组合培养基上大量生长繁殖；易于在成分简单的组合培养基上大量生长繁殖；（4 4）繁殖速度快；繁殖速度快；（5 5）易于积累不同的中间代谢产物或终产物；易于积累不同的中间代谢产物或终产物；（6 6）菌落形态特征的可见性和多样性；菌落形态特征的可见性和多样性；（7 7）环境条件对微生物群体中各个个体作用的直接环境条件对微生物群体中各个个体作用的直接性和均一性；性和均一性；（8 8）易于形成营养缺陷型；易于形成营养缺陷型；（9 9）存在多种处于进化过程中的原始有性生殖方式；存在多种

3、处于进化过程中的原始有性生殖方式；第一节第一节 遗传变异的物质基础遗传变异的物质基础一、一、DNADNA是遗传变异的物质基础是遗传变异的物质基础 DNADNA是遗传变异的物质基础的证明是遗传变异的物质基础的证明：19441944年以后，利用微生物为实验对象进行的年以后，利用微生物为实验对象进行的三个著名实验：三个著名实验：肺炎球菌的转化试验、噬菌体感染试验、肺炎球菌的转化试验、噬菌体感染试验、病毒的拆开与重建试验。病毒的拆开与重建试验。19281928年，年，GriffithGriffith进行了以下几组实验：进行了以下几组实验：（1 1）动物实验）动物实验对小鼠注射活对小鼠注射活R R菌或死

4、菌或死S S菌菌 小鼠存活小鼠存活对小鼠注射活对小鼠注射活S S菌菌小鼠死亡小鼠死亡对小鼠注射活对小鼠注射活R R菌和热死菌和热死S S菌菌 小鼠死亡小鼠死亡 抽取心血分离活的抽取心血分离活的S S菌菌三个经典实验：三个经典实验：v（一）（一）经典转化实验经典转化实验（transformation）：v研究对象：肺炎双球菌研究对象：肺炎双球菌vS S型菌株：有致病性，菌落表面光滑，有荚膜型菌株：有致病性，菌落表面光滑，有荚膜vR R型菌株：无致病性，菌落表面粗糙，无荚膜型菌株：无致病性，菌落表面粗糙，无荚膜（2 2）细菌培养实验）细菌培养实验热死热死S S菌菌不生长不生长活活R R 菌菌长出长

5、出R R菌菌热死热死S S菌菌+活活R R 菌菌长出大量长出大量R R菌和菌和1010-6-6S S菌菌（3 3）S S型菌的无细胞抽提液试验型菌的无细胞抽提液试验活活R R菌菌+S+S菌无细胞抽提液菌无细胞抽提液长出大量长出大量R R菌和少量菌和少量S S菌。菌。（二）噬菌体感染实验（二）噬菌体感染实验nA.D.Hershey和M.Chase，1952年（1 1）含）含3232P-DNAP-DNA的一组：放射性的一组：放射性85%85%在沉淀中在沉淀中（2 2）含）含3535S-S-蛋白质蛋白质的一组：放射性的一组：放射性75%75%在上清液中在上清液中所以，进入细胞的是噬菌体的核酸而不是蛋

6、白质。所以，进入细胞的是噬菌体的核酸而不是蛋白质。（三）植物病毒的重建实验（三）植物病毒的重建实验v为了证明核酸是遗传物质为了证明核酸是遗传物质，H.Fraenkel-ConratH.Fraenkel-Conrat（19561956）用含）用含RNARNA的烟草花叶病毒（的烟草花叶病毒（TMVTMV）进）进行了著名的行了著名的植物病毒重建实验植物病毒重建实验。v将将TMVTMV在一定浓度的苯酚溶液中振荡，就能将其在一定浓度的苯酚溶液中振荡，就能将其蛋白质外壳与蛋白质外壳与RNARNA核心相分离。分离后的核心相分离。分离后的RNARNA在在没有蛋白质包裹的情况下，也能感染烟草并使其没有蛋白质包裹

7、的情况下，也能感染烟草并使其患典型症状，而且在病斑中还能分离出正常病毒患典型症状，而且在病斑中还能分离出正常病毒粒子粒子。二、二、DNADNA的结构与复制的结构与复制DNADNA的一级结构：指碱基序列的一级结构：指碱基序列 DNADNA的二级结构：主要是的二级结构：主要是B BDNADNA：双螺旋结构：双螺旋结构 DNADNA的三级结构：双螺旋的的三级结构：双螺旋的DNADNA分子可以进一步分子可以进一步盘曲形成更加复杂的结构。盘曲形成更加复杂的结构。DNADNA的复制：半保留复制的复制：半保留复制ATTTCGATTTCGTAAAGCTAAAGCRNARNA等作为遗传物质的基础：等作为遗传物质

