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1、Chapter 4 Stability and Stabilizing of Enzyme第四章第四章 酶蛋白的稳定性和稳定化酶蛋白的稳定性和稳定化第一节第一节 前前 言言o 酶蛋白的稳定性酶蛋白的稳定性o 是指酶蛋白抵抗各种要素的影响，坚持其生物是指酶蛋白抵抗各种要素的影响，坚持其生物活力的才干。酶特定的空间构造决议其生物活性，因活力的才干。酶特定的空间构造决议其生物活性，因此稳定化的结果就是坚持其空间构造。此稳定化的结果就是坚持其空间构造。o 研讨酶蛋白的稳定性不仅对齐根底实际的研讨具有研讨酶蛋白的稳定性不仅对齐根底实际的研讨具有重要意义，对提高其操作和储存稳定性，扩展酶的运重要意义，对提
2、高其操作和储存稳定性，扩展酶的运用范围具有艰苦的适用价值。用范围具有艰苦的适用价值。第二节第二节 酶蛋白的稳定性及其变性机理酶蛋白的稳定性及其变性机理1.1.金属离子、底物、辅因子和其他低分子量配体的金属离子、底物、辅因子和其他低分子量配体的结协作用；结协作用；金属离子等经过与多肽链的结合稳定酶蛋金属离子等经过与多肽链的结合稳定酶蛋白的构象，添加酶蛋白的稳定性。白的构象，添加酶蛋白的稳定性。一、酶蛋白稳定性的分子缘由一、酶蛋白稳定性的分子缘由2.2.蛋白质蛋白质-蛋白质和蛋白质蛋白质和蛋白质-脂的作用脂的作用 酶蛋白在体内常与脂类或多糖构成复合物，酶蛋白在体内常与脂类或多糖构成复合物，添加酶蛋
3、白的稳定性。缘由是脂分子等结合到疏添加酶蛋白的稳定性。缘由是脂分子等结合到疏水簇上，屏蔽了酶蛋白外表的疏水区域，防止疏水簇上，屏蔽了酶蛋白外表的疏水区域，防止疏水簇与溶剂的接触。水簇与溶剂的接触。3.3.盐桥和氢键盐桥和氢键 酶蛋白分子中的盐桥对其构造的稳定性具有很显酶蛋白分子中的盐桥对其构造的稳定性具有很显著的作用。如：嗜热脂肪芽孢杆菌的甘油醛著的作用。如：嗜热脂肪芽孢杆菌的甘油醛-3-3-磷酸脱氢酶磷酸脱氢酶与来自兔子的嗜温脱氢酶的三维构造很类似，但嗜热酶亚与来自兔子的嗜温脱氢酶的三维构造很类似，但嗜热酶亚基间有盐桥，因此其变性温度和最适温度都比嗜温酶高约基间有盐桥，因此其变性温度和最适温
4、度都比嗜温酶高约2020。氢键能维持二级构造，但对酶蛋白稳定性影氢键能维持二级构造，但对酶蛋白稳定性影响不大。响不大。4.4.二硫键二硫键 酶蛋白的分子内交联可提高其在溶液中酶蛋白的分子内交联可提高其在溶液中的稳定性。酶蛋白中二硫键的构成，能显著添加的稳定性。酶蛋白中二硫键的构成，能显著添加酶蛋白的稳定性。酶蛋白的稳定性。Disulfide bond5.5.敏感氨基酸含量低敏感氨基酸含量低 酶蛋白的变性等反响容易发生在敏感的酶蛋白的变性等反响容易发生在敏感的氨基酸残基上，如活性部位的氨基酸被氧化是酶氨基酸残基上，如活性部位的氨基酸被氧化是酶蛋白失活最常见的景象。在稳定的嗜热酶中不稳蛋白失活最常
5、见的景象。在稳定的嗜热酶中不稳定氨基酸的数目明显比相应的嗜温酶蛋白中低。定氨基酸的数目明显比相应的嗜温酶蛋白中低。6.6.氨基酸残基的坚实装配氨基酸残基的坚实装配 酶蛋白的分子构造中有孔隙，通常这些酶蛋白的分子构造中有孔隙，通常这些孔隙被水分子所充溢。极性的水分子经过布朗运孔隙被水分子所充溢。极性的水分子经过布朗运动与蛋白质的疏水键接触会导致蛋白质不稳定。动与蛋白质的疏水键接触会导致蛋白质不稳定。假设酶蛋白的构造坚实，那么水分子从孔隙中被假设酶蛋白的构造坚实，那么水分子从孔隙中被除去，蛋白的稳定性也相应添加。除去，蛋白的稳定性也相应添加。酶蛋白中非极性侧链约占其总体积的一半，从酶蛋白中非极性侧
