电泳学基础课件

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1、第二章第二章 电泳学基础电泳学基础一、一、定义及原理1 1、电泳：、电泳：是指带电粒子在电场中向与其自身带相反电荷的电极移动是指带电粒子在电场中向与其自身带相反电荷的电极移动的现象。的现象。2 2、原理、原理 电泳技术就是利用在电场作用下，由于待分离样品中各种分子带电泳技术就是利用在电场作用下，由于待分离样品中各种分子带电性质以及分子本身大小、性状等性质的差异，使带电分子产生不同电性质以及分子本身大小、性状等性质的差异，使带电分子产生不同的迁移速度，从而对样品进行分离、鉴定或提纯。的迁移速度，从而对样品进行分离、鉴定或提纯。迁移率与带电分子所带净电荷成正比，与分子的大小和缓冲液的迁移率与带电分

2、子所带净电荷成正比，与分子的大小和缓冲液的黏度成反比。黏度成反比。3 3、应用：、应用：电泳技术除了用于小分子物质电泳技术除了用于小分子物质(无机盐、氨基酸、核苷酸、无机盐、氨基酸、核苷酸、脂类脂类)的分离分析外，最主要用于生物大分子的分离分析外，最主要用于生物大分子(蛋白质、核酸、酶蛋白质、核酸、酶)的研究。的研究。以生物大分子为例阐明电荷来源以生物大分子为例阐明电荷来源RCOOHNH3+RCOO-NH3+RCOO-NH2+OH-+H+OH-+H+pHpIpH=pIpH3Si-O-+H+Si-OH硅羟基的电离硅羟基的电离SiO-SiSiO-SiSiO-SiO-SiOOO-O-O-HHHHHH

3、H毛细管内液体毛细管内液体当毛细管内充满水时，会出现双电层：当毛细管内充满水时，会出现双电层：SiOSiSiOSiSiOSiOSiOOOOOHHHNa+Na+Na+Na+毛细管内液体毛细管内液体当毛细管内液体为当毛细管内液体为pH 7.0 磷酸二氢钠与磷酸氢二钠缓冲液磷酸二氢钠与磷酸氢二钠缓冲液-电渗和电泳电渗和电泳+v电渗电渗 电渗是一种电渗是一种液体相对于带电管壁移动液体相对于带电管壁移动的现象。水合离子的现象。水合离子引起的流体整体移动。是毛细管内液体及其中引起的流体整体移动。是毛细管内液体及其中所有组分共有所有组分共有的现象，包括溶剂、各种溶质（带电离子与中性分子）的现象，包括溶剂、各

4、种溶质（带电离子与中性分子）v电泳电泳 电泳是带电离子在电场作用下的定向移动。是电泳是带电离子在电场作用下的定向移动。是毛细管毛细管内带电离子内带电离子的特有现象，中性分子无电泳现象。的特有现象，中性分子无电泳现象。SiOSiSiOSiSiOSiOSiOOOOO-Na+Cl-电渗电渗电泳电泳电泳电泳 迁移速度迁移速度Na+Cl-矢量速度矢量速度合速度合速度+随着迁移速度不同，逐渐形成样品谱带随着迁移速度不同，逐渐形成样品谱带,依次在检测依次在检测窗口被检测窗口被检测Na+Cl-+Na+Cl-Na+Cl-+毛细管电泳区带电泳法分离硝基苯酚毛细管电泳区带电泳法分离硝基苯酚 对硝基苯酚对硝基苯酚 7

5、.15邻硝基苯酚邻硝基苯酚 7.22间硝基苯酚间硝基苯酚 8.39 pKa硝基苯酚的电离硝基苯酚的电离O-NO2OHNO2电离后，硝基苯酚负电荷含量硝基苯酚受电场作用力pKa 对对邻邻邻邻间间F 对对邻邻间间电泳速度电泳速度 对对邻邻间间电渗速度不变合速度合速度 对对邻邻间间出峰顺序：间、邻、对出峰顺序：间、邻、对2、等速电泳等速电泳(ITP)等速现象：等速现象：电泳静态达到后，被分离的离子淌度按顺序性梯电泳静态达到后，被分离的离子淌度按顺序性梯形递减。形递减。1964年，由于年，由于Everaerts和和Martin的重要贡献，的重要贡献，ITP正式诞生。正式诞生。在研究中，他们发现在在研究