8、的基础：n以以RNARNA作为遗传信息的携带者主要是一作为遗传信息的携带者主要是一些些RNARNA病毒：正链病毒：正链RNARNA病毒、负链病毒、负链RNARNA病毒、反转录病毒、反转录RNARNA病毒、双链病毒、双链RNARNA病毒：病毒：n类病毒、卫星类病毒、卫星RNARNAn朊病毒朊病毒:蛋白质蛋白质第二节第二节 微生物的基因组结构微生物的基因组结构基因：一段具有特定功能和结构的连续基因：一段具有特定功能和结构的连续DNADNA片段。片段。基因组：细胞中基因以及非基因的基因组：细胞中基因以及非基因的DNADNA序列的总称，序列的总称，包括结构基因、调控序列以及目前功能未知的包括结构基因、

9、调控序列以及目前功能未知的DNADNA序列。序列。一、原核生物（大肠杆菌）的基因组一、原核生物（大肠杆菌）的基因组 紧密缠绕的环状双链紧密缠绕的环状双链DNADNA分子；遗传信息的连分子；遗传信息的连续性；功能相关的结构基因组成操纵子结构；续性；功能相关的结构基因组成操纵子结构；结构基因的单拷贝及结构基因的单拷贝及rRNArRNA基因的多拷贝；基基因的多拷贝；基因组的重复序列少而短。因组的重复序列少而短。二、真核生物（啤酒酵母）的基因组二、真核生物（啤酒酵母）的基因组n DNADNA与组蛋白构成染色体与组蛋白构成染色体n有间隔子或内含子序列有间隔子或内含子序列n没有明显的操纵子结构没有明显的操

10、纵子结构n含有一定数量的重复序列（低度、中度和高度重含有一定数量的重复序列（低度、中度和高度重复）复）遗传丰余遗传丰余：较高同源性的：较高同源性的DNADNA重复序列重复序列中心法则：第三节第三节 质粒质粒一、原核生物的质粒一、原核生物的质粒 质粒定义：是一类小型共价闭合环状核质粒定义：是一类小型共价闭合环状核外外DNADNA，能独立于细胞核进行自主复制。，能独立于细胞核进行自主复制。可以通过交换掺入细胞核成为附加体；可以通过交换掺入细胞核成为附加体；可以从寄主细胞中消除。可以从寄主细胞中消除。近年来也发现了线性双链近年来也发现了线性双链DNADNA质粒和质粒和RNARNA质粒质粒二、几种代表

11、性质粒：二、几种代表性质粒：1.F-1.F-因子（因子（fertility factorfertility factor）致育因子致育因子/性因子，性因子，626210106 6DaltonDalton，94.5kb94.5kb，相当于核染色体相当于核染色体DNA2%DNA2%的环状双链的环状双链DNADNA，足，足以编码以编码9494个中等大小多肽，其中个中等大小多肽，其中1/31/3基因（基因（tratra区）区）与接合作用有关。与接合作用有关。存在于肠细菌属、假单胞菌属、嗜血杆菌、存在于肠细菌属、假单胞菌属、嗜血杆菌、奈瑟氏球菌、链球菌等细菌中，决定性别。奈瑟氏球菌、链球菌等细菌中，决定

12、性别。2.2.巨大质粒巨大质粒（megamega质粒）质粒）为近年来在为近年来在RhizobiumRhizobium（根瘤菌属）中发现的根瘤菌属）中发现的一种质粒，分子量为一种质粒，分子量为20030020030010106 6DaltonDalton，比一般质粒大几十倍到比一般质粒大几十倍到几百倍，故称巨大质粒，几百倍，故称巨大质粒，其上有一系列固氮基因。其上有一系列固氮基因。v3.Ti3.Ti（毒性）质粒（毒性）质粒（tumoetumoe inducing plasmid inducing plasmid）长长200kb200kb，是一种大型质粒。，是一种大型质粒。n存在于根癌土壤杆菌（存

13、在于根癌土壤杆菌（Agrobacterium Agrobacterium tumefacienstumefaciens）中。赋予宿主引起许多双子叶）中。赋予宿主引起许多双子叶植物的根癌的特性。当带有植物的根癌的特性。当带有TiTi质粒的细菌侵质粒的细菌侵入植物细胞中后，在其细胞中溶解，把细菌入植物细胞中后，在其细胞中溶解，把细菌的的DNADNA释放至植物细胞中。含有复制子的释放至植物细胞中。含有复制子的TiTi质粒的小片段与植物细胞中的核染色体发生质粒的小片段与植物细胞中的核染色体发生整合，破坏控制细胞分裂的激素调节系统，整合，破坏控制细胞分裂的激素调节系统，从而使它转变成癌细胞。从而使它转变

