第5章-发酵菌种的制备课件

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1、发酵工程发酵工程http:/211.84.144.22/jing/C76/zcr-1.htm南阳师范学院南阳师范学院 生命科学与技术学院生命科学与技术学院发酵工程发酵工程第一章第一章 发酵工程总论发酵工程总论第二章第二章 发酵设备发酵设备第三章第三章 发酵工业原料及其处理发酵工业原料及其处理第四章第四章 发酵工业灭菌发酵工业灭菌第五章第五章 发酵菌种的制备发酵菌种的制备第六章第六章 发酵工业放大发酵工业放大第第七七章章 微生物发酵机制微生物发酵机制第八章第八章 发酵动力学发酵动力学第第九九章章 发酵过程工艺控制发酵过程工艺控制第第十十章章 发酵染菌及防治发酵染菌及防治第第十一十一章章 发酵工业

2、废物、废水处理和资源化技术发酵工业废物、废水处理和资源化技术第十二章第十二章 展望展望1 1 发酵工业微生物菌种的选育发酵工业微生物菌种的选育2 2 工业微生物种子的扩大培养工业微生物种子的扩大培养3 3 种子培养基及其制备种子培养基及其制备第五章第五章 发酵菌种的制备发酵菌种的制备http:/211.84.144.22/jing/C76/zcr-1.htm1.1 工业微生物的特点工业微生物的特点1.2 发酵工业对菌种的要求发酵工业对菌种的要求1.3 工业生产常用的微生物菌种工业生产常用的微生物菌种1.4 工业微生物菌种的分离工业微生物菌种的分离1.5 发酵高产菌种的选育发酵高产菌种的选育1.

3、6 菌种的退化与保藏菌种的退化与保藏1 发酵工业微生物菌种的选育发酵工业微生物菌种的选育第五章第五章 发酵菌种的制备发酵菌种的制备1.1 1.1 工业微生物的特点工业微生物的特点1 发酵工业微生物菌种的选育发酵工业微生物菌种的选育 一个现代化的发酵工业必须具有一个现代化的发酵工业必须具有优良的菌种优良的菌种、合适的工艺和先进的设备合适的工艺和先进的设备、严格的检测与控制严格的检测与控制，其，其中中菌种菌种是主体是主体,其他则是为了充分发挥菌种的优良其他则是为了充分发挥菌种的优良性能而考虑和设计的。性能而考虑和设计的。能用于发酵生产的微生物即为能用于发酵生产的微生物即为工业微生物，它工业微生物，

4、它们具有个体小、种类多、繁殖快、分布广、代谢能们具有个体小、种类多、繁殖快、分布广、代谢能力强、易变异改造力强、易变异改造等特点。等特点。1.2 1.2 发酵工业对菌种的要求发酵工业对菌种的要求1)能在能在廉价原料制成的培养基上廉价原料制成的培养基上迅速生长，并生成所需要的代谢产物，且迅速生长，并生成所需要的代谢产物，且产量高；产量高；2）培养条件）培养条件易于控制易于控制；3）生长速度快，）生长速度快，发酵周期短发酵周期短；4）满足代谢控制的要求；）满足代谢控制的要求；5）抗噬菌体和杂菌的能力强；）抗噬菌体和杂菌的能力强；6）遗传性状稳定，菌种不易变异退化；）遗传性状稳定，菌种不易变异退化；

5、7）在发酵过程中产生的气泡要少，这对提高装料系数、提高单罐产量、）在发酵过程中产生的气泡要少，这对提高装料系数、提高单罐产量、降低成本有重要意义；降低成本有重要意义；8）对需要添加的前体物质有耐受能力，并且不能将这些前体作为一般碳）对需要添加的前体物质有耐受能力，并且不能将这些前体作为一般碳源利用；源利用；9）不是病原菌，同时在系统发育上与病原菌无关，不产生任何有害的生）不是病原菌，同时在系统发育上与病原菌无关，不产生任何有害的生物活性物质和毒素，以保证安全。物活性物质和毒素，以保证安全。地球上的微生物资源非常丰富，地球上的微生物资源非常丰富，目前已发现的仅占其总数的目前已发现的仅占其总数的1

6、%5%，而在工业生产中被利用的仅有而在工业生产中被利用的仅有数百种数百种，分属于分属于细菌、酵母菌、霉菌、放线菌、细菌、酵母菌、霉菌、放线菌、担子菌、藻类担子菌、藻类。1.3 1.3 工业生产常用的微生物菌种工业生产常用的微生物菌种放线菌（链霉素四环素；红霉素等）真菌（青霉素、头孢等）一些产芽孢的细菌植物或动物来源一、抗生素生产有关的微生物一、抗生素生产有关的微生物抗生素是次级代谢产物，需要生物体进行复杂的代谢，抗生素是次级代谢产物，需要生物体进行复杂的代谢，目前发现的生物来源如下：目前发现的生物来源如下：已工业化产品生产菌的介绍已工业化产品生产菌的介绍1.3 1.3 工业生产常用的微生物菌种

7、工业生产常用的微生物菌种二、氨基酸生产有关的微生物二、氨基酸生产有关的微生物代谢控制发酵代谢控制发酵：用用人工诱变的方法人工诱变的方法，有意识地改变微生，有意识地改变微生物的代谢途径，最大限度地积累产物，这种发酵形象地物的代谢途径，最大限度地积累产物，这种发酵形象地称为代谢控制发酵，最早在氨基酸发酵中得到成功应用。称为代谢控制发酵，最早在氨基酸发酵中得到成功应用。2020世纪世纪50-6050-60年代以氨基酸发酵为代表的年代以氨基酸发酵为代表的代谢控制发代谢控制发酵酵，是发酵工业发展历史上的一个转折点：，是发酵工业发展历史上的一个转折点：1.3 1.3 工业生产常用的微生物菌种工业生产常用的

