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1、1.重组质粒的酶切鉴定重组质粒的酶切鉴定2.紫外分光光度法检测紫外分光光度法检测DNA含量含量 实验五 在pH8.0（碱性）的环境中DNA的磷酸基团解离，使DNA在该环境中带负电荷，在电场中向正极方向泳动，因为各种DNA分子的电荷数、分子量、构象不同，它们在通过凝胶立体网格时所受的动力和阻力不同，所以泳动的速度有差异，以此达到分离的目的。DNA显色剂多用EB，它能和碱基间的氢键结合，在紫外光照射下呈橘红色（530nm）的荧光。21、酶切质粒、酶切质粒DNA后的琼脂糖凝胶电泳后的琼脂糖凝胶电泳1.1 1.1 影响影响DNADNA在凝胶中迁移速率的因素在凝胶中迁移速率的因素 DNA分子的大小分子的
2、大小 构象构象 凝胶浓度凝胶浓度 电压电压 缓冲液缓冲液1.2 1.2 不同浓度琼脂糖的凝胶分离范围不同浓度琼脂糖的凝胶分离范围琼脂糖浓度琼脂糖浓度（，（，W/V)DNA分子的有效分离范围（分子的有效分离范围（kb)0.7 0.8-100.9 0.5-71.2 0.4-61.5 0.2-32.0 0.1-2 琼脂糖凝胶板的制备琼脂糖凝胶板的制备（封板、制备封板、制备1%凝胶、倒胶、插梳、凝固后拔梳凝胶、倒胶、插梳、凝固后拔梳）倒缓冲液，加样倒缓冲液，加样（取酶切质粒取酶切质粒DNA样品液样品液 20l+4 l上样缓冲液，混匀上样缓冲液，混匀）电泳（电泳（100V 0.5小时，小时，5V/cm）
3、染色与检测染色与检测（紫外灯下检测紫外灯下检测）1.3 实验步骤一、电泳前准备一、电泳前准备准备内容作用1.刷干净电泳制胶的梳子，板子，槽子，蒸馏水洗净晾干防止不必要的重复污染，减少外来的污染。梳子干净有利于梳孔的形成。2.检查电泳槽，根据情况更换buffer排除电泳槽的电极接触不良，确保buffer的缓冲能力，减少污染。3.根据DNA的分离范围选择合适的胶浓度并记录达到较好的分离效果，防止样过快跑出胶或者是过慢浪费时间。4.计算agarose的用量和制胶 buffer的用量记录，胶最终越薄越好。实验记录备查二、制胶二、制胶步骤步骤注意事项注意事项1.称量agarose和bufferBuffe
4、r不要用成H2O，称量相对准确2.融胶，加热到胶产生大量的气泡时，拿出摇匀，继续加热到完全溶解，拿出摇匀，再加热到沸腾。非常热，小心烫手，另外注意不要加热过度使胶冲出瓶子。因此注意选择起码为胶体积2倍以上的瓶子。保证胶混匀和完全溶解，减少可能因此引起的胶中孔径不均匀影响分离效果。3.倒胶，可用水浴的办法使胶冷却到60度左右，即手可以握住瓶子的温度，沿着制胶板的一侧，缓缓地一次性倒入。梳子最好是预先放好并固定的，注意梳孔的体积能点的下所有的样。用枪头赶掉气泡。制胶的桌面相对水平。倒胶时尽量减少气泡的产生。EB如果在制胶时加入，在60度左右时加入，使终浓度为0.5ug/ml。不宜过低，染色成像不明
5、显；不宜过高，导致背景太深。摇匀要沿着瓶壁摇动，尽量减少气泡产生的可能性。高浓度胶例如2%以上的EB很难摇匀，而且凝的速度也相对快，强烈建议跑完胶之后再用EB染色。4.室温凝胶30分钟过程中不要碰到梳子，尽量保持胶的位置不移动。时间不宜过久，导致胶干燥变形；不宜过短，影响胶内部孔径形成。5.拔梳子，放入电泳槽。缓缓地将梳子垂直从梳孔拔出，尽可能使梳子是同时从各个胶孔拔出的。暂时不用的胶最好放入电泳槽电泳液中浸泡。电泳液要浸没胶1mm。三、上样电泳三、上样电泳步骤步骤注意事项注意事项1.样品中加入loading buffer使其终浓度为1 X，混匀Loading buffer浓度不宜过低，点样时
6、样品不能很好的沉在胶孔里；不宜过高，电泳时容易形成带形的变形。注意混匀。2.点样沿着胶孔的边缘匀速加入。尽量避免碰坏胶孔。枪头不要吸过多的气泡，拔起时不要过猛带出样品。每点一个样完，吸取buffer洗枪头，避免样品混杂。如果是有特殊要求，例如回收，强烈建议每点一个样换一次枪头。加样的速度当然是越快越好，注意保证质量。点样的量不要太大，一方面是体积不要太大，溢出污染邻位样品；一方面两不要太大，容易导致脱尾和模糊不清。3.接通电源，选择合适的电压和时间电泳。胶孔与电极成水平状态，防止样品跑歪。跑胶期间不时回来看看，防止样品跑出胶等意外发生。实验小结实验小结思考思考:质粒构型对结果的影响？质粒构型对
7、结果的影响？酶切前后的对比？酶切前后的对比？9(1)(1)超螺旋超螺旋DNA(supercoiled DNA,SC DNA)1.2 1.2 质粒的三种构型质粒的三种构型10(2)(2)开环开环DNA(open circular DNA,OC DNA)如果两条链中有一条的一处或多处断裂，分子就能如果两条链中有一条的一处或多处断裂，分子就能发生旋转而消除链的张力，形成松弛型的环状分子。发生旋转而消除链的张力，形成松弛型的环状分子。11(3)线状线状DNA(linear DNA,L DNA):如果两条链均断开，即为线状如果两条链均断开，即为线状DNADNA。电泳时，三者泳动速度大小关系（？）12最快