14、成癌细胞。根癌根癌4.Col4.Col因子（因子（colicinogeniccolicinogenic factor factor）:产大肠杆菌素因子产大肠杆菌素因子:大肠杆菌素是一种由大肠杆菌素是一种由E.coliE.coli的某些菌株所分泌的细菌蛋白，具有通过的某些菌株所分泌的细菌蛋白，具有通过抑制复制、转录、转译或能量代谢等而专一地抑制复制、转录、转译或能量代谢等而专一地杀死不含杀死不含ColCol因子的近缘的其它肠道细菌因子的近缘的其它肠道细菌。n凡带凡带ColCol因子的菌株，由于质粒本身编码一种免疫因子的菌株，由于质粒本身编码一种免疫蛋白，从而对大肠杆菌素有免疫作用，不受其伤害。蛋

15、白，从而对大肠杆菌素有免疫作用，不受其伤害。5.R5.R（抗生素抗性和重金属抗性）因子（抗生素抗性和重金属抗性）因子（resistenceresistence factor factor）nR R因子由相连的两个因子由相连的两个DNADNA片段组成，片段组成，即抗性转移因子（即抗性转移因子（resistence transforresistence transfor factorfactor，RTF RTF）和抗性决定因子（）和抗性决定因子（r-r-determinantdeterminant），），RTFRTF控制质粒控制质粒copycopy数数及复制，抗性决定因子带有抗生素或及复制，抗性决

16、定因子带有抗生素或重金属的抗性基因。重金属的抗性基因。v6.6.降解性（代谢）质粒降解性（代谢）质粒 如假单胞菌属中发现。它们的降解性质如假单胞菌属中发现。它们的降解性质粒可为一系列能降解复杂物质的酶编粒可为一系列能降解复杂物质的酶编码，从而能利用一般细菌所难以分解码，从而能利用一般细菌所难以分解的物质做碳源。的物质做碳源。这些质粒以其所分解的底物命名，例如这些质粒以其所分解的底物命名，例如有分解有分解CAMCAM（樟脑）质粒，（樟脑）质粒，XYLXYL（二（二甲苯）质粒，甲苯）质粒，SALSAL（水杨酸）质粒，（水杨酸）质粒，MDLMDL（扁桃酸）质粒，（扁桃酸）质粒，NAPNAP（奈）（奈

17、）质粒和质粒和TOLTOL（甲苯）质粒等。（甲苯）质粒等。二、转座因子二、转座因子 转座因子：可在转座因子：可在DNADNA链上改变自身位置链上改变自身位置的一段的一段DNADNA序列。也称作跳跃基因序列。也称作跳跃基因（jumping genejumping gene）或可移动基因）或可移动基因（movable genemovable gene）。）。有些有些DNADNA片段不但可在染色体上移动，而且还可片段不但可在染色体上移动，而且还可从一个染色体跳到另一个染色体，甚至还可从一从一个染色体跳到另一个染色体，甚至还可从一个细胞转移到另一个细胞。在这些个细胞转移到另一个细胞。在这些DNADNA

18、顺序的顺序的跳跃过程中，往往导致跳跃过程中，往往导致DNADNA链的断裂或重接，链的断裂或重接，从而产生重组交换或使某些基因启动或关闭，结从而产生重组交换或使某些基因启动或关闭，结果导致突变的发生。果导致突变的发生。第四节第四节 基因突变及修复基因突变及修复一、基因突变（一、基因突变（gene mutationgene mutation）：）：是变异的一种，指生物体内遗传物质的分是变异的一种，指生物体内遗传物质的分子结构或数量突然发生的可遗传的变化。子结构或数量突然发生的可遗传的变化。突变率常在突变率常在1010-8-81010-9-9范围内。范围内。(一一)基因突变的类型基因突变的类型（根据

19、遗传信息的变化）n原序列 5-AUG CCU UCA AGA UGU GGG Met Pro Ser Arg Cys Gly(1)同义突变 5-AUG CCU UCA AGA UGU GGA Met Pro Ser Arg Cys Gly(2)错义突变 5-AUG CCU UCA GGA UGU GGA Met Pro Ser Gly Cys Gly(3)无义突变 5-AUG CCU UCA AGA UGA GGA Met Pro Ser Arg(4)移码突变 5-AUG CCU UCA AGU GUG GG Met Pro Ser Ser Val 常见突变类型常见突变类型n突变株的表型突变株

