第二章酶促反应动力学名师编辑PPT课件

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1、第二章第二章酶促反应动力学酶促反应动力学主要内容主要内容 1 1、酶促反应动力学的特点、酶促反应动力学的特点 2 2、均相酶促反应动力学、均相酶促反应动力学 3 3、固定化酶促反应动力学、固定化酶促反应动力学 4 4、酶的失活动力学、酶的失活动力学2.1 2.1 酶促反应动力学的特点酶促反应动力学的特点2.1.1 2.1.1 酶的基本概念酶的基本概念一、酶作为催化剂的共性一、酶作为催化剂的共性二、酶的生物催化特性二、酶的生物催化特性三、酶的调节功能三、酶的调节功能2.1.2 2.1.2 酶的稳定性及应用特点酶的稳定性及应用特点一、酶的稳定性一、酶的稳定性二、酶的应用特点二、酶的应用特点2.1.

2、3 2.1.3 酶和细胞的固定化技术酶和细胞的固定化技术一、固定化技术的基本概念一、固定化技术的基本概念二、固定化酶的特性二、固定化酶的特性三、固定化细胞的特性三、固定化细胞的特性四、酶和细胞的固定化技术四、酶和细胞的固定化技术2.1.4 2.1.4 酶促反应的特征酶促反应的特征一、优点：一、优点：常温、常压、中性范围（个别除外）下进行反应；常温、常压、中性范围（个别除外）下进行反应；与一些化学反应相比，省能且效率较高；与一些化学反应相比，省能且效率较高；专一性好；专一性好；反应体系较简单，反应过程的最适条件易于控制等。反应体系较简单，反应过程的最适条件易于控制等。二、不足，二、不足，多限于一

3、步或几步较简单的生化反应过程；多限于一步或几步较简单的生化反应过程；一般周期较长。一般周期较长。2.2 2.2 均相系酶促反应动力学均相系酶促反应动力学2.2.1 2.2.1 酶促反应动力学基础酶促反应动力学基础一、零级反应一、零级反应 二、一级反应二、一级反应即酶催化即酶催化ABAB的过程的过程 maxrdtdS)(01bakdtdb三、二级反应，即三、二级反应，即A+B C A+B C)(002cbcakdtdc 对于连锁反应，如，对于连锁反应，如，CBAkk21 akdtda1bkakdtdb21akdtdc22.2.2 2.2.2 单底物酶促反应动力学单底物酶促反应动力学一、米氏方程

4、efree S x efree P根据质量作用定律，P的生成速度可表示为PEESSEkkk211xkrP2三点假设三点假设1、底物浓度底物浓度S S 远大于酶的浓度远大于酶的浓度efree efree，因此，因此x x的的形成不会降低底物浓度形成不会降低底物浓度S S，底物浓度以初始浓，底物浓度以初始浓度计算。度计算。2 2、不考虑、不考虑P+E ESP+E ES这个可逆反应的存在。要这个可逆反应的存在。要忽略这一反应，必须是产物忽略这一反应，必须是产物P P为零，换言之，为零，换言之，该方程适用于反应的初始状态。该方程适用于反应的初始状态。3 3、ES E+PES E+P是整个反应的限速阶段

5、，也就是是整个反应的限速阶段，也就是说说E+S=ESE+S=ES的可逆反应在初速度测定时间内的可逆反应在初速度测定时间内已达到平衡。已达到平衡。ESES分解生成产物的速度不足以破分解生成产物的速度不足以破坏这个平衡。坏这个平衡。式中式中rsrs为底物消耗速度（负号表示减少）；为底物消耗速度（负号表示减少）；rprp为产物生成速率；为产物生成速率；KsKs为平衡常数为平衡常数,其又称饱和常数（其又称饱和常数（saturation constant）。）。SKSrSKSekrrspsspmax,2)(利用稳态法获得米氏方程，同样基于三点假设。利用稳态法获得米氏方程，同样基于三点假设。其中第（其中第

