MTT法原理步骤

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1、细胞的增殖检测（MTT法）imMTT法又称MTT比色法，是一种检测细胞存活和生长的方法，该方法 已广泛用于一些生物活性因子的活性检测、大规模的抗肿瘤药物筛选、细胞 毒性试验以及肿瘤放射敏感性测定等。它的特点是灵敏度高、经济，但由于 MTT 经还原所产生的甲瓒产物不溶于水，需被溶解后才能检测，这不仅使工 作量增加，也会对实验结果的准确性产生影响，而且溶解甲瓒的有机溶剂对 实验者也有损害。一、检测原理MT|全 称 为 3-（4,5-Dimethyl-2-thiazolyl）-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide，汉语化学名为3-（4， 5-二甲基噻唑-2）-2,

2、5-二苯基四氮唑溴盐（商 品名：噻唑蓝），是一种黄颜色的染料。活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使 外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒（Formazan）并沉积在细胞中， 而死细胞无此功能。二甲基亚砜DMsO）能溶解细胞丽联免疫 检测仪在490nm波长处测定其光吸收值（也有用570nm波长），可间接反映活 细胞数量。在一定细胞数范围内，MTT结晶形成的量与细胞数成正比。二、试剂材料准备与实验仪器1、对数生长期细胞2、受试因素（药物）3、5mg.mLiMTT溶液：称取MTT 0.5克，溶于100 ml的磷酸缓冲液（PBS） 或无酚红的培养基中（60C水浴助溶），用0.22m m滤膜过滤以除去

3、溶液里的 细菌，放4C避光保存即可，在配制和保存的过程中，容器最好用铝箔纸包 住。（PBS 配方：NaCl 8g, KCl 0.2g, Na2HPO4 1.44g, KH2PO4 0.24g,调 pH 7.4 , 定容 1L）4、DMSO （二甲基亚砜）5、96 孔板6、酶联免疫检测仪7、细胞培养箱 三、MTT法实验步骤（一）普通MTT法实验步骤1、接种细胞：用含10胎小牛血清得培养液配成单个细胞悬液，以每孔 1000-10000个细胞接种到96孔板，每孔体积200ul.2、培养细胞：同一般培养条件，培养3-5 天（可根据试验目的和要求决 定培养时间）。3、呈色:培养3-5天后，每孔加MTT溶

4、液（5mg/ml用PBS配制,pH=7.4）20ul. 继续孵育4 h,终止培养，小心吸弃孔内培养上清液，对于悬浮细胞需要离心后再吸弃 孔内培养上清液。每孔加150ul DMSO,脱色摇床振荡10min,使结晶物充分融解。4、比色：选择490nm（570nm）波长，在酶联免疫监测仪上测定各孔光 吸收值,记录结果,以时间为横坐标,吸光值为纵坐标绘制细胞生长曲线。（二）药物MTT法实验步骤1、贴壁细胞（1）收集对数期细胞，调整细胞悬液浓度，每孔加入100皿,铺板使待测细胞 调密度至103-104cell/孔，（边缘孔用无菌PBS填充）。（2）5%CO2, 37C孵育，至细胞单层铺满孔底（96孔平底

5、板），加入浓度梯 度的药物，|原则上，细胞贴壁后即可加药，或两小时，或半天时间，但我们 常在前一天下午铺板，次日上午加药，一般5-7个梯度，每孔100皿，设3-5 个复孔,建议设5 个,否则难以反应真实情况。（3）5%CO2, 37C孵育16-48小时，倒置显微镜下观察。（4）每孔加入20plMTT溶液（5mg/ml,即0.5%MTT）,继续培养4h。若药 物与MTT能够反应，可先离心后弃去培养液，小心用PBS冲2-3遍后，再加 入含MTT的培养液。（5）终止培养，小心吸去孔内培养液。（6）每孔加入150皿二甲基亚砜，置摇床上低速振荡10min,使结晶物充分 溶解。在酶联免疫检测仪OD490n

6、m处测量各孔的吸光值。（7）同时设置调零孔（培养基、MTT、二甲基亚砜），对照孔（细胞、相同 浓度的药物溶解介质、培养液、MTT、二甲基亚砜）2、悬浮细胞（1）收集对数期细胞，调节细胞悬液浓度1x106/ml,按次序 补足的1640 （无血清）培养基40Al ; 加Actinomycin D （有毒性）10皿用培养液稀释（储存液100 g/ml, 需 预试寻找最佳稀释度, 1:10-1:20）；需检测物10吐 细胞悬液50（即5xl04ceU/孔），共100皿加入到 96孔板（边缘孔用无菌水填充）。每板设对照（加100mL 1640）。（2）置37C, 5%CO2孵育16-48小时，倒置显微镜

