微生物发酵产酶

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1、第二节第二节 常见产酶微生物常见产酶微生物 Common microorganism in Enzyme Production用于酶生产的微生物特点用于酶生产的微生物特点l酶产量高酶产量高l容易培养和管理容易培养和管理l产酶稳定性好产酶稳定性好l利于酶分离纯化利于酶分离纯化l安全可靠无毒性安全可靠无毒性筛选、诱变、基因克隆等技术。并及时复壮筛选、诱变、基因克隆等技术。并及时复壮微生物易于与杂质分离、易于与酶分离微生物易于与杂质分离、易于与酶分离不对人体、环境产生影响；不对酶的应用产生影响不对人体、环境产生影响；不对酶的应用产生影响基本要求：基本要求：l不是致病菌不是致病菌l发酵周期短，产酶量高

2、发酵周期短，产酶量高l不易变异退化不易变异退化l最好是产生胞外酶的菌种最好是产生胞外酶的菌种,利于分离。利于分离。l对医药和食品用酶对医药和食品用酶,还应考虑安全性：还应考虑安全性：l凡从可食部分或食品加工中传统使用的微生物生产的酶凡从可食部分或食品加工中传统使用的微生物生产的酶,安全安全!l由非致病微生物制取的酶，需作短期毒性实验。由非致病微生物制取的酶，需作短期毒性实验。l非常见微生物制取的酶，需做广泛的毒性实验，包括慢性非常见微生物制取的酶，需做广泛的毒性实验，包括慢性中毒实验。中毒实验。一、细菌一、细菌形态：短杆或长杆状，形态：短杆或长杆状，3.0 um，革兰氏阴性，运动，革兰氏阴性，

3、运动(周毛周毛)或或不运动，无芽孢，一般无荚膜。不运动，无芽孢，一般无荚膜。菌落呈白色至黄白色，扩展，光菌落呈白色至黄白色，扩展，光滑，闪光。滑，闪光。Escherich属菌株和大多数大肠杆菌是无害，但也有些大肠杆属菌株和大多数大肠杆菌是无害，但也有些大肠杆菌是致病的，会引起腹泻和尿路感染。菌是致病的，会引起腹泻和尿路感染。大肠杆菌的名声主要因它易于在实验室操作、生长迅速，而大肠杆菌的名声主要因它易于在实验室操作、生长迅速，而且营养要求低。且营养要求低。应用：应用：大肠杆菌能作为宿主供大量的细菌病毒生长繁殖大肠杆菌能作为宿主供大量的细菌病毒生长繁殖大肠杆菌也是最早用作大肠杆菌也是最早用作基因工

4、程的宿主菌基因工程的宿主菌工业上生产工业上生产谷氨酸脱羧酶、天冬酰胺酶谷氨酸脱羧酶、天冬酰胺酶和制备天冬氨酸、和制备天冬氨酸、苏氨酸及缬氨酸等苏氨酸及缬氨酸等测谷氨酸含量测谷氨酸含量等等对白血病有显对白血病有显著疗效著疗效l直状、近直状的杆菌，直状、近直状的杆菌，周生或侧生鞭毛，周生或侧生鞭毛，革兰革兰氏阳性，无荚膜，芽孢氏阳性，无荚膜，芽孢0.50.51.51.5 1.81.8 m m，中生，中生或近中生。或近中生。l枯草芽孢杆菌是工业发枯草芽孢杆菌是工业发酵的重要菌种之一。生酵的重要菌种之一。生产淀粉酶、蛋白酶、产淀粉酶、蛋白酶、5 5-核苷酸酶、某些氨核苷酸酶、某些氨基酸及核苷。基酸及核

5、苷。二、放线菌二、放线菌l具有分枝状菌丝的单细胞原核微生物。革兰氏阳性，菌丝具有分枝状菌丝的单细胞原核微生物。革兰氏阳性，菌丝有气生菌丝和基内菌丝之分。常用于酶生产的主要为链霉有气生菌丝和基内菌丝之分。常用于酶生产的主要为链霉菌。菌。应用：主要生产葡萄糖异应用：主要生产葡萄糖异构酶，还可生产青霉素酰构酶，还可生产青霉素酰化酶、纤维素酶、碱性蛋化酶、纤维素酶、碱性蛋白酶、几丁质酶等。白酶、几丁质酶等。三、霉菌三、霉菌l分类学上属于藻状菌纲，毛霉目，分类学上属于藻状菌纲，毛霉目，根霉属。根霉属。l根霉因有假根（根霉因有假根（Rhizoid）而得）而得名（假根的功能是在培养基上固名（假根的功能是在培

