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1、实验 酿酒酵母的大规模液体发酵生产实验原理实验原理 本实验通过对15升中型发酵罐的了解及使用，将整个微生物发酵生产过程分成几个阶段，系统的表现了发酵生产工艺流程，包括使用发酵设备前期整个设备给水、给无菌空气、给高压蒸汽管路及其排放管路的了解，以及在实际操作过程中各个管路之间的切换，发酵用各个检测设备的标定。并以酿酒酵母的纯化培养开始、再进行摇瓶放大、最后实现发酵罐的发酵生产的具体实验过程，让学生学会在发酵过程中能够分阶段的进行采样检测，根据检测值对发酵的条件进行必要的调节，最后对于发酵所得到的产物进行必要的分离纯化，制成成品并保存，从而掌握整个发酵生产工艺流程的具体实施过程。实验简介实验简介1
2、5升发酵罐图示升发酵罐图示NoImage发酵罐罐路示意图发酵罐罐路示意图空气流量计电加热器冷凝管空气水蒸气A03A02A01S03S01S02VT1V01P02W01C01W03W02罐体管路说明管路说明一、空气及其净化 来自空压机的压缩空气经净化器（外接减压稳压器、除水、除尘、空气预过滤器）进入发酵罐空气总管，空气流量计A01、阀A02、单向阀、空气过滤器、阀A03到达反应器内，尾气经阀排出，本管路具有计量、净化作用。注：空气流量级显示的流量是以过滤器前的压力下的流量，不是标准状态下的流量。二、蒸汽蒸汽进夹套蒸汽经阀S01进入夹套（上进），经阀V01排出冷凝水。蒸汽对培养基预热。蒸汽进反应器
3、蒸汽经阀S02、单向阀、空气过滤器、阀A03进入罐内，由排气口控制阀VT1排出。蒸汽对过滤器及空气管线消毒。蒸汽进取样阀及放料阀蒸汽经阀S03进入取样阀，由阀P02排出冷凝水。蒸汽对取样阀及底阀灭菌。三、自来水自来水进夹套当电磁阀C01打开时，自来水经自动注水阀、阀W01进入反应器夹套（下进），由夹套上口、阀W02、加热器、电磁阀C01排出；当电磁阀关闭时，夹套水经W02进入电加热器、循环泵、单想阀进入夹套（下口），通过夹套水的循环，将加热器的热能带入夹套，通过夹套的换热加热发酵液。注：温度自动前必须对夹套注水自来水进排气冷凝器自来水经阀W03进入排气冷凝器，对发酵尾气进行冷却尽可能减少培养基
4、的水分蒸发。实验步骤实验步骤葡萄糖1g氯化钾1.8g酵母浸膏2.5g醋酸钠8.2g蒸馏水1000mL一、发酵前的准备工作一、发酵前的准备工作1酵母菌活化：由种子活化到试管斜面上。2按照下列配方配制麦氏（Meclary）培养基300ml，113灭菌20min。将300ml种子培养液分成两份，无菌操作取酿酒酵母菌斜面菌苔，接种于种子培养液，摇床培 养2448小时。3补料液的配制及灭菌：配制溶液、溶液、食用油分别装入补料瓶中，将连在补料瓶上的橡皮管，用绳子扎紧，121灭菌20min。4培养基的制备：酵母膏25g、NaAc82g、KCl 18g、葡萄糖10g。加水溶解搅拌均匀。5溶氧电极标定：零点标定
5、：将电极拔出浸没于饱和的无水亚硫酸钠溶液中，待电极显示值稳定后标零点1。斜率标定：溶氧电极的斜率（满度）标定一般在发酵之前，温度、罐压、通气量均在正常情况下进行，一般以100标定，因为它是个相对值，也可以是其他数值，罐压对溶氧量影响较大，标定时应保持罐压相对稳定。6pH电极标定：pH电极零点和斜率不能在发酵状态下标定，只能在灭菌以前进行，但可以在发酵过程中进行零电位补偿。标定前电极需泡于液体中并已联机1小时以上，通常采用两点标定法：先将电极洗净擦干，然后浸入缓冲液，并将零点标定值设为，然后按开始标定键，待pH显示值稳定后可按零点标定结束键，然后洗净擦干电极后同样方法标定斜率，然后再标定零点，反
6、复至更换缓冲液时，pH未经标定已达标准值（附近）即可。7蠕动泵流量标定 蠕动泵的标定随时可以进行。可以对酸、碱泵、补料泵、消泡剂泵进行标定，方法相同。先取定量的液体，安装好，然后在标定画面上设为标准容量。然后将手、自动开关调节到手动位置，使泵运转并将管内空气排出开始滴液，将出口液体滴入标准容器，同时按标准开始键并确定，此时开始以秒为单位计数，待输出液体到达设定的标准容量时，再按确定。整个标定过程结束。此时，加料速度便由控制器显示出来。标定结束后将开关置于“关”的位置。8将4步骤配制好的培养基加入发酵罐中，加水至体积约升（防止水蒸发过多）。二、实罐灭菌操作二、实罐灭菌操作1、准备l盖紧罐盖上的各