7、下观察。（3）每孔加入10 MTT溶液（5 mg/ml,即0.5%MTT）,继续培养4 h。（悬 浮细胞推荐使用WST-1,培养4 h后可跳过步骤4）,直接酶联免疫检测仪 OD570nm （630nm校准）测量各孔的吸光值）（4）离心（1000转x10min）,小心吸掉上清，每孔加入100 ul二甲基亚砜， 置摇床上低速振荡10 min使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪OD570nm（630nm校准）测量各孔的吸光值。（5）同时设置调零孔（培养基、MTT、二甲基亚砜），对照孔（细胞、相同 浓度的药物溶解介质、培养液、MTT、二甲基亚砜），每组设定3复孔。五、计算抑制率（对照-本底） -（给药-

8、本底） /（对照-本底） *100%.六、注意事项1、MTT 法只能用来检测细胞相对数和相对活力，但不能测定细胞绝对数。 在用酶标仪检测结果的时候，为了保证实验结果的线性,MTT吸光度最好在 0-0.7 范围内，超出这个范围就不是直线关系。（阴性组在 0.8-1.2，加药组在 0-0.7）。2、MTT 一般最好现用现配，过滤后4C避光保存两周内有效，或配制成 5mg/ml 保存在-20 度长期保存，避免反复冻融，最好小剂量分装，用避光袋 或是黑纸、锡箔纸包住避光以免分解。我一般都把MTT粉分装在EP管里， 用的时候现配，直接往培养板中加，没必要一下子配那么多,尤其当MTT变为 灰绿色时就绝对不

9、能再用了。我自己操作一般是每次配制15ml过滤后4C避 光保存，在两周内用完。3、MTT 有致癌性，用的时候小心，有条件最好带那种透明的簿膜手套， 配成的MTT需要无菌，MTT对菌很敏感；往96孔板加时不避光也没有关系， 毕竟时间较短，或者不放心的时候可以关闭超净台上的日光灯来避光，这样 比较好。4、选择适当得细胞接种浓度，每孔中的细胞数可以根据细胞生长的速度 调整，并进行预实验调整浓度，太多敏感性降低，太少观察不到差异。每孔 1000-10000 个，但是也要看细胞种类和状态。我做的是药物抑制肿瘤细胞生 长和增殖，铺过2000至 8000个每孔。 2000太低，8000过高，对于阴性组高 于

10、5000个吸光值就很大，大于1.5。所以对于我自己的A549实验一般选用 3000-5000。一般每孔4000个细胞为宜5、避免血清干扰：一般选小于10%的胎牛血清的培养液进彳丁试验。在呈 色后尽量吸尽孔内残余培养液。6、设空白对照：与试验平彳不加细胞只加培养液的空白对照。其他试验 步骤保持一致，最后比色以空白调零。7、用96孔板培养细胞做MTT测细胞活力，应该加多少1640培养基，多少 MTT 和 DMSO 合适根据书上说的加 200ul1640,20ulMTT,150ulDMSQ 力口 DMSO之前要尽量去掉培养液，便于DMSQ溶解甲臜颗粒进行比色测定8、 MTT加20ul,作用四小时后洗

11、掉上清液，注意不要将甲瓚洗掉，然 后每孔加150ul DMSQ,在脱色摇床上振荡10分钟，然后测吸光值。9、铺板时要保证每孔铺的细胞数目均匀一致，一般每加几孔就混匀一下。 我一般是加完一排复孔就混匀一次。10、实验时应设置调零孔，对照孔，加药孔。调零孔加培养基、 MTT、 二甲基亚砜。对照孔和加药孔都要加细胞、培养液、MTT、二甲基亚砜，不 同的是对照加溶解药物的介质，而加药组加入不同浓度的药物。11、贴壁细胞加 MTT 前吸掉培养液，悬浮细胞可以不吸除培养液，再加 入 0.5%MTT,量为 20ul/孔。12、如果不使用 96 孔板，培养基超过 100 ml， MTT 按照 10%的比例加

12、入。13、对于DMSQ，溶解后呈紫（红）色，490nm有最大吸收值；而对于 SDS和酸化异丙醇，则选用570nm,并且建议以655nm作为参考波长。14、96 孔板在培养箱中，由于湿度不够，而培养箱由于具有一定的温度 使得边缘的孔水分蒸发较快，导致培养基中各种成分浓度变化增大，导致细 胞状态不同。对于这种现象，要保证培养箱中的湿度，减少开关培养箱的次 数和时间。15、注意细胞悬液一定要混匀，已避免细胞沉淀下来，导致每孔中的细 胞数量不等，可以每接几个就要再混匀一下。16、没有去掉上清直接加DMSO,沉淀会很难溶解。加DMSO前要把液 体吸掉，但培养液里的紫色结晶可能会吸去，也可在倒之前先用平板