8、微生物菌种已工业化产品生产菌的介绍已工业化产品生产菌的介绍 HD:高丝氨酸脱氢酶高丝氨酸脱氢酶黄色短杆菌中赖氨酸、苏氨酸、蛋氨酸黄色短杆菌中赖氨酸、苏氨酸、蛋氨酸和异亮氨酸和异亮氨酸的合成调节机制的合成调节机制 HT:高丝氨酸转乙酰酶高丝氨酸转乙酰酶AK:天冬氨酸激酶天冬氨酸激酶1.3 1.3 工业生产常用的微生物菌种工业生产常用的微生物菌种二、氨基酸生产有关的微生物二、氨基酸生产有关的微生物氨基酸生产菌的要求氨基酸生产菌的要求：代谢途径比较清楚，简单代谢途径比较清楚，简单谷氨酸发酵的菌种谷氨酸发酵的菌种：其他氨基酸生产菌：其他氨基酸生产菌：棒杆菌属，短杆菌属、节杆菌属或小棒杆菌属，短杆菌属、

9、节杆菌属或小杆菌属的棒型细菌杆菌属的棒型细菌常规菌种一般也是以谷氨酸生产菌常规菌种一般也是以谷氨酸生产菌选育而成；工程菌，大肠杆菌，枯选育而成；工程菌，大肠杆菌，枯草芽孢杆菌草芽孢杆菌1.3 1.3 工业生产常用的微生物菌种工业生产常用的微生物菌种二、氨基酸生产有关的微生物二、氨基酸生产有关的微生物三、食品酶制剂生产有关的微生物三、食品酶制剂生产有关的微生物 开发一个新酶，都要经过一系列研究的毒理试验。开发一个新酶，都要经过一系列研究的毒理试验。关于食品用酶，美国需要得到关于食品用酶，美国需要得到FDAFDA的批准。目前已同意的批准。目前已同意使用的仅仅少数微生物能用于生产食品用酶。使用的仅仅

10、少数微生物能用于生产食品用酶。淀粉酶：黑曲霉、米曲霉、米根酶、枯草牙孢杆淀粉酶：黑曲霉、米曲霉、米根酶、枯草牙孢杆菌和地衣牙孢杆菌菌和地衣牙孢杆菌1.3 1.3 工业生产常用的微生物菌种工业生产常用的微生物菌种l已工业化产品生产菌的介绍已工业化产品生产菌的介绍三、常用的基因表达系统(一一)原核生物原核生物：大肠杆菌大肠杆菌(1977(1977年年Boyer)Boyer)、枯草牙胞杆菌、枯草牙胞杆菌 沙门氏菌沙门氏菌q 生长迅速、蛋白产量高生长迅速、蛋白产量高;q 表达蛋白的纯化、分离及分析快速；表达蛋白的纯化、分离及分析快速；q 外源基因的导入相对容易；外源基因的导入相对容易；q 已建立了整套

11、表达理论及技术。已建立了整套表达理论及技术。l已工业化产品生产菌的介绍已工业化产品生产菌的介绍1.3 1.3 工业生产常用的微生物菌种工业生产常用的微生物菌种(二二)真核细胞表达系统真核细胞表达系统 酵母酵母(既是微生物又是真核细胞既是微生物又是真核细胞)l 生长迅速，营养要求不高，易培养；生长迅速，营养要求不高，易培养；l 安全性好；安全性好；l 比哺乳动物细胞操作简单；比哺乳动物细胞操作简单；l 具有一定的修饰蛋白的能力。具有一定的修饰蛋白的能力。1.3 1.3 工业生产常用的微生物菌种工业生产常用的微生物菌种l已工业化产品生产菌的介绍已工业化产品生产菌的介绍 中国仓鼠卵巢细胞（中国仓鼠卵

12、巢细胞（CHOCHO细胞）表达系统细胞）表达系统q 具有准确的转录后修饰功能；具有准确的转录后修饰功能；q 具有产物胞外分泌功能，便于下游产物分离纯化；具有产物胞外分泌功能，便于下游产物分离纯化；q 具有重组基因的高效扩增和表达能力；具有重组基因的高效扩增和表达能力；q 具有贴壁生长特性，也可进行悬浮生长；具有贴壁生长特性，也可进行悬浮生长；q CHO很少分泌自身的内源蛋白。很少分泌自身的内源蛋白。1.3 1.3 工业生产常用的微生物菌种工业生产常用的微生物菌种l已工业化产品生产菌的介绍已工业化产品生产菌的介绍微生物（包括动、植物细胞）几乎可以生产微生物（包括动、植物细胞）几乎可以生产我们所需

13、的一切产品，但是涉及到工业化生我们所需的一切产品，但是涉及到工业化生产对于某一种特定的产品，只有特定的微生产对于某一种特定的产品，只有特定的微生物才具有大量表达的潜力。物才具有大量表达的潜力。问题：生产抗生素的微生物能不能用于生产氨基酸？生产抗生素的微生物能不能用于生产氨基酸？礼来礼来(Eli lilly(Eli lilly),),花了花了1010年的时间从年的时间从4040万株微万株微生物中，发现了三种有潜力的新抗生素生物中，发现了三种有潜力的新抗生素。例：1.3 1.3 工业生产常用的微生物菌种工业生产常用的微生物菌种l已工业化产品生产菌的介绍已工业化产品生产菌的介绍一、菌种分离的一般过程