7、种盖帽，旋紧罐盖上的压紧螺栓，l关紧发酵罐底阀P01，倒入培养基，调整pH值，旋紧接种口。l关排气冷凝器进水W03，移去进出口的软管排尽冷凝水夹套中的水2、培养基预热l准备工作 预先启动蒸汽发生器及空气压缩机。将控制器中的温度控制设定为手动 开排气阀VT1，关闭其他所有阀们 开排气阀VT1，开夹套冷凝水阀V01排夹套水，关闭其他阀门。l启动反应器搅拌马达。调节转速200-300rpm。l蒸汽进夹套：缓慢开夹套蒸汽阀S01蒸汽进夹套（注意：此时有轻微爆破声属正常，如声音过响，则开阀速度应减慢）。待排水总口排出蒸汽时调节冷凝水阀V01，控制蒸汽排出量以有少量蒸汽冒出即可。并控制夹套内压力不要超过。
8、当培养基预热至98时，进入实罐灭菌操作。在培养基温度在80-90时可以适当的减慢升温速度，在本温度区域可以杀灭大部分微生物。l蒸汽进取样阀：开出料阀P02（关紧底阀P01），开蒸汽阀S03，蒸汽进入取样阀内腔，当阀P02 排尽冷凝水后应调节其开度，以少量蒸汽排出即可。3、实罐灭菌l蒸汽进过滤器：停搅拌，微开过滤器上排冷凝水阀V02，开过滤器前蒸汽阀S02，微开过滤器后排冷凝水阀V03，缓缓开切断阀A03，蒸汽经过过滤器进入反应器，当冷凝水阀V02、V03出口冷凝水很少时，调节冷凝水阀V02、V03以有少量蒸汽排出为宜。当排气口有蒸汽排出或罐温到达100两分钟后，关闭排气阀VT1。调节切断阀A0
9、3和蒸汽阀S02，维持过滤器前蒸汽压力为，同时必须保证切断阀有一定开度，不得关死。当罐温达到100时，培养基中的溶氧接近零，可以标定溶氧的零点。l当达到预定温度或罐压，开排气阀VT1至有少量蒸汽排出，关紧或微开夹套蒸汽阀S01，微开底阀P01（开阀时观察视镜处培养基翻腾的变化，以有少量变化为宜），根据罐压或罐温变化的趋势。及时调节蒸汽阀S02、S03。阀门调节应微调，避免大幅度开关。当反应器罐压或罐温维持在预定的范围内开始计时。l保温开始后，排气阀蒸汽排量不宜太小，否则可能导致液面以上的罐体部分尤其罐盖达不到消毒温度。l保温阶段应旋松接种口盖至有少量蒸汽冒出。4、灭菌完成及降温（先开后关，后开
10、先关）l保温结束后首先旋紧接种口盖。旋紧罐底阀P01，再关紧取样器的蒸汽阀S03。l关紧空气管线切断阀A03及冷凝水阀V03，关紧过滤器前蒸汽阀，全开空气阀A01、A02，开冷凝水阀V03用空气吹过滤器，当罐压接近时关闭阀V03，缓缓开空气管线切断阀A03，空气进入发酵罐。当过滤器冷凝水阀V02排尽冷凝水后就可以关闭l关夹套蒸汽阀S01、冷凝水阀V01，开夹套进水阀W01和循环管线切断阀W02。在控制器中将温度控制方式设定为“自动”，发酵罐进入自动降温阶段。按下搅拌开关，设定搅拌转速并“自动”控制。l在降温过程中，始终监视罐压，严禁压力掉零。当温度到达工艺要求时，调节搅拌转速、空气流量、罐压、
11、标定溶氧电极斜率及校正pH电极的零点。三、接种三、接种l调节进气量至3001000L/h，开排气阀至罐压接近于0（不得大于），放松接种口，在火焰保护下打开接种口，迅速将种子倒入，旋紧接种盖，立即调高罐压，在控制器的初始化菜单中设定发酵批号，并开始进行发酵。四、补料四、补料l将灭菌消毒的补料瓶放好，手动安装好输液管，使中间接头嵌在蠕动泵凹槽内l用酒精棉球擦拭罐盖补料口，打开盖后将针头迅速插入并穿透密封盖。l打开蠕动泵手动开关，使料液管中充满料液，置开关为自动。五、发酵及取样检测五、发酵及取样检测l取样器消毒：半开阀P02，开蒸汽阀S03，蒸汽进入取样器，消毒时间5-10分钟。l关蒸汽阀S03，全开出料阀P02，准备取样。l逆时针转动取样阀P01手柄，进行取样。回转手柄。l开蒸汽阀S03，冲洗取样器，关阀S03。取样结束。l放料 发酵完毕通过取样口放料。l离心 以5000r/min，离心5min，取下层沉淀。将沉淀反复水洗，至上清颜色变淡l超声波破碎 将沉淀用水溶解后用超声波3s间隔2s进行30次，再离心取上清液，即所有提取的菌体蛋白。-40冷冻保存。l使用冷冻干燥机冷冻干燥制得蛋白质干粉。六、发酵后处理六、发酵后处理
酿酒酵母的大规模液体发酵生产