6、养基上固着，并吸收营养）。着，并吸收营养）。l分布于土壤、空气中，常见于淀分布于土壤、空气中，常见于淀粉食品上，可引起霉腐变质和水粉食品上，可引起霉腐变质和水果、蔬菜的腐烂。果、蔬菜的腐烂。代表种代表种 米根霉（米根霉（R.oryzae)黑根霉黑根霉(R.nigrican)等。等。应用应用 根霉能产生一些酶类，如淀粉酶、果胶酶根霉能产生一些酶类，如淀粉酶、果胶酶、脂肪酶等，是生产这些酶类的菌种。、脂肪酶等，是生产这些酶类的菌种。在在酿酒工业上常用做糖化菌。有些根霉还能酿酒工业上常用做糖化菌。有些根霉还能产生乳酸、延胡索酸等有机酸。产生乳酸、延胡索酸等有机酸。l分类：多数属于子囊菌分类：多数属于

7、子囊菌亚门，少数属于半知菌亚门，少数属于半知菌亚门。亚门。l分布：广泛分布于土壤分布：广泛分布于土壤、空气和谷物上，可引、空气和谷物上，可引起食物、谷物和果蔬的起食物、谷物和果蔬的霉腐变质，有的可产生霉腐变质，有的可产生致癌性的黄曲霉毒素。致癌性的黄曲霉毒素。l代表种：代表种：黑曲霉黑曲霉Asp.Niger、黄曲霉和米曲霉、黄曲霉和米曲霉l应用：应用：是制酱、酿酒、制醋的主要菌种。是生产是制酱、酿酒、制醋的主要菌种。是生产酶制剂（蛋白酶、淀粉酶、果胶酶）的菌种。生酶制剂（蛋白酶、淀粉酶、果胶酶）的菌种。生产有机酸（如柠檬酸、葡萄糖酸等）。农业上用产有机酸（如柠檬酸、葡萄糖酸等）。农业上用作生产

8、糖化饲料的菌种。作生产糖化饲料的菌种。四、酵母四、酵母l啤酒酵母：啤酒工业广泛应啤酒酵母：啤酒工业广泛应用，此外，还可生产转化酶用，此外，还可生产转化酶l假丝酵母：生产脂肪酶等假丝酵母：生产脂肪酶等五、酶的发酵工艺条件与控制五、酶的发酵工艺条件与控制 The fermentation principles and its control of enzyme production1、培养基、培养基微生物微生物动物动物（异养）（异养）异养自养绿色植物绿色植物（自养）（自养）碳源碳源糖类、脂肪糖、醇、有机酸等二氧化碳、碳酸盐等二氧化碳氮源氮源蛋白质及其降解物蛋白质及其降解物、有机氮化物、无机氮化物、

9、氮无机氮化物、氮无机氮化物能源能源与碳源同与碳源同氧化无机物或利用日光能利用日光能生长因子生长因子维生素有些需要维生素等生长因子不需要不需要无机元素无机元素无机盐无机盐无机盐无机盐水分水分水水水水各种生物对营养的需求各种生物对营养的需求1、选择适宜的营养物质、选择适宜的营养物质2、营养物的浓度及配比合适、营养物的浓度及配比合适3、物理、化学条件适宜、物理、化学条件适宜4、经济节约、经济节约5、精心设计、试验比较、精心设计、试验比较培养不同的微生物必须采用不同的培养条件；培养不同的微生物必须采用不同的培养条件；培养目的不同，原料的选择和配比不同；培养目的不同，原料的选择和配比不同；不同阶段，培养