20、的表型成因成因检出方法检出方法n营养缺陷型营养缺陷型 丧失合成一丧失合成一补充培养基补充培养基n（auxotroph）种或几种生长因子的种或几种生长因子的n 能力不能在基本培养能力不能在基本培养n 基上生长基上生长n抗性突变型抗性突变型 产生了对某产生了对某药物培养基药物培养基（resistant mutant）种化学药物或致死种化学药物或致死n 物理因子的抗性物理因子的抗性n条件致死突变型条件致死突变型 在某种条件下在某种条件下 培养条件改变培养条件改变n（conditional 可正常生长、繁殖并可正常生长、繁殖并nlethal mutant）实现其表型，而在另实现其表型，而在另n 一条件

21、下却无法生长一条件下却无法生长n 繁殖的突变型繁殖的突变型n突变株的表型突变株的表型成因成因 检出方法检出方法n形态突变型形态突变型 因突变而产生的个体因突变而产生的个体 形态形态nMorphologycal 或菌落形态的非选择（常用颜色变或菌落形态的非选择（常用颜色变化）化）n mutant 性变异性变异n抗原突变型抗原突变型 因突变而引起的抗原因突变而引起的抗原 借助于抗原借助于抗原nantigenic 结构发生改变结构发生改变 抗体反应抗体反应 nmutantn产量突变型产量突变型 因突变而获得的在有因突变而获得的在有 测定产量或测定产量或 nhigh producing 用代谢物产量上

22、高于用代谢物产量上高于 其它其它nmutant 原始菌株的突变株原始菌株的突变株（二）突变率（二）突变率突变率突变率:每一细胞在每一世代中发生某一性状每一细胞在每一世代中发生某一性状突变的几率突变的几率。突变率为突变率为1010-8-8是指该细胞在一亿次细胞分裂中，是指该细胞在一亿次细胞分裂中，会发生一次突变。突变率也可以用每一单位群会发生一次突变。突变率也可以用每一单位群体在每一世代中产生突变株（体在每一世代中产生突变株（mutantmutant，即突变，即突变型）的数目来表示。如一个含型）的数目来表示。如一个含10108 8个细胞的群个细胞的群体，当其分裂为体，当其分裂为2 210108

23、8个细胞时，即可产生一个细胞时，即可产生一个突变表型。个突变表型。n突变率突变率=突变细胞数突变细胞数/分裂前群体细胞数分裂前群体细胞数一些菌种某些性状的自发突变率菌名菌名突变性状突变性状突变率突变率Escherichia coliE.coliE.coliE.coliStaphylococcus aureusS.aureusSalmonella typhiBacillus megaterium抗抗T1噬菌体噬菌体抗抗T3噬菌体噬菌体不发酵乳糖不发酵乳糖抗紫外线抗紫外线抗青霉素抗青霉素抗链霉素抗链霉素抗抗25ug/L链霉素链霉素抗异烟肼抗异烟肼310-8110-7110-10110-5110-7

24、110-9510-6510-5.诱变机制诱变机制n诱变剂诱变剂（mutagenmutagen）：凡能提高突变率的：凡能提高突变率的任何理化因子，诱变剂的种类很多，作任何理化因子，诱变剂的种类很多，作用方式多样。即使是同一种诱变剂，也用方式多样。即使是同一种诱变剂，也常有不同的作用方式。常有不同的作用方式。直接引起置换的诱变剂直接引起置换的诱变剂n一类可直接与核酸的碱基发生化学反应一类可直接与核酸的碱基发生化学反应的诱变剂，例如的诱变剂，例如亚硝酸、羟胺和各种烷亚硝酸、羟胺和各种烷化剂化剂（硫酸二乙酯，甲基磺酸乙酯，（硫酸二乙酯，甲基磺酸乙酯，N-N-甲基甲基-N-N硝基硝基-N-N-亚硝基胍，

25、亚硝基胍，N-N-甲基甲基-N-N-亚硝基脲，乙烯亚胺，环氧乙酸，氮芥亚硝基脲，乙烯亚胺，环氧乙酸，氮芥等）。等）。间接引起置换的诱变剂间接引起置换的诱变剂n引起这类变异的诱变剂都是一些引起这类变异的诱变剂都是一些碱基类碱基类似物似物，如，如5-5-溴尿嘧啶（溴尿嘧啶（5-BU5-BU）、）、5-5-氨基氨基尿嘧啶（尿嘧啶（5-AU5-AU）、）、8-8-氮鸟嘌呤（氮鸟嘌呤（8-NG8-NG）、）、2-2-氨基嘌呤（氨基嘌呤（2-AP2-AP）和）和6-6-氯嘌呤（氯嘌呤（6-CP6-CP）等。它们的作用是通过细胞的代谢活动等。它们的作用是通过细胞的代谢活动掺入到掺入到DNADNA分子中后而引