14、一、菌种分离的一般过程样品采集样品采集预处理预处理 增殖增殖培养培养 纯培养纯培养 菌种的鉴定菌种的鉴定问题：问题：如何使样品中所含微生物的可能性大如何使样品中所含微生物的可能性大 如何在后续的操作中使这种可能性实现如何在后续的操作中使这种可能性实现目的目的：高效地获取一株高产目的产物的微生物高效地获取一株高产目的产物的微生物1.4 1.4 工业微生物菌种的分离工业微生物菌种的分离 生产性能测定生产性能测定复合酶系复合酶系复合菌系复合菌系二、采样时要注意的问题二、采样时要注意的问题l 气候、水分、空气气候、水分、空气l 来源要广来源要广l 结合产品的特点结合产品的特点l 标签：地点、时间、气候

15、等标签：地点、时间、气候等1.4 1.4 工业微生物菌种的分离工业微生物菌种的分离富集的三种方案：l 定向培养定向培养:采用特定的有利于目的微生物富集的采用特定的有利于目的微生物富集的 条件，进行培养。条件，进行培养。三、目的微生物富集的一些基本方法三、目的微生物富集的一些基本方法富集的目的：让目的微生物在种群中占优势，使筛选变让目的微生物在种群中占优势，使筛选变得可能。得可能。l 当不可能采用定向培养时，则可设计在一个分当不可能采用定向培养时，则可设计在一个分 类学中考虑，类学中考虑，l 不能提供任何有助于筛选产生菌的信息，这不能提供任何有助于筛选产生菌的信息，这 时只能通过随机分离的办法时

16、只能通过随机分离的办法1.4 1.4 工业微生物菌种的分离工业微生物菌种的分离定向培养的方法定向培养的方法物理方法：加热、膜过滤等，物理方法：加热、膜过滤等，但主要是通过培养的方法但主要是通过培养的方法1.4 1.4 工业微生物菌种的分离工业微生物菌种的分离三、目的微生物富集的一些基本方法三、目的微生物富集的一些基本方法http:/211.84.144.22/jing/C76/zcr-1.htm定向培养的富集方法定向培养的富集方法1 1、底物、底物2 2、pHpH条件条件3 3、培养时间、培养时间4 4、培养温度、培养温度等一切能提高目的微生物相对生长速度等一切能提高目的微生物相对生长速度的手

17、段，培养（固体、液体；分批、连的手段，培养（固体、液体；分批、连续）后使目的微生物在种群中占优势。续）后使目的微生物在种群中占优势。三、目的微生物富集的一些基本方法三、目的微生物富集的一些基本方法四、菌落的选出四、菌落的选出q 从产物角度出发从产物角度出发在培养时以产物的形成有目的的设计培养基在培养时以产物的形成有目的的设计培养基利用简单、快速的鉴定方法，如抗生素利用简单、快速的鉴定方法，如抗生素q 从形态的角度从形态的角度 菌落的外观形态，是微生物的一个重要表征。如多糖菌落的外观形态，是微生物的一个重要表征。如多糖产生菌在适当的培养基上生长，从具有粘液性的菌落外观产生菌在适当的培养基上生长，

18、从具有粘液性的菌落外观上就可以初步识别。上就可以初步识别。1.4 1.4 工业微生物菌种的分离工业微生物菌种的分离实例：碱性纤维素酶产生菌的筛选实例：碱性纤维素酶产生菌的筛选采样（造纸厂）采样（造纸厂）80 30 min处理处理文献文献:产生菌为中性牙孢杆菌，产生菌为中性牙孢杆菌，嗜碱芽孢杆菌嗜碱芽孢杆菌、放线菌及霉菌、放线菌及霉菌0.0075%曲利本蓝曲利本蓝1%CMC（羧甲基纤维素），（羧甲基纤维素），pH10.5培养培养34 d，选择有，选择有凹陷圈凹陷圈的菌落的菌落从从285个土样中获得个土样中获得62株株26株为组成型株为组成型36株为诱导型株为诱导型1.4 1.4 工业微生物菌种的

19、分离工业微生物菌种的分离实例：醛肟水解酶的筛选实例：醛肟水解酶的筛选 -Journal of biotechnology 94(2002),65-72培养基中含培养基中含0.05%of Z-PAOx 每隔每隔23 d移去一半培养物，补充新鲜培养基移去一半培养物，补充新鲜培养基不断分析样品，不断分析样品，2-3个月后个月后Z-PAOx降低后，稀释分离菌落降低后，稀释分离菌落1.4 1.4 工业微生物菌种的分离工业微生物菌种的分离五、目的微生物富集方法的研究进展五、目的微生物富集方法的研究进展q 分子生物学的实验手段，在微生物鉴别及特定目标产物分子生物学的实验手段，在微生物鉴别及特定目标产物 的筛

20、选方面发挥了着越来越重要的作用。如的筛选方面发挥了着越来越重要的作用。如:16SRNA同同 源性分析，基因序列分析及源性分析，基因序列分析及DNA/DNA杂交技术等杂交技术等q 目前土壤中能够培养的微生物不到总数的目前土壤中能够培养的微生物不到总数的1%，微生物的微生物的 多样性及资源的开发多样性及资源的开发仍然是今后若干年的研究重点。仍然是今后若干年的研究重点。陈文新（科学院院士）陈文新（科学院院士），2002q In contrast to this traditional approach,modern molecular biology techniques allow for DNA

21、 library expression screening,which also enables access to enzymes of nonculturable organisms.By this strategy,for instance,the company Diversa(San Diego,CA,USA)identised 120 unique esterases/lipases from only 16%of the total DNA obtained from an alkaline soil sample.FEMS Microbiology Reviews 26(200