10、条件也有所差异。不同阶段，培养条件也有所差异。培养基的设计原则培养基的设计原则五大要素：碳源、氮源、无机盐、生长因子、水五大要素：碳源、氮源、无机盐、生长因子、水培养基几乎是一切对微生物进行研究和利用工作的基础培养基几乎是一切对微生物进行研究和利用工作的基础培养基（培养基（medium）是人工配制的，适合微生物生长繁）是人工配制的，适合微生物生长繁殖或产生代谢产物的营养基质。殖或产生代谢产物的营养基质。构成细胞物质或代谢产物中碳架构成细胞物质或代谢产物中碳架 碳源可作能源，为生命活动提供能量碳源可作能源，为生命活动提供能量常用碳源：糖类、醇类、脂类、有机酸、烃类、蛋白常用碳源：糖类、醇类、脂类

11、、有机酸、烃类、蛋白质及其降解物质及其降解物异养微生物：糖类是最好碳源（葡萄糖最为通用）异养微生物：糖类是最好碳源（葡萄糖最为通用）水是微生物最基本的组成分（水是微生物最基本的组成分（）水是微生物体内和体外的溶剂（吸收营养成分和代谢废物）水是微生物体内和体外的溶剂（吸收营养成分和代谢废物）水是细胞质组分，直接参与各种代谢活动水是细胞质组分，直接参与各种代谢活动调节细胞温度和保持环境温度的稳定（比热高，传热快）调节细胞温度和保持环境温度的稳定（比热高，传热快）水水碳源碳源选择合适碳源，以适应目的酶的合成调节机制选择合适碳源，以适应目的酶的合成调节机制特别注意诱导特别注意诱导与阻遏作用！与阻遏作用

12、！自来水？！自来水？！超纯水？！超纯水？！构成细胞物质和代谢产物中氮素（不能用作能源构成细胞物质和代谢产物中氮素（不能用作能源 ）氮源有机氮源蛋白胨、酵母膏、牛肉膏无机氮源铵盐、硝酸盐 参与酶的组成、构成酶活性基、激活酶活性参与酶的组成、构成酶活性基、激活酶活性维持细胞结构的稳定性维持细胞结构的稳定性调节细胞渗透压调节细胞渗透压控制细胞的氧化还原电位控制细胞的氧化还原电位有时可作某些微生物生长的能源物质有时可作某些微生物生长的能源物质 常用：硫酸盐、常用：硫酸盐、磷酸盐、氯化物磷酸盐、氯化物以及含有钾、钠、以及含有钾、钠、钙、镁、铁等元钙、镁、铁等元素的化合物。素的化合物。氮源氮源无机盐无机盐

13、需要注意合适的碳氮比需要注意合适的碳氮比生长因子生长因子是指某些微生物不能用普通的碳源、氮源物质进生长因子是指某些微生物不能用普通的碳源、氮源物质进行合成，而必须另外加入少量的生长需求的有机物质。行合成，而必须另外加入少量的生长需求的有机物质。分类：分类：化学结构分成维生素、氨基酸、嘌呤（或嘧啶）及其衍化学结构分成维生素、氨基酸、嘌呤（或嘧啶）及其衍生物和类脂成分生物和类脂成分 等四类等四类功能：以辅酶与辅基的形式参与代谢中的酶促反应功能：以辅酶与辅基的形式参与代谢中的酶促反应 实验室中常用酵母膏、蛋白胨、牛肉膏等作为各种生长因实验室中常用酵母膏、蛋白胨、牛肉膏等作为各种生长因子的的需要，麦芽

14、汁、米曲汁等天然培养基中本身含有各子的的需要，麦芽汁、米曲汁等天然培养基中本身含有各种生长因子种生长因子 实验室的常用培养基：实验室的常用培养基：细菌：细菌：牛肉膏蛋白胨培养基（或简称普通肉汤培养基）；牛肉膏蛋白胨培养基（或简称普通肉汤培养基）；放线菌：高氏放线菌：高氏1 1号合成培养基培养；号合成培养基培养；酵母菌：麦芽汁培养基；酵母菌：麦芽汁培养基；霉菌：霉菌：查氏合成培养基；查氏合成培养基；例如枯草芽孢杆菌：例如枯草芽孢杆菌：一般培养：肉汤培养基或一般培养：肉汤培养基或LBLB培养基；培养基；自然转化：基础培养基；自然转化：基础培养基；观察芽孢：生孢子培养基；观察芽孢：生孢子培养基；产蛋