26、起碱基置换，分子中后而引起碱基置换，故是间接的。故是间接的。三、三、基因重组基因重组n基因重组基因重组（gene recombinationgene recombination）：）：凡把两个凡把两个不同性状个体内的遗传基因转移到一起，经不同性状个体内的遗传基因转移到一起，经过遗传分子间的重新组合，形成新遗传型个过遗传分子间的重新组合，形成新遗传型个体的方式。体的方式。n重组可使生物体在未发生突变的情况下，也重组可使生物体在未发生突变的情况下，也能产生新遗传型的个体。能产生新遗传型的个体。n真核微生物中的有性杂交、准性杂交真核微生物中的有性杂交、准性杂交（parasexualparasexua

27、l hybridization hybridization）等原核生物中的）等原核生物中的转化、转导、接合和原生质体融合等都是基转化、转导、接合和原生质体融合等都是基因重组在细胞水平上的反映。因重组在细胞水平上的反映。四、四、微生物育种微生物育种从生产中选育从生产中选育：在生产过程中，微生物以一定频率发生自发在生产过程中，微生物以一定频率发生自发突变。为选育优良的生产菌种创造了机会。突变。为选育优良的生产菌种创造了机会。定向培育优良品种定向培育优良品种：一般指用某一特定因素长期处理某微生物一般指用某一特定因素长期处理某微生物的群体（的群体（culture populationculture p

28、opulation），同时不断地对），同时不断地对它们进行移种传代，以达到积累并选择相应的它们进行移种传代，以达到积累并选择相应的自发突变株的目的。自发突变株的目的。诱变育种诱变育种n诱变育种诱变育种：利用物理或化学诱变剂处理均匀而：利用物理或化学诱变剂处理均匀而分散的微生物细胞群，促进其突变率显著提高，分散的微生物细胞群，促进其突变率显著提高，然后采用简便、快速和高效的筛选方法，从中然后采用简便、快速和高效的筛选方法，从中挑选少数符合育种目的的突变株，以供生产实挑选少数符合育种目的的突变株，以供生产实践或科学研究之用。践或科学研究之用。n诱变育种具有极其重要的实践意义诱变育种具有极其重要的实

29、践意义。当前发酵。当前发酵工业和其他微生物生产部门所使用的高产菌株，工业和其他微生物生产部门所使用的高产菌株，几乎毫无例外地都是通过诱变育种而明显提高几乎毫无例外地都是通过诱变育种而明显提高其生产性能的。其生产性能的。选择简便有效的诱变剂：选择简便有效的诱变剂：物理诱变剂：紫外线、激光；物理诱变剂：紫外线、激光；X X射线、射线、射线和快中子等。射线和快中子等。化学诱变剂：主要有烷化剂、碱基类似物和丫啶类化合物。化学诱变剂：主要有烷化剂、碱基类似物和丫啶类化合物。拟辐射物质：有些烷化剂例如氮芥、硫芥和环氧乙烷等除了能拟辐射物质：有些烷化剂例如氮芥、硫芥和环氧乙烷等除了能诱发各种点突变外，还能诱

30、发一般只有辐射才能诱发的染色体诱发各种点突变外，还能诱发一般只有辐射才能诱发的染色体畸变，所以它们也被称为拟辐射物质。畸变，所以它们也被称为拟辐射物质。由于一切生物的遗传物质基础都是核酸尤其是由于一切生物的遗传物质基础都是核酸尤其是DNADNA，所以，所以任何能改变核酸结构的因素都可引起核酸生物学功能的改变。任何能改变核酸结构的因素都可引起核酸生物学功能的改变。同样，凡能引起核酸的其他功能改变的因素，一般也能引起突同样，凡能引起核酸的其他功能改变的因素，一般也能引起突变。变。五五 菌种的衰退、复壮和保藏菌种的衰退、复壮和保藏衰退（衰退（degenerationdegeneration）：）：在

31、微生物的生长过程中，在微生物的生长过程中，由于变异的存在，使原有的优良性状发生负变，即菌由于变异的存在，使原有的优良性状发生负变，即菌种的衰退。种的衰退。复壮复壮(rejuvenation)(rejuvenation)：狭义的复壮狭义的复壮是指在菌种已发是指在菌种已发生衰退的情况下，通过纯种分离和生产性能测定等方生衰退的情况下，通过纯种分离和生产性能测定等方法，从衰退的群体中找出未衰退的个体，以达到恢复法，从衰退的群体中找出未衰退的个体，以达到恢复该菌原有典型性状的措施；该菌原有典型性状的措施；广义的复壮广义的复壮是指在菌种的是指在菌种的生产性能未衰退前就有意识的经常、进行纯种的分离生产性能未