22、2)73811.4 1.4 工业微生物菌种的分离工业微生物菌种的分离目的l 提高生产能力提高生产能力l 提高产品质量提高产品质量l 开发新产品开发新产品l 解决生产实际问题解决生产实际问题l 防止菌种退化防止菌种退化1.5 1.5 发酵高产菌种的选育发酵高产菌种的选育方法基因突变：自然选育、诱变育种自然选育、诱变育种基因重组：杂交、原生质体融合、基因工程杂交、原生质体融合、基因工程基因的直接进化：点突变、易位点突变、易位PCR、同序法、同序法DNA Shuffling等等1.5 1.5 发酵高产菌种的选育发酵高产菌种的选育自然状态下，碱基对发生自然突变的机率为自然状态下，碱基对发生自然突变的机

23、率为10-810-9。自然突变有两种情况自然突变有两种情况：一种是我们生产上所不希望看到的，表现为菌株的衰一种是我们生产上所不希望看到的，表现为菌株的衰退和生产质量的下降，这种突变成为负突变退和生产质量的下降，这种突变成为负突变。另一种是我们生产上希望看到的，对生产有利，这种突另一种是我们生产上希望看到的，对生产有利，这种突变成为正突变。变成为正突变。一、自然选育一、自然选育1.5 1.5 发酵高产菌种的选育发酵高产菌种的选育自然选育在工业生产上的意义自然选育在工业生产上的意义自然选育虽然突变率很低，但却是工厂保证稳产高产的自然选育虽然突变率很低，但却是工厂保证稳产高产的重要措施。重要措施。回

24、复突变回复突变：高产菌株在传代的过程中，由于自然突变导致：高产菌株在传代的过程中，由于自然突变导致高产性状的丢失，生产性能下降，这种情况我们称为回复高产性状的丢失，生产性能下降，这种情况我们称为回复突变突变问题：问题：高产菌株是正突变高，还是负突变高？高产菌株是正突变高，还是负突变高？1.5 1.5 发酵高产菌种的选育发酵高产菌种的选育自然选育操作步骤：自然选育操作步骤：一般习惯上将自然选育称为菌种的分离纯化。一般习惯上将自然选育称为菌种的分离纯化。单细胞单细胞(孢子孢子)悬液的制备悬液的制备平板分离平板分离挑选单菌落挑选单菌落发酵试验发酵试验1.5 1.5 发酵高产菌种的选育发酵高产菌种的选

25、育注意形态的观察注意形态的观察选择性培养法选择性培养法随机分离法随机分离法平板划线法平板划线法平板稀释法平板稀释法二、诱变育种二、诱变育种用各种物理、化学的因素人工诱发基因突变进行的筛选，用各种物理、化学的因素人工诱发基因突变进行的筛选，称为称为诱变育种。诱变育种。诱变剂：能够提高生物体突变频率的物质称为诱变剂：能够提高生物体突变频率的物质称为诱变剂诱变剂（P103）诱变剂诱变剂物理：紫外，快中子，射线，激光物理：紫外，快中子，射线，激光化学：硫酸二乙酯（化学：硫酸二乙酯（DES），亚硝基胍（），亚硝基胍（NTG）生物：噬菌体，转座子生物：噬菌体，转座子1.5 1.5 发酵高产菌种的选育发酵高

26、产菌种的选育（二）、诱变剂处理过程中几个有关的问题（二）、诱变剂处理过程中几个有关的问题 化学诱变剂使用过程的安全性化学诱变剂使用过程的安全性诱变剂量的选择诱变剂量的选择诱变剂的选择诱变剂的选择出发菌株的选择出发菌株的选择（一）、诱变育种的原理（一）、诱变育种的原理 诱变育种的理论基础是基因突变，突变主要包括染诱变育种的理论基础是基因突变，突变主要包括染色体畸变和基因突变两大类。色体畸变和基因突变两大类。压硝酸：压硝酸：0.07MNa0.07MNa2 2HPOHPO4 4亚硝基胍亚硝基胍：1MNaOH1MNaOH二、诱变育种二、诱变育种（三）、诱变育种的一般步骤（三）、诱变育种的一般步骤（P1

27、03）二、诱变育种二、诱变育种诱变育种一般包括诱变育种一般包括诱变和筛选诱变和筛选两个部分。两个部分。诱变诱变部分成功的关键包括出发菌株的选择、诱部分成功的关键包括出发菌株的选择、诱变剂种类和剂量的选择，以及合理的使用方法。变剂种类和剂量的选择，以及合理的使用方法。筛选筛选部分包括初筛和复筛来测定菌种的生产能部分包括初筛和复筛来测定菌种的生产能力。力。诱变育种是诱变和筛选过程的不断重复，直到诱变育种是诱变和筛选过程的不断重复，直到达到达到高产菌株高产菌株。（三）、诱变育种的一般步骤（三）、诱变育种的一般步骤二、诱变育种二、诱变育种出发菌株的选择出发菌株的选择制备菌悬液制备菌悬液诱变处理诱变处理

28、突变菌株的筛选突变菌株的筛选营养缺陷型突变菌株的筛选营养缺陷型突变菌株的筛选抗反馈阻碍和抗反馈抑制突变菌株抗反馈阻碍和抗反馈抑制突变菌株的筛选的筛选组成型突变株的筛选组成型突变株的筛选抗性突变株的筛选抗性突变株的筛选自然界直接分离到的野生型菌株自然界直接分离到的野生型菌株经历过生产条件考验的菌株经历过生产条件考验的菌株已经历多次育种处理的菌株已经历多次育种处理的菌株随随机机筛筛选选形形态态理理化化性性质质 HD:高丝氨酸脱氢酶高丝氨酸脱氢酶黄色短杆菌中赖氨酸黄色短杆菌中赖氨酸的合成调节机制的合成调节机制 HT:高丝氨酸转乙酰酶高丝氨酸转乙酰酶AK:天冬氨酸激酶天冬氨酸激酶结构类似物抗性结构类似