8、中最慢点样孔点样孔细菌基因组细菌基因组DNAOC 型质粒型质粒DNAL型质粒型质粒DNASC 质粒质粒DNA细菌细菌RNA质质粒粒电电泳泳图图谱谱 常见问题：常见问题：1、提取的提取的DNA不纯：不纯：变性不充分；关键过程反应时间过短；离心时间或 速度不够。2、提取的提取的DNA成涂布状：成涂布状：操作过程中用力过猛，动作粗暴；操作系统有污染。3、与染色体与染色体DNA分离不全：分离不全：变性过程不完全；重组质粒重组质粒BamHIHind III双酶切双酶切电泳检测电泳检测5-G A A T T C-33-C T T A A G-5BamHI5-A A G C T T-3 3-T T C G
9、A A-5 Hind III预期电泳结果分析预期电泳结果分析M：Marker1：酶切样品：酶切样品12：酶切样品：酶切样品23：酶切样品：酶切样品34：未酶切质粒：未酶切质粒M3211Kb200bp100bp2Kb5Kb600bp400bp4二、紫外分光光度法检测二、紫外分光光度法检测DNADNA2.1 分光光度技术2.1.1 概述 分光光度技术是利用物质特有的吸收光谱对其进行定性、定量分析的实验技术。20灵敏度高：测定下限可达105106mol/L准确度高：能够满足微量组分的测定要求，相对误差25（12）;操作简便快速;应用广泛。212.2 原理2.2.1 2.2.1 有关光学原理有关光学原
10、理 光的本质是电磁波c 传播速度 频率 c/波长22光谱分区2310nm200nm 200nm 380nm380nm 780nm780 nm 2.5 m2.5 m 50 m50 m 300 m 吸收光谱吸收光谱 在光源和棱镜之间放上某种物质的溶液，光源发射光谱中某些波长的光因溶液吸收而消失，这种被溶液吸收后的光谱称为该溶液的吸收光谱吸收光谱。24苯苯和和甲苯甲苯在环己烷中的吸收光谱在环己烷中的吸收光谱苯苯(254nm)甲苯甲苯(262nm)A 230 250 270 25 入射光、透过光入射光、透过光入射光反射光分散光吸收光透过光 用蒸馏水或溶剂作为“空白”校正反射光、分散光，得：入射光（I0
11、）吸收光透过光（It）26Lambert-Beer定律定律 DK C L 吸光度吸光度 摩尔消光系数摩尔消光系数 吸收物质的光径（吸收物质的光径（cm）溶液浓度（溶液浓度（mol/L）272.2.3 2.2.3 分光光度法分析的依据：分光光度法分析的依据：物质对光是有选择的吸收，其吸收光谱取决于物质的结构，这就是分光光度法定性分析的依据；其吸收光谱的强度与物质的浓度有关，这是分光光度法定量分析的依据。28光光 电电29分光光度计上常用的光源有两种：近紫外光区 可见光区 钨丝灯 近红外光 紫外光区 氢灯、氘灯302.3.2 2.3.2 单色器单色器 是把混合光波分解为单一波长光的装置。棱镜：光波
12、通过棱镜时，不同波长的光折射率不同，折射率与波长成负相关。衍射光栅:在石英或玻璃的表面刻划许多平行线，通过光的干涉和衍射，形成光谱。狭缝:由一对隔板在光通路上形成的缝隙，通过调节缝隙的大小调节入射单色光的强度，以适应检测器的需要。31棱镜：棱镜：依据不同波长光通过棱镜时折射率不同32入射狭缝入射狭缝准直透镜准直透镜棱镜棱镜聚焦透镜聚焦透镜出射狭缝出射狭缝白光白光红红紫紫1 12 2800 600 500400 或称比色杯、比色皿、比色池，是用来盛装被测溶液和决定透光液层厚度的器件。一般由玻璃或石英制成。注意注意：a.与光束垂直；b.规格相同；c.清洁。33 光 电，并逐级放大。电流表、记录器和
13、数字示值读数单元。34722722型分光光度计结构方框型分光光度计结构方框图图光光源源吸收池吸收池检测系统检测系统分光分光系统系统352.4.1 2.4.1 紫外分光光度法检测紫外分光光度法检测DNADNA的原理的原理原理：原理：核酸分子含有嘌呤环和嘧啶环的共轭双键，在260nm处有特异的紫外吸收峰，其吸收强度与核酸浓度成正比。优点优点：简单、快速、灵敏、样品可以回收。缺点：缺点：有一定的误差（原因）；受蛋白类物质干扰。36产生误差的原因：产生误差的原因：1.单色性不纯的影响；2.杂散光的影响；3.比色皿的影响；4.温度、pH值的影响；5.吸光度读数时的误差。37：1.0.1TE作为空对照,在波长260nm、280nm、310nm处分别测标准DNA样品的OD值2.根据OD值计算DNA浓度（g/ml）单链DNAssDNA=33(OD260OD310)稀释倍数双链DNAdsDNA=50(OD260OD310)稀释倍数3.DNA的纯度鉴定 OD260/OD280=1.8 （RNA为2.0）1.8 可能有RNA污染 1.8 可能有蛋白质污染38思考题？思考题？为什么要对重组质粒为什么要对重组质粒DNA进行双酶切？进行双酶切？质粒质粒DNA泳动速度与哪些因素有关？泳动速度与哪些因素有关？分光光度法有哪些用处？分光光度法有哪些用处？39
分子医学技能实验：实验五 酶切鉴定紫外分光光度检测DNA含量