32、衰退前就有意识的经常、进行纯种的分离和生产性能测定工作，以期菌种的生产性能逐步提高。和生产性能测定工作，以期菌种的生产性能逐步提高。实际上是利用自发突变（正变）不断地从生产中选种。实际上是利用自发突变（正变）不断地从生产中选种。防止菌种衰退的方法防止菌种衰退的方法（1 1）控制传代的次数（一般在）控制传代的次数（一般在DNADNA的复制的复制过程中，碱基的错配率是过程中，碱基的错配率是5x105x10-4-4，自发突，自发突变的频率为变的频率为1010-8-81010-9-9，采用良好的菌种保，采用良好的菌种保藏方法，可以减少移种和传代的次数）藏方法，可以减少移种和传代的次数）（2 2）创造良

33、好的培养条件）创造良好的培养条件（3 3）利用不同类型的细胞进行接种传代：）利用不同类型的细胞进行接种传代：对丝状微生物而言，通常采用稳定的单核对丝状微生物而言，通常采用稳定的单核孢子进行接种。孢子进行接种。（4 4）采用有效的菌种保藏方法）采用有效的菌种保藏方法菌种的复壮措施菌种的复壮措施（1 1）纯种分离）纯种分离 菌落纯的分离方法菌落纯的分离方法（平板表面涂布法，平板划（平板表面涂布法，平板划线分离法，琼脂培养基浇注法）线分离法，琼脂培养基浇注法）细胞纯的分离方法细胞纯的分离方法（分离小室进行单细胞分离，（分离小室进行单细胞分离，显微操纵器进行单细胞分离，菌丝尖端切割法显微操纵器进行单细

34、胞分离，菌丝尖端切割法进行单细胞分离）进行单细胞分离）（2 2）通过宿主体内生长进行复壮）通过宿主体内生长进行复壮（如（如Bacillus Bacillus thuringiensisthuringiensis的复壮）的复壮）（3 3）淘汰已衰退的个体）淘汰已衰退的个体（采用比较激烈的理化（采用比较激烈的理化条件进行处理，以杀死生命力较差的已衰退个条件进行处理，以杀死生命力较差的已衰退个体）体）、菌种的保藏、菌种的保藏v菌种保藏机构的任务：广泛收集实验室和生产菌种保藏机构的任务：广泛收集实验室和生产菌种、菌株（包括病毒株以及动、植物细胞株菌种、菌株（包括病毒株以及动、植物细胞株和质粒等）的基础

35、上，使之达到不死、不衰、和质粒等）的基础上，使之达到不死、不衰、不乱以及便于研究、交换和使用的目的。不乱以及便于研究、交换和使用的目的。v常用的菌种保藏机构：常用的菌种保藏机构：中国微生物菌种保藏委员会中国微生物菌种保藏委员会(CCCCM)(CCCCM)美国美国的典型菌种保藏中心的典型菌种保藏中心(ATCC)(ATCC)菌种保藏的原理菌种保藏的原理挑选典型菌种的优良纯种挑选典型菌种的优良纯种 一般采用微生物的休眠体（如孢子、芽孢等）一般采用微生物的休眠体（如孢子、芽孢等）创造适于微生物长时期休眠的环境条件创造适于微生物长时期休眠的环境条件（如干燥、低温、缺氧、避光、缺乏营养以及（如干燥、低温、

36、缺氧、避光、缺乏营养以及添加保护剂或酸碱中和剂等）添加保护剂或酸碱中和剂等）菌种保藏方法菌种保藏方法:定期移植法定期移植法液体石蜡法液体石蜡法沙土管法沙土管法真空冷冻干燥法真空冷冻干燥法-80-80冰箱冻结法冰箱冻结法液氮超低温冻结法液氮超低温冻结法（一（一 ）定期移植法）定期移植法(传代培养保藏法传代培养保藏法)是指将菌种接种于适宜的培养基中，最适条件下培是指将菌种接种于适宜的培养基中，最适条件下培养，待生长充分后，于养，待生长充分后，于4 466进行保存并间隔一定进行保存并间隔一定时间进行移植培养的菌种保藏方法。时间进行移植培养的菌种保藏方法。(包括斜面培养、包括斜面培养、穿刺培养、液体培