29、物抗性：Lys的类似物的类似物AEC,Thr的类似物的类似物AHV营养缺陷型营养缺陷型：如如Thr缺陷型缺陷型黄色短杆菌黄色短杆菌F9-50的诱变谱系的诱变谱系 Bervibacterium flavum As 1.495 (leu-)lys.HCl 2.1 g/lF6-16 (leu-,Thr-)20.8 g/lF9-50(leu-,Thr-,AEC r)33.5 g/l三、基因的直接进化三、基因的直接进化(directed evolution)q 突变 基因突变库的建立基因突变库的建立q 筛选 基因突变库的筛选基因突变库的筛选q 基因复制与遗传步骤：步骤：在分子水平上，对目标基因直接处理，

30、然后通过在分子水平上，对目标基因直接处理，然后通过高通量的筛选方法，提高目标蛋白的性能。高通量的筛选方法，提高目标蛋白的性能。1.5 1.5 发酵高产菌种的选育发酵高产菌种的选育主要应用：主要应用：酶活性能的提高酶活性能的提高:生理环境生理环境工业催化环境工业催化环境l pHl 温度温度l 有机溶剂有机溶剂l 底物专一性底物专一性脂酶拆分脂酶拆分2-2-甲基癸酸硝基苯酯甲基癸酸硝基苯酯例：例：PLAPLAPLA光学拆分选择性光学拆分选择性(%)(%)2 31 57 75 81 905 5次错位次错位PCR 2PCR 2次定点突变次定点突变ReetzReetz(1997)Liebeton(200

31、0)(1997)Liebeton(2000)定点突变定点突变错位错位PCRDNA改组改组(DNA Shuffling):指指DNA分子的体外重排，是基分子的体外重排，是基因在分子水平上进行有性重组因在分子水平上进行有性重组(Sexual Recombination)。DNA改组技术改组技术(1994)的发明人的发明人Stemmer博士，他以博士，他以5项美国专利为项美国专利为技术支撑点，于技术支撑点，于1997年创立了专门从事年创立了专门从事DNA改组研究的公司改组研究的公司Maxygen。公司刚刚建立，世界上几家最大的公司纷纷与之洽谈。公司刚刚建立，世界上几家最大的公司纷纷与之洽谈并建立了合

32、作关系。这些公司包括最大的农业公司并建立了合作关系。这些公司包括最大的农业公司 duPont公司、公司、生产抗生素的世界巨头生产抗生素的世界巨头 DSM公司和工业酶研究生产之最的公司和工业酶研究生产之最的Novo nordisk公司。此外，迄今为止，公司。此外，迄今为止，Maxygen公司还得到了来自美国公司还得到了来自美国国防高级研究计划局国防高级研究计划局(DARPA)和国家科学技术协会和国家科学技术协会(NIST)的的5项项资助，共计资助，共计2100万美元。从另一角度反映了万美元。从另一角度反映了DNA改组的重要性及改组的重要性及美国政府及商家对美国政府及商家对DNA改组技术的重视程度

33、。改组技术的重视程度。图图1有性有性PCR法改组法改组DNA的基本程序的基本程序DNA shuffling 图图2交错延伸法改组交错延伸法改组DNA的基本程序的基本程序 DNA shufflingX XXX X XX X XX X XXX X XX XX XXX XX X X XX X XXX XX XXX XX X X XX X XXX X XX X XX XXX XXX X X X X X XX X Fragment Reassemble Select bestwith DNAseI fragments recombinantsRepeat for multiple cyclesDNA s

34、huffling项目进化速度进化对象进化周期影响对象突变效率常规定向进化缓慢进化整个基因组多年完整基因组低DNAShuffling快速进化特定基因/操纵子/病毒几天部分基因组高DNA ShufflingDNA Shuffling与常规定向进化的比较与常规定向进化的比较类 型示 例特 性活性增加倍数 潜在应用领域抗 体人源抗体亲和性400生物制药酶天冬氨酸转氨酶催化特异性10，000生物制药-内酰胺酶抗生素抗性32，000抗生素枯草杆菌蛋白酶E耐热性65耐热时间17200工业酶细胞因子人类干扰素抗病毒285，000基因治疗肿瘤抑制因子P5337半衰期12基因治疗代谢途径砷酸盐代谢途径砷酸盐解毒4

35、0生物制药汞代谢途径汞解毒12生物制药部分DNA Shuffling技术的研究成果DNA改组改组(DNA Shuffling)技术的应用领域技术的应用领域分类分类用途用途进化进化DNA转基因；疫苗载体；转基因；疫苗载体；DNA疫苗；表达载疫苗；表达载体；基因转移载体体；基因转移载体进化蛋白进化蛋白基因治疗用酶；细胞因子；生长因子；基因治疗用酶；细胞因子；生长因子；抗体；工业酶抗体；工业酶进化生物体进化生物体 植物；科研用生物体；化学及药物加工；植物；科研用生物体；化学及药物加工；疫苗有机体；石油加工；除污生物疫苗有机体；石油加工；除污生物1）菌种的退化及原因）菌种的退化及原因菌种退化：菌种退化

36、：指在较长时期传代保指在较长时期传代保藏后，菌株的一个或多个藏后，菌株的一个或多个生理性状和形态特征逐渐减退或消失的现象。生理性状和形态特征逐渐减退或消失的现象。常见的菌种衷退在形态上表现为常见的菌种衷退在形态上表现为分生孢子的减少或菌分生孢子的减少或菌落颜色的改变落颜色的改变，与由于环境条件变化而引起菌落形态和生，与由于环境条件变化而引起菌落形态和生理上的变异是不同的理上的变异是不同的。1.6 1.6 菌种的退化与保藏菌种的退化与保藏菌种菌种退化的原因：退化的原因：基因突变、变异菌株性状分离、其他因基因突变、变异菌株性状分离、其他因素（温度、湿度、培养基成分及各种培养条件）素（温度、湿度、培