6、（1 1）和（）和（2 2）两点与快速平衡法一致，第）两点与快速平衡法一致，第三点是在基于底物浓度比酶的浓度高得多，中间三点是在基于底物浓度比酶的浓度高得多，中间复合物复合物ESES分解时所得到的酶又立即与底物结合，分解时所得到的酶又立即与底物结合，使中间复合物浓度维持不变。即在这段时间里，使中间复合物浓度维持不变。即在这段时间里，x x的生成速率与的生成速率与x x的消失速率相等，达到动态平衡，的消失速率相等，达到动态平衡，即所谓即所谓“稳态稳态”。SKSrSKSekrrmpmspmax,2)(在实际的酶促反应中，人们关心的是反应时间与在实际的酶促反应中，人们关心的是反应时间与底物转化率的关

7、系所以，基于底物转化率的关系所以，基于t=0t=0，S=SS=S0 0初值积初值积分得分得tmtSSKSStr00maxln)(ssmrSrKtmax0max)11ln(第二章第二章 酶促反应动力学酶促反应动力学2.1 酶促反应动力学的特点酶促反应动力学的特点2.1.1 酶的基本概念酶的基本概念2.1.2 酶的稳定性及应用特点酶的稳定性及应用特点 酶是以活力、而不是以质量购销的。酶是以活力、而不是以质量购销的。酶有不同的质量等级：工业用酶、食品用酶、酶有不同的质量等级：工业用酶、食品用酶、医药用酶。酶的实际应用中应注意，没有必要使医药用酶。酶的实际应用中应注意，没有必要使用比工艺条件所需纯度更

8、高的酶。用比工艺条件所需纯度更高的酶。经典酶学研究中，酶活力的测定是在反应经典酶学研究中，酶活力的测定是在反应的初始短时间内进行的，并且酶浓度、底物浓的初始短时间内进行的，并且酶浓度、底物浓度较低，且为水溶液，酶学研究的目的是探讨度较低，且为水溶液，酶学研究的目的是探讨酶促反应的机制。酶促反应的机制。工业上，为保证酶促反应高效率完成，常工业上，为保证酶促反应高效率完成，常需要使用高浓度的酶制剂和底物，且反应要持需要使用高浓度的酶制剂和底物，且反应要持续较长时间，反应体系多为非均相体系，有时续较长时间，反应体系多为非均相体系，有时反应是在有机溶剂中进行。反应是在有机溶剂中进行。2.2 均相酶促反

9、应动力学均相酶促反应动力学2.2.1 酶促反应动力学基础酶促反应动力学基础可采用化学反应动力学方法建立酶促反应动力学方程。可采用化学反应动力学方法建立酶促反应动力学方程。对酶促反应对酶促反应 ，有：，有：式中，式中，k：酶促反应速率常数；：酶促反应速率常数；r：酶促反应速率；：酶促反应速率；rA：以底物：以底物A的消耗速率表示的酶促反应速率；的消耗速率表示的酶促反应速率；rP：以产物：以产物P的生成速率表示的酶促反应速率。的生成速率表示的酶促反应速率。DCBA dtdCrAA BAPACkCrrr dtdCrPP 对连锁的酶促反应，对连锁的酶促反应，PMAkk21AACkdtdC1 MAMCk

10、CkdtdC21 MPCkdtdC2 2.2.2 单底物酶促反应动力学2.2.2.1 米氏方程 根据酶底物中间复合物假说，对单底物酶促反应 ，其反应机制可表示为：PS PEESSEkkk 211快速平衡法推导动力学方程：快速平衡法推导动力学方程：几点假设：（1）CSCE，中间复合物ES的形成不会降低CS。（2）不考虑这个可逆反应。（3）为快速平衡，为整个反应的限速阶段，因此ES分解成产物不足以破坏这个平衡。ESSE PEES ESCkr2 11kkKCCCSESSE ESEECCC 0解之，得解之，得SSSECKCCkr 0202maxECkr SSSCKCrr max令令则则根据假设建立动力