15、白酶：以玉米粉、黄豆饼粉为主的产酶培养基；产蛋白酶：以玉米粉、黄豆饼粉为主的产酶培养基；l枯草杆菌枯草杆菌BF7658-BF7658-淀粉酶发酵培养基淀粉酶发酵培养基：玉米粉8%，豆饼粉4%，磷酸氢二钠 0.8%，硫酸铵0.4%，氯化钙0.2%，氯化按0.15%（自然pH）。l枯草杆菌中性蛋白酶发酵培养基枯草杆菌中性蛋白酶发酵培养基：玉米粉4%，豆饼粉3%，麸皮3.2%,糠1%,磷酸氢二钠0.4%,磷酸二氢钾0.03%（自然pH）。l黑曲霉糖化酶发酵培养基黑曲霉糖化酶发酵培养基：玉米粉10%，豆饼粉4%，麸皮1%（）。l地衣芽孢杆菌地衣芽孢杆菌27092709碱性蛋白酶发酵培养基碱性蛋白酶发酵

16、培养基：玉米粉5.5%,豆饼4%,磷酸氢二钠0.4%,磷酸二氢钾0.03%(pH 8.5)。l黑曲霉酸性蛋白酶发酵培养基黑曲霉酸性蛋白酶发酵培养基:玉米粉6%,豆饼粉4%,玉米浆0.6%,氯化钙0.5%,氯化铵1%,磷酸氢二钠0.2%(pH 5.5)。l游动放线菌葡萄糖异构酶发酵培养基游动放线菌葡萄糖异构酶发酵培养基：糖蜜2%，豆饼粉2%，磷酸氢二钠0。1%，硫酸镁0。05%(pH 7.2)。l桔青霉磷酸二酯酶发酵培养基桔青霉磷酸二酯酶发酵培养基：淀粉水解糖5%，蛋白胨0.5%,硫酸镁0.05%,氯化钙0.04%,磷酸氢二钠0.05%,磷酸二氢钾0.05%(自然pH)。l黑曲霉果胶酶发酵培养基

17、黑曲霉果胶酶发酵培养基:麸皮5%,果胶0.3%,硫酸铵2%,磷酸二氢钾0.25%,硫酸镁0.05%,硝酸钠0.02%,硫酸亚铁0.001%(自然pH)。l枯草杆菌碱性磷酸酶发酵培养基枯草杆菌碱性磷酸酶发酵培养基:葡萄糖0.4%,乳蛋白水解物0.1%,硫酸铵1%,氯化钾0.1%,氯化钙0.1mmol/L,氯化镁1.0mmol/L,磷酸氢二钠20mol/L(用的Tris-HCl缓冲液配制)2 2、发酵条件及控制、发酵条件及控制l发酵过程中的代谢变化发酵过程中的代谢变化l与代谢变化有关的参数与代谢变化有关的参数l物理参数物理参数温度、压力、搅拌转速、搅拌功率、溶温度、压力、搅拌转速、搅拌功率、溶解氧

18、、其它。解氧、其它。l化学参数化学参数基质浓度、基质浓度、pH、酶活力、酶活力l生物参数生物参数菌体形态、菌体浓度、其它。菌体形态、菌体浓度、其它。l生化代谢曲线生化代谢曲线l菌体生长阶段菌体生长阶段l产酶阶段产酶阶段l菌体自溶阶段菌体自溶阶段l影响产酶的几个重要条件l温度通常在生物学范围内每通常在生物学范围内每升高升高1010，生长速度就，生长速度就加快一倍，所以温度直加快一倍，所以温度直接影响酶反应，对于微接影响酶反应，对于微生物来说，温度直接影生物来说，温度直接影响其生长和合成酶。响其生长和合成酶。培养基中的营养物质被合成为菌体细胞物质和酶的生化反应是吸培养基中的营养物质被合成为菌体细胞

19、物质和酶的生化反应是吸热反应；菌体生长时培养物质被大量分解，是放热反应。热反应；菌体生长时培养物质被大量分解，是放热反应。菌体繁殖旺盛时，发酵液必须降温；发酵初期相反，需要保温。菌体繁殖旺盛时，发酵液必须降温；发酵初期相反，需要保温。lpH 细胞发酵产酶的最适细胞发酵产酶的最适pH值与生长最适值与生长最适pH值往往有所值往往有所不同。细胞生产某种酶的最适不同。细胞生产某种酶的最适pH值通常接近于该酶催化值通常接近于该酶催化反应的最适反应的最适pH值。值。培养基中培养基中C/N比值高，发酵液倾向于酸性，比值高，发酵液倾向于酸性，pH偏低；偏低；C/N比值低，发酵液倾向中性或碱性，比值低，发酵液倾