37、养基成分及各种培养条件）1.6 1.6 菌种的退化与保藏菌种的退化与保藏狭义的菌种复壮狭义的菌种复壮指在菌种已发生衰退的情况下，指在菌种已发生衰退的情况下，通过纯种分离和测定生产性能等方法，从衰退的通过纯种分离和测定生产性能等方法，从衰退的群体中找出少数尚未衰退的个体，从而达到恢复群体中找出少数尚未衰退的个体，从而达到恢复该菌原有典型性状的目的。该菌原有典型性状的目的。广义的菌种复壮广义的菌种复壮指在菌种的生产性能尚未衰退指在菌种的生产性能尚未衰退前，就经常有意识地进行纯种分离和生产性能测前，就经常有意识地进行纯种分离和生产性能测定工作，从而逐步提高菌种的生产特性。定工作，从而逐步提高菌种的生

38、产特性。2）菌种的复壮）菌种的复壮一、退化菌种的复壮一、退化菌种的复壮1.6 1.6 菌种的退化与保藏菌种的退化与保藏 常用的方法是对已退化菌株用一定培养条件进常用的方法是对已退化菌株用一定培养条件进行单细胞行单细胞分离纯化分离纯化，从而限制退化菌株在数量上占，从而限制退化菌株在数量上占优势，最后淘汰已退化菌落而使原菌株得以复壮。优势，最后淘汰已退化菌落而使原菌株得以复壮。纯种分离的方法常用的有三种：稀释分离法、纯种分离的方法常用的有三种：稀释分离法、平板划线法和组织分离法（用于高等真菌）。平板划线法和组织分离法（用于高等真菌）。2）菌种的复壮）菌种的复壮1.6 1.6 菌种的退化与保藏菌种的

39、退化与保藏二、通过寄生进行复壮二、通过寄生进行复壮 寄生型微生物的退化可接种到相应寄生体内寄生型微生物的退化可接种到相应寄生体内以提高菌株的活力。以提高菌株的活力。三、联合复壮三、联合复壮 对退化菌株还可用剂量的紫外线辐射和低剂对退化菌株还可用剂量的紫外线辐射和低剂量的亚硝基胍（量的亚硝基胍（NTC）联合处理进行复壮。）联合处理进行复壮。2）菌种的复壮）菌种的复壮3）防止菌种退化的措施）防止菌种退化的措施合理的育种合理的育种选用合适的培养基选用合适的培养基创造良好的培养条件创造良好的培养条件控制传代次数控制传代次数利用不同类型的细胞进行移种传代利用不同类型的细胞进行移种传代选择有效的保选择有效

40、的保藏方法藏方法1.6 1.6 菌种的退化与保藏菌种的退化与保藏4）菌种）菌种保藏保藏 菌种菌种保藏的意义保藏的意义：是进行微生物学研究和微生物育种工作是进行微生物学研究和微生物育种工作的重要组成部分。其任务首先是菌种不死亡，同时还要尽可的重要组成部分。其任务首先是菌种不死亡，同时还要尽可能设法把菌种的优良特性保持下来而不致向坏的方面转化。能设法把菌种的优良特性保持下来而不致向坏的方面转化。1.6 1.6 菌种的退化与保藏菌种的退化与保藏 菌种保藏菌种保藏的原理：的原理：根据菌种的生理生化特点，采用低温、根据菌种的生理生化特点，采用低温、干燥、缺氧、缺乏营养、添加保护剂或酸中中和剂等方法，干燥

41、、缺氧、缺乏营养、添加保护剂或酸中中和剂等方法，使使孢子或菌体的生长代谢活动尽量降低，以减少其变异。使使孢子或菌体的生长代谢活动尽量降低，以减少其变异。4）菌种）菌种保藏保藏1.6 1.6 菌种的退化与保藏菌种的退化与保藏 蒸馏水悬浮法蒸馏水悬浮法 斜面低温保斜面低温保藏藏 石蜡油封保藏石蜡油封保藏 菌种菌种保藏的方法保藏的方法 砂土管保藏砂土管保藏 冷冻保藏冷冻保藏 真空冻干保藏真空冻干保藏 寄主保藏寄主保藏（病毒、立克次氏体、螺旋体等不能人工培养）（病毒、立克次氏体、螺旋体等不能人工培养）基因工程菌的保藏基因工程菌的保藏普通冷冻冷冻保藏技术普通冷冻冷冻保藏技术超低温冷冻保藏技术超低温冷冻保

42、藏技术液氮冷冻保藏技术液氮冷冻保藏技术小小 结结 涉及到工业化生产对于某一种特定的产品，只有涉及到工业化生产对于某一种特定的产品，只有 特定的微生物特定的微生物(动、植物动、植物)才具有大量表达的潜力；才具有大量表达的潜力；传统的诱变方法仍然是一种采用的方法，特别是传统的诱变方法仍然是一种采用的方法，特别是 自然选育是工业发酵稳产高产的重要保证；自然选育是工业发酵稳产高产的重要保证；目前土壤中已分离的微生物不到总数的目前土壤中已分离的微生物不到总数的1%1%，微生，微生 物的多样性仍然是以后若干年的研究重点物的多样性仍然是以后若干年的研究重点；基因重组、直接进化技术的应用，大大加快了生基因重组

43、、直接进化技术的应用，大大加快了生 物产品开发的进程物产品开发的进程。1 发酵工业微生物菌种的选育发酵工业微生物菌种的选育3.1 菌体组成和细胞外代谢产物菌体组成和细胞外代谢产物3.2 种子培养的培养基选择和配制原则种子培养的培养基选择和配制原则3 种子培养基及其制备种子培养基及其制备第二章第二章 菌种的制备菌种的制备http:/211.84.144.22/jing/C76/zcr-1.htm3.1 菌体组成和细胞外代谢产物菌体组成和细胞外代谢产物3 种子培养基及其制备种子培养基及其制备1）菌体组成：）菌体组成：?2）胞外代谢产物）胞外代谢产物 胞外产物多达胞外产物多达37大类，根据微生物代谢