11、学方程根据假设建立动力学方程稳态法推导动力学方程：稳态法推导动力学方程：几点假设：几点假设：（1）CSCE，中间复合物，中间复合物ES的形成不的形成不会降低会降低CS。（2）不考虑这个可逆反应。）不考虑这个可逆反应。（3）CSCE中间复合物中间复合物ES一经分解，一经分解，产生的游离酶立即与底物结合，使中间产生的游离酶立即与底物结合，使中间复合物复合物ES浓度保持衡定，即浓度保持衡定，即 。0 dtdCESESCkr2 ESEECCC 0解之，得解之，得02maxECkr 令令则则0211 ESESSEESCkCkCCkdtdCSSECkkkCCkr 12102121kkkKm SmSCKCr

12、r max根据以上假设，可建立如下方程组根据以上假设，可建立如下方程组米氏方程米氏方程 rrmaxrmax/2KmCSSmSCKCrr max图21 酶浓度一定时底物浓度对反应速率的影响对米氏方程的讨论：当CSKm时，属零级反应。当CSKm时，。Km在数量上等于反应速度达到最大反应速度一半时的底物浓度。SmCKrrmax maxrr 2maxrr 双倒数法(Linewear Burk):对米氏方程两侧取倒数，得 ,以 作图，得一直线，直线斜率为 ，截距为 ,根据直线斜率和截距可计算出Km和rmax。SmCrKrr111maxmax SCr11max1rmaxrKm1Km1rmax1r斜率Km/

13、rmax1CS图22 双倒数法求解Km和rmax 2.2.2.2 抑制剂对酶促反应速率的影响 失活作用 抑制作用 竞争性抑制 非竞争性抑制 竞争性抑制竞争性抑制 非竞争性抑制非竞争性抑制EISESI竞争性抑制反应机理：竞争性抑制反应机理：PEESSEkkk 211EIIEIK IEIIEKCCC ESCkr2 SESSEKkkCCC 11EIESEECCCC 0快速平衡法推导动力学方程：快速平衡法推导动力学方程：SIISSCKCKCrr)/1(max02maxECkr11kkKS解之，得解之，得，式中式中:采用稳态法推导动力学方程：采用稳态法推导动力学方程：ESCkr2 0211 ESESSE

14、ESCkCkCCkdtdC0 EIiIEiEICkCCkdtdCEIESEECCCC 0解之，解之，得得SIImSCKCKCrr )/1(max02maxECkr 121kkkKm 式中式中:非竞争性抑制反应机理非竞争性抑制反应机理PEESSEkkk 211EIIEIK ESIIESIK 快速平衡法推导动力学方程快速平衡法推导动力学方程ESCkr2 SESSEKkkCCC 11IEIIEKCCC IESIIESKCCC EIESEECCCC 0 )(/1(maxSSIISCKKCCrr 02maxECkr 11kkKS 解之，得解之，得式式中中:稳态法推导动力学方程：稳态法推导动力学方程：ES

15、Ckr2 0211 IESiESIiESESSEESCCkCkCkCkCCkdtdC0 EIiIEiEICkCCkdtdC0 ESIiIESiESICkCCkdtdCESIEIESEECCCCC 0解之，得解之，得式式中中:)(/1(maxSmIISCKKCCrr 02maxECkr 121kkkKm 竞争性抑制竞争性抑制 非竞争性抑制非竞争性抑制SIImSCKCKCrr )/1(max)(/1(maxSmIISCKKCCrr )/1(IImmKCKK SmSCKCrr maxIIKCrr/1maxmax SmSCKCrr max令可变形为可变形为:可变形为可变形为:令mmKKmaxmaxrr

16、 竞争性抑制竞争性抑制 非竞争性抑制非竞争性抑制1 r1CS1rmax-1 Km-1 Km1r1CS1rmax-1KmCI=0CI 1rmaxCI=0CI 产物抑制：酶促反应中，有时随产物浓产物抑制：酶促反应中，有时随产物浓度提高，产物与酶形成复合物，阻碍了度提高，产物与酶形成复合物，阻碍了底物与酶的结合，从而降低了酶促反应底物与酶的结合，从而降低了酶促反应的速度。的速度。EPPEESSEPKkkk211反应机理：ESCkr2 SESSEKkkCCC 11PEPPEKCCC EPESEECCCC 0快速平衡法推导动力学方程快速平衡法推导动力学方程:解之解之,得得SPPSSCKCKCrr )/1