37、养等穿刺培养、液体培养等)。根据要求每。根据要求每3 36 6个月移植个月移植一次。某些菌种，如芽裂酵母，阿舒假囊酵母，棉一次。某些菌种，如芽裂酵母，阿舒假囊酵母，棉病囊霉等，须病囊霉等，须1 13 3个月移植一次。个月移植一次。(保藏湿度用相对湿度表示，通常为保藏湿度用相对湿度表示，通常为50%50%70%70%。斜面菌种应保藏相继三代培养物以便对照，防止因意斜面菌种应保藏相继三代培养物以便对照，防止因意外和污染造成损失。外和污染造成损失。)（二）液体石蜡保藏法（二）液体石蜡保藏法(矿物油保藏法)是指将菌种接种在适宜的斜面培养基上，是指将菌种接种在适宜的斜面培养基上，最适条件下培养至菌种长出

38、健壮菌落后最适条件下培养至菌种长出健壮菌落后注入灭菌的液体石蜡，使其覆盖整个斜注入灭菌的液体石蜡，使其覆盖整个斜面，再直立放置于低温（面，再直立放置于低温（4 466）干燥）干燥处进行保存处进行保存(120(120年年)。恢复培养时，挑取少量菌体转接在适宜恢复培养时，挑取少量菌体转接在适宜的新鲜培养基上，生长繁殖后，再重新的新鲜培养基上，生长繁殖后，再重新转接一次。转接一次。（三）（三）沙土管保藏法沙土管保藏法 是载体保藏法的一种。将培养好的微生物是载体保藏法的一种。将培养好的微生物细胞或孢子用无菌水制成悬浮液细胞或孢子用无菌水制成悬浮液,注入灭注入灭菌的沙土管中混合均匀，或直接将成熟菌的沙土

39、管中混合均匀，或直接将成熟孢子刮下接种于灭菌的沙土管中，使微孢子刮下接种于灭菌的沙土管中，使微生物细胞或孢子吸附在沙土载体上，将生物细胞或孢子吸附在沙土载体上，将管中水分抽干后熔封管口或置干燥器中管中水分抽干后熔封管口或置干燥器中于于4 466或室温进行保存。或室温进行保存。恢复：恢复：取部分沙土粒于适宜的斜面培养基上取部分沙土粒于适宜的斜面培养基上 （四）、冷冻干燥（四）、冷冻干燥n 将微生物冷冻，在减压下利用升华作用将微生物冷冻，在减压下利用升华作用除去水分，使细胞的生理活动趋于停止，除去水分，使细胞的生理活动趋于停止，从而长期维持存活状态。从而长期维持存活状态。五、五、-80-80低温冷

40、冻保藏低温冷冻保藏n将菌种保藏在将菌种保藏在-80-80冰箱中以减缓细冰箱中以减缓细胞的生理活动进行冷冻的一种保藏方法。胞的生理活动进行冷冻的一种保藏方法。（五）、液氮超低温保藏（五）、液氮超低温保藏n液氮超低温保藏技术是将菌种保藏液氮超低温保藏技术是将菌种保藏在在-196-196的液态氮，或在的液态氮，或在-150-150的氮气中的氮气中的长期保藏方法，它的原理是利用微生的长期保藏方法，它的原理是利用微生物在物在-130-130以下新陈代谢趋于停止而有以下新陈代谢趋于停止而有效地保藏微生物。效地保藏微生物。几种常用菌种保藏方法的比较几种常用菌种保藏方法的比较方法名称方法名称主要措施主要措施适

41、宜菌种适宜菌种保藏期保藏期评评价价冰箱保藏法（斜面）冰箱保藏法（斜面）冰箱保藏法（半固体）冰箱保藏法（半固体）石蜡油封藏法石蜡油封藏法*沙土保藏法沙土保藏法冷冻干燥法冷冻干燥法低温低温低温低温低温、缺氧低温、缺氧干燥、无营养干燥、无营养干燥、无氧、低干燥、无氧、低温、有保护剂温、有保护剂各大类各大类细菌、酵母菌细菌、酵母菌各大类各大类*产孢子微生物产孢子微生物各大类各大类3636月月612612月月1212年年110110年年515515年年以上以上简便简便简便简便简便简便简便简便有效有效简便、简便、有效有效第五节第五节 微生物基因工程微生物基因工程基因工程基因工程：用人为的方法将所需要的：用

42、人为的方法将所需要的某一供体生物的遗传物质某一供体生物的遗传物质-DNA-DNA大大分子提取出来，在离体的条件下用分子提取出来，在离体的条件下用适当的工具酶进行切割后，把它与适当的工具酶进行切割后，把它与作为载体的作为载体的DNADNA分子连接起来，然分子连接起来，然后与载体一起导入某一更易生长、后与载体一起导入某一更易生长、繁殖的受体细胞中使供体繁殖的受体细胞中使供体DNADNA进行进行正常的复制和表达，才，从而获得正常的复制和表达，才，从而获得新物种的一种崭新的育种技术。新物种的一种崭新的育种技术。一、基因工程的基本操作一、基因工程的基本操作n基因工程操作一般分为以下四个步骤：基因工程操作