6、链约占其总体积的一半，从热力学上来说它们与水的接触是不利的，由于围绕热力学上来说它们与水的接触是不利的，由于围绕非极性基团的水分子，相对溶液中其他地方的水分非极性基团的水分子，相对溶液中其他地方的水分子来说更有序，构成一个封锁构造，或称为子来说更有序，构成一个封锁构造，或称为“笼形笼形构造。水分子彼此之间构成氢键，而且只是很脆弱构造。水分子彼此之间构成氢键，而且只是很脆弱地结合在封锁构造内的基团上。当发陌生水相互作地结合在封锁构造内的基团上。当发陌生水相互作用时，水分子陈列有序构成的用时，水分子陈列有序构成的“笼形构造被破坏，笼形构造被破坏，这部分水进入自在水中，使水分子熵添加。这部分水进入自
7、在水中，使水分子熵添加。7.7.疏水相互作用疏水相互作用 但最近但最近X射线结晶学方法证明，蛋白质非极性外表射线结晶学方法证明，蛋白质非极性外表上水分子的构造重排，能引起系统的熵值降低和蛋白上水分子的构造重排，能引起系统的熵值降低和蛋白质折叠形状的改动：蛋白质的非极性部分总是倾向于质折叠形状的改动：蛋白质的非极性部分总是倾向于使其不与水接触，并尽能够的隐藏在蛋白质球体内部，使其不与水接触，并尽能够的隐藏在蛋白质球体内部，从而添加蛋白质的稳定性。从而添加蛋白质的稳定性。二、测定蛋白质稳定性的方法二、测定蛋白质稳定性的方法o熔化温度熔化温度TmTm，酶蛋白变性伸展过程中的温度，酶蛋白变性伸展过程中
8、的温度o变性剂浓度变性剂浓度50%50%伸展所需求的变性剂浓度伸展所需求的变性剂浓度o自在能变化自在能变化GGo最大稳定性温度最大稳定性温度TsTso相对活力相对活力/%/%时间时间t t时保管的活力时保管的活力o加速降解实验在较高温度下加速酶失活速度加速降解实验在较高温度下加速酶失活速度1 1蛋白水解酶和自溶作用蛋白水解酶和自溶作用2 2聚协作用构象改动、分子间二硫键的交换反响聚协作用构象改动、分子间二硫键的交换反响3 3极端极端pHpH远离等电点时，酶分子内一样电荷间的静电斥力导致蛋白质伸展远离等电点时，酶分子内一样电荷间的静电斥力导致蛋白质伸展4 4氧化作用部分氨基酸侧链易氧化氧化作用部
9、分氨基酸侧链易氧化5 5外表活性剂和去污剂与酶蛋白结合，导致疏水氨基酸残基暴露外表活性剂和去污剂与酶蛋白结合，导致疏水氨基酸残基暴露6 6变性剂：变性剂：高浓度盐结合酶蛋白的带电基团与降低酶蛋白周围的水簇数目高浓度盐结合酶蛋白的带电基团与降低酶蛋白周围的水簇数目 有机溶剂改动介电常数、夺水及使疏水基团暴露有机溶剂改动介电常数、夺水及使疏水基团暴露 金属离子螯合金属离子螯合 脲和盐酸胍消除疏水相互作用及与酶蛋白分子直接作用脲和盐酸胍消除疏水相互作用及与酶蛋白分子直接作用三、蛋白质不可逆失活的缘由和机理三、蛋白质不可逆失活的缘由和机理7 7重金属离子和巯基试剂与酶蛋白的某些基团反响重金属离子和巯基
10、试剂与酶蛋白的某些基团反响8 8热构象改动使其反响基团和疏水区域暴露，并相互作用热构象改动使其反响基团和疏水区域暴露，并相互作用9 9机械力：机械力：振动添加气振动添加气-液界面的面积，酶蛋白分子在此界面上伸展导致疏水残基液界面的面积，酶蛋白分子在此界面上伸展导致疏水残基暴露而引起聚合暴露而引起聚合 剪切剪切力导致疏水残基暴露而引起聚合剪切剪切力导致疏水残基暴露而引起聚合 超声波产生气泡，气泡产活力械力与热超声波产生气泡，气泡产活力械力与热 压力变性后聚合压力变性后聚合1010冷冻和脱水酶分子浓缩过程中微环境中冷冻和脱水酶分子浓缩过程中微环境中pHpH和离子强度的猛烈改动、某和离子强度的猛烈改动、某些键发生反响些键发生反响1111辐射作用构成自在基引起酶蛋白一级构造的共价改动、与水辐射分解辐射作用构成自在基引起酶蛋白一级构造的共价改动、与水辐射分解副产物反响副产物反响第三节第三节 酶蛋白的稳定化酶蛋白的稳定化一、固定化一、固定化二、非共价修饰二、非共价修饰三、化学修饰三、化学修饰四、蛋白质工程四、蛋白质工程
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