13、离心机 离心 96 孔板， 2000r， 5 分钟，然后吸掉上清。加入 DMSQ 后可用排枪反复 抽吸助溶，溶解后尽快检测。17、为了减少误差，培养板的四边孔只加培养基或只接种细胞，而不作 为指标检测孔。18、除置摇床上低速振荡10 min,使结晶物充分溶解外，可用枪头吹打， 加快溶解，效果亦可；或放入37 度放孵箱15 分钟溶解结晶。细胞增殖检测：MTT法心得MTT 实验是检测细胞活力的实验方法，由于细胞活力与细胞数呈正相关， 因此也常常用来检测细胞的增殖情况。一、MTT的原理活细胞有琥珀酸脱氢酶，将MTT还原成棕褐色沉淀。由于一般介绍园子 里已经很多，笔者将自己的心得按照实验流程与大家交流

14、交流。二、MTT法检测细胞增殖实验的注意事项1、培养好细胞点板养细胞没啥好说的，如果不知道细胞如何养，那就看看相关的文献方法。如果知道了细胞的名字，就可以上 www.atcc.org 检索细胞的培养信息，这个 网站上的培养方法是标准培养方法。当然可以根据自己实验要求进行修改。 由于细胞计数很繁琐，点板时的细胞浓度是最难掌握的，这一点笔者的心得 如下：自己先将细胞养一段时间，大概了解细胞的增殖情况，在MTT检测时实际上 要求细胞大概能长满96-孔板的80-90%，如果打算养48小时就检测，根据细 胞的生长情况反推点板时的细胞浓度状况。这时可以将细胞不进行计数，将 消化好的细胞混匀后（可能是10m

15、l）直接在一个废弃（最好进行过无菌处理） 的 96 孔板中依次加入 180、100、50 微升细胞，将细胞放置几分钟就会沉到 板底了，这时在显微镜下观察，推测哪个孔的细胞48h能基本长满板底，假 设 50 微升的孔比较合适，而点板时没孔需点 200 微升，那么就将细胞浓度再 稀释 4 倍就可以正式点板了，这时顺便将细胞进行计数（因为实验记录要求 写啊）。这样就OK 了！如果细胞还太多，将细胞稀释4倍后再重复以上操作。 注意：不要过分信赖细胞计数，因为细胞计数的取样量为20 微升左右，由于 颗粒的分布不均匀，代表性是很差的。建议：细胞计数一定要会，但不要完 全依赖它。点板时一定要将细胞消化成单个

16、细胞，而且一定要混匀，最好用排枪， 否则，MTT的SD会狂大！2、点板布局其实这一点很多人不懈一顾。如果你的细胞要养48h或更长，建议不要 吝啬96-孔板的四周边孔，这32个边孔不能使用，建议加入灭菌PBS以饱和 中间 64个孔的水分。因为细胞培养过程中，边孔的水分蒸发很快，培养液及 里面的药物会出现浓缩现象，细胞的状况就复杂了，有些人称之为“边缘效应” 这些孔的SD也会狂大，既然如此，不如不用。3、加 MTT如果确认你考察的药物没有氧化还原性，你可以直接加入MTT溶液（总 体积的1/10）,如果你没有把握，建议在加MTT前换一次液；如果你肯定考 察的药物的氧化还原性很强，比如谷胱廿肽、Vit

17、E、VitC,那建议你用PBS 将细胞洗洗，否则这些药物会将MTT还原成棕褐色沉淀，这种效果可能是你 不需要的。4、加入MTT后的反应时间为3-4h，此时弃去各孔中的液体在加入200微升的DMSO。为了将 沉淀溶解完全，尽可能将水弃除干净，加入DMSO后在摇床上震摇10min。 提醒：如果你的细胞贴壁不好，此时的沉淀在弃去液体时易丢失，因此贴壁 不好的细胞在点板时记得将96孔板用多聚赖氨酸处理处理，要么在弃液体时 先用甩板机离心，再轻轻弃去液体。关于DMSO的量，每孔的体积有点儿差 异不干扰检测，只要能将沉淀完全溶解就行了。至于DMSO的体积差异不同 为什么不影响检测值已经被数学证明了，在此我

18、不多说，如果有人不明白我 再证明给他看。当然为了养成良好的实验习惯，DMSO的体积还是一致的好。5、检测 MTT还原的MTT在460-630均有较好的吸收，如果你的酶标仪是滤光片，可 以选470 nm左右或630 nm左右的滤光片，如果酶标仪有单波长，你可以在 检测前扫描一下吸收谱，选用最大细说波长检测就是了，最大波长，大概在 550nm附近，必要时加一个参比波长以扣除非特异性吸收。6、吸收值分析在理想的MTT实验中，如果是细胞抑制实验，不加药物处理组的吸收值 应该在 0.8-1.2左右，太小检测误差占的比例较多，太大吸收值可能已经超出 线性范围。这个原理在朗伯-比尔定律中有解释。7、建议如果你觉得MTT中出现的问题不好解决，那么建议你做CCK-8实验， 原理与MTT相似，但操作上简化些，当然，费用也稍微高一些。