43、一般分为以下四个步骤：目的基因的取得、载体的选择、目的基因目的基因的取得、载体的选择、目的基因与载体与载体DNADNA的体外重组、重组载体引入的体外重组、重组载体引入受体细胞。受体细胞。获得目的基因的主要方法获得目的基因的主要方法n从供体细胞的从供体细胞的DNADNA中分离（酶切法、中分离（酶切法、PCRPCR扩增）扩增）n通过反转录酶的作用由通过反转录酶的作用由mRNAmRNA合成合成cDNAcDNA（拷（拷贝数少的目的基因的获得）贝数少的目的基因的获得）n由化学方法合成特定功能的基因（磷酸二酯法、由化学方法合成特定功能的基因（磷酸二酯法、磷酸三酯法、固相亚磷酸三酯法，合成的长度磷酸三酯法、

44、固相亚磷酸三酯法，合成的长度150150200bp200bp，作用：合成基因的元件、合成，作用：合成基因的元件、合成引物、合成探针、用于基因的定点诱变、作为引物、合成探针、用于基因的定点诱变、作为重组重组DNADNA连接的构件连接的构件）载体的选择载体的选择v载体必须具备的几个条件：载体必须具备的几个条件：必须是一个复制子必须是一个复制子 在受体细胞中有较高的复制率在受体细胞中有较高的复制率 最好只有一个内切酶切口最好只有一个内切酶切口 必须具有选择性遗传标记必须具有选择性遗传标记v目前常用载体：目前常用载体：质粒载体质粒载体 噬菌体载体噬菌体载体目的基因与载体目的基因与载体DNADNA的体外

45、连接的体外连接v核酸内切酶与核酸内切酶与DNADNA分子的体外切割：分子的体外切割：在基因工程中，必须使用特定的内切酶（一般为在基因工程中，必须使用特定的内切酶（一般为型型内切酶）消化目的基因与载体内切酶）消化目的基因与载体DNADNA，使它们产生互补，使它们产生互补的粘性末端或平末端，如的粘性末端或平末端，如EcoREcoR消化消化DNA DNA 产生的粘性产生的粘性末端为：末端为：G3 5AATTCG3 5AATTC CTTAA5 3G CTTAA5 3G 目的基因与载体目的基因与载体DNADNA用同一种内切酶消化，即产生相用同一种内切酶消化，即产生相同的粘性末端，在低温（同的粘性末端，在

46、低温（5-65-6）下进行退火时，互）下进行退火时，互补的粘性末端配对重新形成带缺口的双链。补的粘性末端配对重新形成带缺口的双链。v DNADNA连接酶进行目的基因与载体连接酶进行目的基因与载体DNADNA的体外的体外连接连接 粘性末端连接（来源于粘性末端连接（来源于E.coliE.coli的的DNADNA连接酶）；平末端连接酶）；平末端连接（连接（T4 DNAT4 DNA连接酶）连接酶）重组载体引入受体细胞重组载体引入受体细胞v受体细胞的种类：受体细胞的种类：微生物细胞（微生物细胞（E.coli B.subtilis S.cerevisiaeE.coli B.subtilis S.cerev

47、isiae）植物细胞植物细胞 动物细胞动物细胞v重组载体引入受体细胞的方法：重组载体引入受体细胞的方法：转化转化 转染转染 具体的方法参见有关实验指导具体的方法参见有关实验指导复习与思考 1.什么是微生物的遗传和变异？它们的物质基础是什什么是微生物的遗传和变异？它们的物质基础是什 么？如何证么？如何证明？明？2.DNA是如何复制的？是如何复制的？3.微生物有几种微生物有几种RNA？它们各有什么作用？它们各有什么作用？4.微生物变异的实质是什么？微生物基因突变的类型有哪几种？微生物变异的实质是什么？微生物基因突变的类型有哪几种？5.什么叫杂交、转化和转导？各有什么实践意义？什么叫杂交、转化和转导？各有什么实践意义？6.自然界微生物菌种的筛选程序是什么？自然界微生物菌种的筛选程序是什么？7.诱变育种的关键步骤有哪些？诱变育种的关键步骤有哪些？8.什么是营养缺陷型菌株？它的研究意义是什么？什么是营养缺陷型菌株？它的研究意义是什么？9.什么叫什么叫“工程菌工程菌”？如何获得？如何获得？10.微生物菌种的保藏方法有哪些？举例说明。微生物菌种的保藏方法有哪些？举例说明。Thank you!