20、向中性或碱性，pH偏高。培养基偏高。培养基中的糖和脂肪被分解和同化时的氧化程度直接影响中的糖和脂肪被分解和同化时的氧化程度直接影响pH。在酶制剂生产中，控制发酵液在酶制剂生产中，控制发酵液pH的方法通常是调节培的方法通常是调节培养基的原始养基的原始pH，掌握原料的配比，保持一定的，掌握原料的配比，保持一定的C/N值；值；或添加缓冲剂使发酵液具备缓冲能力；调节通气量。或添加缓冲剂使发酵液具备缓冲能力；调节通气量。溶解氧的控制溶解氧的控制在酶的发酵生产过程中，在酶的发酵生产过程中，处于不同生长阶段的细胞，其处于不同生长阶段的细胞，其细胞浓度和细胞呼吸强度各不相同，致使耗氧速率有很细胞浓度和细胞呼吸

21、强度各不相同，致使耗氧速率有很大的差别。因此必须根据耗氧量的不同，不断供给适量大的差别。因此必须根据耗氧量的不同，不断供给适量的溶解氧。的溶解氧。细胞对溶解氧的需要量与细胞呼吸强度及细胞浓度细胞对溶解氧的需要量与细胞呼吸强度及细胞浓度密切相关，可以用耗氧速率密切相关，可以用耗氧速率KO2表示表示KO2=QO2*CC单位细胞量在单位时单位细胞量在单位时间内的耗氧量间内的耗氧量(mmol)/(h*L)呼吸强度呼吸强度细胞浓度细胞浓度g干细胞干细胞/L细胞对氧的需要量与细胞的呼级强度及培养基中细胞对氧的需要量与细胞的呼级强度及培养基中细胞浓度密切相关，两者均成正比关系细胞浓度密切相关，两者均成正比关

22、系l溶解氧的因素溶解氧的因素l搅拌搅拌增加气液接解的有效面积增加气液接解的有效面积增加湍动程度，减少气泡周围的液膜厚度增加湍动程度，减少气泡周围的液膜厚度液体形成涡流，延长气泡停留时间液体形成涡流，延长气泡停留时间阻止或减少菌丝结块阻止或减少菌丝结块l通风量和空气流速通风量和空气流速l空气分布管空气分布管l培养基的物理性质培养基的物理性质l发酵液柱高度发酵液柱高度l泡沫泡沫l泡沫的影响泡沫的影响泡沫的存在阻碍二氧化碳的排除，直接影响氧的溶解，进而泡沫的存在阻碍二氧化碳的排除，直接影响氧的溶解，进而影响微生物的生长繁殖和代谢产物的生成。影响微生物的生长繁殖和代谢产物的生成。泡沫层过高会外溢，浪费

23、原料且引起染菌。泡沫层过高会外溢，浪费原料且引起染菌。l消泡方法消泡方法机械消泡机械消泡消泡剂消泡（化学消泡）消泡剂消泡（化学消泡）l湿度湿度l固体发酵法生产酶制剂时，培养基的湿度固体发酵法生产酶制剂时，培养基的湿度和发酵室空气中的相对湿度对微生物菌体和发酵室空气中的相对湿度对微生物菌体的生长繁殖和产酶关系很大。的生长繁殖和产酶关系很大。l发酵过程的中间补料发酵过程的中间补料l补糖补糖l补氮补氮l补无机盐类和产酶促进剂补无机盐类和产酶促进剂l补全料和补水补全料和补水3 3、提高酶产量的措施、提高酶产量的措施 添加诱导物添加诱导物对于诱导酶的发酵生产，在发酵过程中的某个适宜的时机，对于诱导酶的发