44、产物和生长繁殖的关大类，根据微生物代谢产物和生长繁殖的关系不同，分为两大类：系不同，分为两大类：一类是微生物自身生长繁殖所必需的代谢产物，称为一类是微生物自身生长繁殖所必需的代谢产物，称为初级代谢产初级代谢产物物，此类产物的生产菌种主要是，此类产物的生产菌种主要是细菌、酵母、霉菌细菌、酵母、霉菌等。等。另一类代谢产物与微生物生长繁殖无明确关系，称为另一类代谢产物与微生物生长繁殖无明确关系，称为次级代谢产次级代谢产物物，如抗生素、生物碱、色素等。发酵工业用来生产次级代谢产，如抗生素、生物碱、色素等。发酵工业用来生产次级代谢产物的微生物仅有少数几个类群，主要是物的微生物仅有少数几个类群，主要是丝状

45、放线菌、丝状真菌丝状放线菌、丝状真菌等。等。3.1 菌体组成和细胞外代谢产物菌体组成和细胞外代谢产物3 种子培养基及其制备种子培养基及其制备3）微生物的营养类型（）微生物的营养类型（nutritional types)碳源利用碳源利用自养型自养型（autotrophs）异养型异养型（heterotrophs）能量来源能量来源光能营养型光能营养型（Phototrophs）化能营养型化能营养型（chemotrophs）光能无机自养型光能无机自养型（Photo-Lithoautotrophy）化能有机异养型化能有机异养型（Photoorganoheterotrophy）化能无机自养型化能无机自养型（

46、chemoLithoautotro-phy）化能有机异养型化能有机异养型（chemoorganoheterotrophy）3.2 种子培养的培养基选择和配制原则种子培养的培养基选择和配制原则3 种子培养基及其制备种子培养基及其制备1）培养基的营养成分及来源）培养基的营养成分及来源 培养基培养基（medium)是人们提供微生物生长繁殖和生物合成各是人们提供微生物生长繁殖和生物合成各种代谢产物所需要的按一定比例配制的多种营养物质的混合物。种代谢产物所需要的按一定比例配制的多种营养物质的混合物。包括：包括：碳源碳源(source of carbon)氮源氮源(source of nitrogen)无

47、机盐无机盐(inorganic salt)生长因子生长因子(growth factor)水水(water)3.2 种子培养的培养基选择和配制原则种子培养的培养基选择和配制原则3 种子培养基及其制备种子培养基及其制备2）培养基的类型和用途）培养基的类型和用途来源：来源：天然天然培养基（培养基（complex medium；undefined medium）合成合成培养基（培养基（synthetic medium；defined medium）半合成培养基半合成培养基（semidefined medium）外观：外观：固体固体培养基（培养基（solid medium）液体液体培养基（培养基（liq

48、uid medium）半固体培养基半固体培养基（semisolid medium）功能：功能：孢子孢子培养基（培养基（sporemedium）和种子培养基。和种子培养基。3.2 种子培养的培养基选择和配制原则种子培养的培养基选择和配制原则3 种子培养基及其制备种子培养基及其制备3）培养基的配制原则）培养基的配制原则 选择适宜的营养物质、营养物质浓度及配比合适、选选择适宜的营养物质、营养物质浓度及配比合适、选择合适的择合适的pH、氧化还原电势、营养成分的加入顺序、氧化还原电势、营养成分的加入顺序（先加先加缓冲化合物，溶解后加入主要物质，然后加入维生素、氨基酸等生长缓冲化合物，溶解后加入主要物质，

49、然后加入维生素、氨基酸等生长素类的物质素类的物质）。http:/211.84.144.22/jing/C76/zcr-1.htm3.2 种子培养的培养基选择和配制原则种子培养的培养基选择和配制原则3 种子培养基及其制备种子培养基及其制备4）培养基成分配比的选择）培养基成分配比的选择 种子和孢子培养的目的是获得大量质量良好的菌体或孢子，种子和孢子培养的目的是获得大量质量良好的菌体或孢子，因此产量提高是选择培养基的一个重要标准。因此产量提高是选择培养基的一个重要标准。C/N比比 来源丰富、价格便宜、取材方便来源丰富、价格便宜、取材方便 方法：单因子试验、正交试验、均匀试验、影响面法方法：单因子试验

50、、正交试验、均匀试验、影响面法本章思考题本章思考题1 工业用微生物的要求有哪些？试举例说明微生物在工工业用微生物的要求有哪些？试举例说明微生物在工业中的应用。业中的应用。2 简述自然分离微生物的一般操作步骤。简述自然分离微生物的一般操作步骤。3 简述种子扩大培养的一般步骤。简述种子扩大培养的一般步骤。4 如何防止菌种衰退？菌种复壮的措施有哪些？如何防止菌种衰退？菌种复壮的措施有哪些？5 影响种子质量的因素有哪些？如何控制种子质量？影响种子质量的因素有哪些？如何控制种子质量？2008中国大学评价研究报告中国大学评价研究报告还发布了还发布了“2008中国最受媒体关注大学排行榜中国最受媒体关注大学排