6、中，他们发现在ITP达到静态后，所有被分离的离子以达到静态后，所有被分离的离子以相同的速度移动。因此，他们命名这一分离工具为相同的速度移动。因此，他们命名这一分离工具为iso-tach-phoresis(iso=equal=相等，相等，tach=velocity=速度，速度，phoresis=electrophoresis=电泳电泳)。1.1.将两种淌度差别很大的缓冲液分别作为前导离子将两种淌度差别很大的缓冲液分别作为前导离子(充满充满毛细管毛细管)和尾随离子（置于一端的电泳槽中），试样离子的和尾随离子（置于一端的电泳槽中），试样离子的淌度全部位于两者之间，并以同一速度移动。淌度全部位于两者之

7、间，并以同一速度移动。2.2.前导电解质的迁移率高于任何样品组分，后者则低于前导电解质的迁移率高于任何样品组分，后者则低于任何样品组分，被分离的组分按其不同的迁移率夹在中间，任何样品组分，被分离的组分按其不同的迁移率夹在中间，在强电场的作用下，各被分离组分在前导电解质与尾随电解在强电场的作用下，各被分离组分在前导电解质与尾随电解质之间的空隙中移动，实现分离。质之间的空隙中移动，实现分离。等速电泳图示等速电泳图示 3.3.不同离子的淌度不同，不同离子的淌度不同，所形成区带的电场强度不同所形成区带的电场强度不同(=(=mE)mE)，淌度大的离子区带，淌度大的离子区带电场强度小。电场强度小。n在等速

8、电泳达到静态后，所有的被分离的区带以相同的速度在等速电泳达到静态后，所有的被分离的区带以相同的速度向前移动，移动最快的离子为向前移动，移动最快的离子为前导离子前导离子（leading ionleading ion），迁），迁移最慢的离子为移最慢的离子为尾随离子尾随离子（terminating ionterminating ion），其它迁移速），其它迁移速度介于两者之间的离子按速度大小依次分离。分离后的区带度介于两者之间的离子按速度大小依次分离。分离后的区带为近矩形，不同离子的区带与区带之间为为近矩形，不同离子的区带与区带之间为“肩并肩肩并肩”的形式。的形式。n在等速电泳中，区带之间的界面是非

9、常清晰的。这是由于存在等速电泳中，区带之间的界面是非常清晰的。这是由于存在在“自校正效应自校正效应”或或“自锐利效应自锐利效应”。如果前导离子扩散。如果前导离子扩散进入邻近的区带，由于前导离子淌度高于邻近的离子淌度，进入邻近的区带，由于前导离子淌度高于邻近的离子淌度，在邻近区带内前导离子速度会高于邻近离子速度，结果扩散在邻近区带内前导离子速度会高于邻近离子速度，结果扩散进入邻近区带的前导离子重新迁移回自己的区带。分析其它进入邻近区带的前导离子重新迁移回自己的区带。分析其它离子的扩散迁移会得到类似的结果。离子的扩散迁移会得到类似的结果。n特点：界面明显，富集、浓缩作用。特点：界面明显，富集、浓缩

10、作用。等电聚焦电泳等电聚焦电泳等电聚焦电泳（等电聚焦电泳（IFE，isoelectric focusing electrophoresis）：）：利用特殊的一种缓冲液（两性电解质）在凝胶（常用聚利用特殊的一种缓冲液（两性电解质）在凝胶（常用聚丙烯酰胺凝胶）内制造一个丙烯酰胺凝胶）内制造一个pH梯度，电泳时每种蛋白质就将梯度，电泳时每种蛋白质就将迁移到等于其迁移到等于其等电点（等电点（pI）的）的pH处（此时此蛋白质不再带有处（此时此蛋白质不再带有净的正或负电荷），净的正或负电荷），最后，样品的各组分在各自的等电点聚最后，样品的各组分在各自的等电点聚焦成一条清晰而稳定的窄带。焦成一条清晰而稳定的