24、酵生产，在发酵过程中的某个适宜的时机，添加适宜的诱导物，可以显著提高酶的产量。例如，乳糖添加适宜的诱导物，可以显著提高酶的产量。例如，乳糖诱导诱导-半乳糖苷酶，纤维二糖诱导纤维素酶，蔗糖甘油单半乳糖苷酶，纤维二糖诱导纤维素酶，蔗糖甘油单棕榈酸诱导蔗糖酶的生物合成等。棕榈酸诱导蔗糖酶的生物合成等。诱导物一般可以分为诱导物一般可以分为3 3类类 酶的作用底物酶的作用底物 酶的催化反应产物酶的催化反应产物 作用底物的类似物作用底物的类似物控制阻遏物的浓度控制阻遏物的浓度阻遏作用根据机理不同，可分为：产物阻遏和分阻遏作用根据机理不同，可分为：产物阻遏和分解代谢物阻遏两种。解代谢物阻遏两种。1.1.产物

25、阻遏作用是由酶催化作用的产物或者代谢产物阻遏作用是由酶催化作用的产物或者代谢途径的末端产物引起的阻遏作用。途径的末端产物引起的阻遏作用。2.2.分解代谢物阻遏作用是由分解代谢物（葡萄糖分解代谢物阻遏作用是由分解代谢物（葡萄糖等和其它容易利用的碳源等物质经过分解代谢而等和其它容易利用的碳源等物质经过分解代谢而产生的物质）引起的阻遏作用。产生的物质）引起的阻遏作用。控制阻遏物的浓度是解除阻遏、提高酶产量的有控制阻遏物的浓度是解除阻遏、提高酶产量的有效措施。效措施。枯草杆菌碱性磷酸酶的生物合成枯草杆菌碱性磷酸酶的生物合成为了减少或者解除分解代谢物阻遏作用，应当为了减少或者解除分解代谢物阻遏作用，应当

26、控控制培养基中葡萄糖等容易利用的碳源的浓度。制培养基中葡萄糖等容易利用的碳源的浓度。采用其他较难利用的碳源，如淀粉等采用其他较难利用的碳源，如淀粉等采用补料、分次流加碳源采用补料、分次流加碳源添加一定量的环腺苷酸（添加一定量的环腺苷酸（cAMP）对于受代谢途径末端产物阻遏的酶，可以通过对于受代谢途径末端产物阻遏的酶，可以通过控制末端控制末端产物的浓度的方法使阻遏解除。产物的浓度的方法使阻遏解除。添加表面活性剂添加表面活性剂表面活性剂可以与细胞膜相互作用，增加细胞的透过表面活性剂可以与细胞膜相互作用，增加细胞的透过性，有利于胞外酶的分泌，从而提高酶的产量。性，有利于胞外酶的分泌，从而提高酶的产量

27、。将适量的将适量的非离子型表面活性剂非离子型表面活性剂，如，如吐温（吐温（TweenTween）、特里）、特里顿顿(Triton)(Triton)等添加到培养基中，可以加速胞外酶的分泌，等添加到培养基中，可以加速胞外酶的分泌，而使酶的产量增加。而使酶的产量增加。由于由于离子型表面活性剂对细胞有毒害作用离子型表面活性剂对细胞有毒害作用，尤其是季胺，尤其是季胺型表面活性剂（如型表面活性剂（如新洁而灭新洁而灭等）是消毒剂，对细胞等）是消毒剂，对细胞的毒性较大，不能在酶的发酵生产中添加到培养基中。的毒性较大，不能在酶的发酵生产中添加到培养基中。添加产酶促进剂添加产酶促进剂 产酶促进剂是指产酶促进剂是指

28、可以促进产酶、但是作用机理未可以促进产酶、但是作用机理未阐明清楚的物质阐明清楚的物质。例如，添加一定量的植酸钙镁，。例如，添加一定量的植酸钙镁，可使霉菌蛋白酶或者桔青霉磷酸二酯酶的产量提可使霉菌蛋白酶或者桔青霉磷酸二酯酶的产量提高高1 12020倍；添加聚乙烯醇（倍；添加聚乙烯醇（Polyvinyl Polyvinyl alcoholalcohol）可以提高糖化酶的产量。产酶促进剂）可以提高糖化酶的产量。产酶促进剂对不同细胞、不同酶的作用效果各不相同，现在对不同细胞、不同酶的作用效果各不相同，现在还没有规律可循，还没有规律可循，要通过试验确定所添加的产酶要通过试验确定所添加的产酶促进剂的种类和浓度促进剂的种类和浓度。