51、行榜”，排行，排行榜以榜以2007年度高校网络新闻搜索的数量统计得年度高校网络新闻搜索的数量统计得出，出，位居前十强位居前十强的高校是北京大学、清华大学、的高校是北京大学、清华大学、中国人民大学、复旦大学、浙江大学、中山大学、中国人民大学、复旦大学、浙江大学、中山大学、北京师范大学、上海交通大学、武汉大学、同济北京师范大学、上海交通大学、武汉大学、同济大学。大学。中国一流大学名单中国一流大学名单l 校名校名 入选根据入选根据l 清华大学清华大学 研究研究1型、工学第型、工学第1名名l 北京大学北京大学 研究研究1型、理学第型、理学第1名名l 浙江大学浙江大学 研究研究1型、工学第型、工学第2名

52、名l 南京大学南京大学 研究研究1型、理学第型、理学第2名名l 北京师范大学北京师范大学 研究研究1型、教育学第型、教育学第1名名上海交通大学上海交通大学 研究研究1型、工学第型、工学第3名名l 中国科术大学中国科术大学 研究研究1型、理学第型、理学第3名名 l 复旦大学复旦大学 研究研究1型、医学第型、医学第3名名 l 校名校名 入选根据入选根据l 天津大学天津大学 研究研究1型、工学第型、工学第5名名l 中山大学中山大学 研究研究1型型 l 南开大学南开大学 研究研究1型型 l 中国人民大学中国人民大学 法学第法学第1名、经济学名、经济学第第2名名 l 西安交通大学西安交通大学 管理学第管

53、理学第1名名 l 中国农业大学中国农业大学 农学第农学第1名名 l 哈尔滨工业大学哈尔滨工业大学 工学第工学第4名名 l 华中科技大学华中科技大学 工学第工学第6名名 农林院校入选百篇优秀博士学位论文篇数统计农林院校入选百篇优秀博士学位论文篇数统计学位授予单位学位授予单位1999-20041999-200420052005200620062007200720082008合计合计中国农业大学中国农业大学3 32 22 22 23 31212南京农业大学南京农业大学2 22 20 02 20 06 6华中农业大学华中农业大学1 10 02 21 11 15 5西北农林科技大学西北农林科技大学3 3

54、0 00 01 10 04 4四川农业大学四川农业大学4 40 00 00 00 04 4北京林业大学北京林业大学2 21 10 01 10 04 4华南农业大学华南农业大学1 10 00 01 11 13 3东北林业大学东北林业大学1 10 01 10 01 13 3中国农业科学院中国农业科学院3 30 00 00 00 03 3扬州大学扬州大学2 20 00 00 00 02 2内蒙古农业大学内蒙古农业大学1 10 00 00 00 01 1沈阳农业大学沈阳农业大学1 10 00 00 00 01 1东北农业大学东北农业大学1 10 00 00 00 01 1福建农林大学福建农林大学1 1

55、0 00 00 00 01 1湖南农业大学湖南农业大学0 00 00 00 01 11 1开设生物工程类生物工程专业的院校名单开设生物工程类生物工程专业的院校名单 北京北京 北京理工大学、北京理工大学、北京化工大学北京化工大学、中国农业大学中国农业大学、北京工商大学、北京工商大学天津天津 天津大学天津大学、天津轻工业学院、天津商学院、天津轻工业学院、天津商学院河北河北 河北工业大学、河北科技大学河北工业大学、河北科技大学内蒙古内蒙古 内蒙古农业大学内蒙古农业大学辽宁辽宁 大连理工大学、沈阳药科大学、大连民族学院、大连轻工业学院、沈阳化工学院大连理工大学、沈阳药科大学、大连民族学院、大连轻工业学

56、院、沈阳化工学院吉林吉林 延边大学、吉林职业师范学院延边大学、吉林职业师范学院黑龙江黑龙江 黑龙江大学、齐齐哈尔大学黑龙江大学、齐齐哈尔大学上海上海 上海交通大学上海交通大学、华东理工大学华东理工大学、上海大学、上海大学江苏江苏 南京理工大学、南京理工大学、江南大学江南大学、中国药科大学、南京工业大学、中国药科大学、南京工业大学,东南大学东南大学（1984）浙江浙江 浙江大学浙江大学、浙江工业大学、浙江工业大学安徽安徽 合肥工业大学、安徽机电学院、合肥经济技术学院合肥工业大学、安徽机电学院、合肥经济技术学院福建福建 福州大学、华侨大学、福建师范大学福州大学、华侨大学、福建师范大学江西江西 江西

57、农业大学江西农业大学山东山东 烟台大学、山东轻工业学院、聊城师范学院烟台大学、山东轻工业学院、聊城师范学院河南河南 河南大学、郑州工程学院、郑州轻工业学院河南大学、郑州工程学院、郑州轻工业学院湖北湖北 湖北大学、华中农业大学、武汉工业学院、湖北工学院，湖北大学、华中农业大学、武汉工业学院、湖北工学院，华中科技大学华中科技大学（1981）广东广东 华南理工大学华南理工大学广西广西 广西大学广西大学重庆重庆 重庆大学重庆大学(1979)四川四川 四川大学四川大学、四川轻化工学院、四川轻化工学院贵州贵州 贵州工业大学贵州工业大学云南云南 昆明理工大学昆明理工大学陕西陕西 西北大学、西安交通大学、西北农林科技大学、西北轻工业学院、陕西理工学院西北大学、西安交通大学、西北农林科技大学、西北轻工业学院、陕西理工学院研究领域有发展研究领域有发展光电工程光电工程生物工程生物工程生化工程生化工程核工程核工程通讯工程等通讯工程等.http:/211.84.144.22/jing/C76/zcr-1.htm 就业容易就业容易机械类机械类(尤其是数控类尤其是数控类)汽车类汽车类建筑类建筑类网络类网络类矿山类矿山类石油业等石油业等 还有还有:老师老师,医生医生,文科中文科中:政法政法,证券证券,旅游旅游,广告广告,金金融类都是不错的融类都是不错的.