11、窄带。Pr为两性电解质，不同为两性电解质，不同Pr的的pI不同，不同，pI范围窄且净电荷范围窄且净电荷为零，因此依为零，因此依pI分离分离Pr。EF是在凝胶中加两性载体电解质，通直流电后，可形成是在凝胶中加两性载体电解质，通直流电后，可形成从阳极到阴极逐步增加的从阳极到阴极逐步增加的pH梯度梯度(连续的连续的,稳定的稳定的,线性的线性的pH)。当当Pr在电场中迁移到它的在电场中迁移到它的PI时，由于净电荷为零，不再移时，由于净电荷为零，不再移动。如扩散，附近的凝胶会使其荷电阳、阴极会重新吸引它动。如扩散，附近的凝胶会使其荷电阳、阴极会重新吸引它回到回到pI位置。因此位置。因此Pr只能在只能在p

12、I位置被浓缩成窄、稳定的带。称位置被浓缩成窄、稳定的带。称这种浓缩效应为聚焦。这种浓缩效应为聚焦。只要凝胶中的只要凝胶中的pH梯度范围足够窄。便可将梯度范围足够窄。便可将pI相近的相近的Pr分分开，开，EF是电泳技术中分辨率最高的技术。是电泳技术中分辨率最高的技术。原理原理关键：关键：pH梯度的建立梯度的建立产生产生pH梯度的方法通常有两种：梯度的方法通常有两种：一种是用两种不同一种是用两种不同pH的缓冲液互相扩散，在混合区形成的缓冲液互相扩散，在混合区形成pH梯度，称为梯度，称为人工人工pH梯度梯度。但这种。但这种pH梯度不很稳定，常用于制备梯度不很稳定，常用于制备电泳。电泳。另一种是利用两

13、性电解质载体（另一种是利用两性电解质载体（Carrier ampholytes）在电）在电场的作用下自然形成场的作用下自然形成pH梯度，称为梯度，称为天然天然pH梯度梯度。方法方法 理想的载体两性电解质的合成理想的载体两性电解质的合成 用具有几个用具有几个pH值很相近的多乙烯多胺（如五乙烯六值很相近的多乙烯多胺（如五乙烯六胺）为原料，与不饱和酸（如丙烯酸）发生加合反应：加胺）为原料，与不饱和酸（如丙烯酸）发生加合反应：加合反应优先加在合反应优先加在、不饱和酸的不饱和酸的碳原子上，调节胺和酸碳原子上，调节胺和酸的比例可以加上一个或多个羧基，这种合成方法与一般有的比例可以加上一个或多个羧基，这种合

14、成方法与一般有机会合成不同，有机合成一般要求合成的产物愈纯愈好，机会合成不同，有机合成一般要求合成的产物愈纯愈好，而这里要求而这里要求合成出的产物愈复杂愈好合成出的产物愈复杂愈好，要有多异构物和同，要有多异构物和同系物，以保证的很多具有系物，以保证的很多具有不同而又互相接近的不同而又互相接近的pK值和值和pI值，从而得到平滑的值，从而得到平滑的pH梯度梯度。载体两性电解质的等电点。载体两性电解质的等电点在在pH3-10的范围，分子量在的范围，分子量在300-1000之间。之间。等电聚焦电泳示意图 上图左以A，B两种蛋白质为例，作出它们的净电荷曲线图，横轴代表环境中的pH值，纵轴代表蛋白質的净电

15、荷，在pH 6.5时，A带有两个正电荷，B带有一个负电荷。使A与B的净电荷为0的pH值分別为pH9和pH5，这就是它们的等电点。IEF是在具有pH梯度环境中进行的电泳。将蛋白质置于不同pH梯度的胶体进行电泳，它会朝着与自身所带电荷相反的电极方向移动，直到抵达等电点（pI）相同的pH值处才停止，如果它移到別的pH处，会因为带电而再度移动到和它pI相符的pH处。n优点：优点：使用两性载体电解质，在电极之间形成稳定、连续、使用两性载体电解质，在电极之间形成稳定、连续、线性的线性的pH梯度；由于梯度；由于“聚焦效应聚焦效应”，即使很小的样品也，即使很小的样品也能获得清晰、鲜明的区带界面；电泳速度快；分

16、辨率能获得清晰、鲜明的区带界面；电泳速度快；分辨率高高;加入样品的位置可任意选择；可用于测定蛋白质类加入样品的位置可任意选择；可用于测定蛋白质类物质的等电点；适用于中、大分子量（如蛋白质、肽类、物质的等电点；适用于中、大分子量（如蛋白质、肽类、同工酶等）生物组分的分离分析。同工酶等）生物组分的分离分析。n缺点：缺点：等电聚焦要求用无盐溶液，而在无盐溶液中蛋白质等电聚焦要求用无盐溶液，而在无盐溶液中蛋白质可能发生沉淀；样品中的成分必须停留在其等电点处，不可能发生沉淀；样品中的成分必须停留在其等电点处，不适用于在等电点不溶或发生变性的蛋白质适用于在等电点不溶或发生变性的蛋白质等电聚焦电泳的特点及应

17、用等电聚焦电泳的特点及应用 第一向采用等电聚焦第一向采用等电聚焦 根据复杂的蛋白质成分根据复杂的蛋白质成分中各个蛋白质的中各个蛋白质的PIPI的不同，将蛋白质进行分离。的不同，将蛋白质进行分离。第二向采用了十二烷基硫酸钠一聚丙烯酰胺凝第二向采用了十二烷基硫酸钠一聚丙烯酰胺凝胶电泳胶电泳 （SDS-PAGESDS-PAGE）就是按蛋白质分子量的大小）就是按蛋白质分子量的大小使其在垂直方向进行分离。其结果不再是条带状，使其在垂直方向进行分离。其结果不再是条带状，而是呈现为斑点状而是呈现为斑点状。5 5、双向凝胶电泳（二维电泳）、双向凝胶电泳（二维电泳）胶性 PH9中电加解入质了溶双液 PH3加上电

18、场后建立稳定PH梯度蛋白质溶液加入，建立电场染色后，蛋白质因PI值不同，沿PH梯度分离开第一向等电聚焦等电聚焦PI逐渐降低等电聚焦胶放在SDS聚丙烯酰胺凝胶上 第二向SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分子量逐渐降低PI 逐渐降低 06-07 双向凝胶电泳示意图双向凝胶电泳示意图免疫电泳是免疫电泳是琼脂平板电泳琼脂平板电泳和和双相免疫扩散双相免疫扩散两种方法的结合。两种方法的结合。将抗原样品在琼脂平板上先进行电泳，使其中的各种成分因将抗原样品在琼脂平板上先进行电泳，使其中的各种成分因电泳迁移率的不同而彼此分开，然后加入抗体做双相免疫扩电泳迁移率的不同而彼此分开，然后加入抗体做双相免疫扩散，把已分离的各抗原成分与抗体在琼脂中扩散而相遇，在散，把已分离的各抗原成分与抗体在琼脂中扩散而相遇，在二者比例适当的地方，形成肉眼可见的沉淀弧。二者比例适当的地方，形成肉眼可见的沉淀弧。5 5、免疫电泳、免疫电泳名词解释名词解释 电泳、电泳分离技术、电泳淌度、电泳、电泳分离技术、电泳淌度、电渗流、区带电泳、双电层电渗流、区带电泳、双电层