17、(max02maxECkr 11kkKS 式中式中:ESCkr2 EPESEECCCC 0稳态法推导动力学方程稳态法推导动力学方程:0211 ESESSEESCkCkCCkdtdC0 EPpPEpEPCkCCkdtdC解之解之,得得SPPmSCKCKCrr )/1(max02maxECkr 121kkkKm 式中式中:可见可见,产物抵制属于竞争性抵制产物抵制属于竞争性抵制底物抑制：对于某些酶促反应，当底底物抑制：对于某些酶促反应，当底物浓度较高时，反应速率呈下降趋势，物浓度较高时，反应速率呈下降趋势，称为底物抑制。称为底物抑制。CSC CS Sr底物抑制反应机理：底物抑制反应机理：PEESSE

18、kkk 211ESSSESSSK 快速平衡法推导动学方程：快速平衡法推导动学方程：ESCkr2 SESSEKkkCCC 11SSESSSESKCCC ESSESEECCCC 0解之解之,得得)/1(maxSSSSSSKCCKCrr 02maxECkr 11kkKS 式中式中:2.2.3 2.2.3 多底物酶促反应动力学多底物酶促反应动力学一般的多底物酶促反应可表示为：一般的多底物酶促反应可表示为：RQPCBA这里讨论：双底物双产物情况这里讨论：双底物双产物情况QPBA 反应机制：反应机制：关键问题：底物关键问题：底物A A、B B哪个先和酶结合？哪个先和酶结合？u 任何一个都有可能先与酶结合任

19、何一个都有可能先与酶结合 （随机机制）（随机机制）u A A先与酶结合或先与酶结合或B B先与酶结合先与酶结合 u 两底物同时与酶结合两底物同时与酶结合 （可能性极小）（可能性极小）随机机制（分支机制）随机机制（分支机制）EEBEAEABEPQEPEQE（不形成三元复合物）反应模型（不形成三元复合物）反应模型EAEAAPPBBEQQQEEG （EG：修饰过的酶：修饰过的酶）简单机制简单机制EEAEABAABBEPQQQEPEPP双底物酶促反应动力学双底物酶促反应动力学 反应机理：反应机理：EAAEPEEABAEB B B AKAKBKBK2kEABCkr2 AEAAEKCCC AEABAEBK

20、CCCBEBBEKCCC BEABBEAKCCC EABEBEAEEOCCCCC EABEBEAEEOCCCCC 解之，得解之，得)(maxBBAABACKCKCCrr 式中：式中：EOCkr2max 2.3 固定化酶促反应动力学 2.3.1 2.3.1 固定化酶促反应动力学基础固定化酶促反应动力学基础 2.3.1.1 2.3.1.1 酶的固定化技术定义酶的固定化技术定义 酶的固定化技术是将水溶性的酶分子通过一定的方式，酶的固定化技术是将水溶性的酶分子通过一定的方式，如静电吸附，共价键等与载体如角叉菜胶、离子交换树脂如静电吸附，共价键等与载体如角叉菜胶、离子交换树脂等材料制成固相酶的技术。等材

21、料制成固相酶的技术。细胞的固定化技术细胞的固定化技术:为省去从微生物（或动、植物）中为省去从微生物（或动、植物）中提取酶的操作，确保酶的稳定性，采用直接固定化微生物提取酶的操作，确保酶的稳定性，采用直接固定化微生物细胞、动植物细胞、组织技术。细胞、动植物细胞、组织技术。物理吸附法物理吸附法 载体结合法载体结合法 离子结合法离子结合法 共价结合法共价结合法 交联法交联法 格子型格子型 包埋法包埋法 微胶囊微胶囊2.3.1.2 2.3.1.2 酶和细胞固定化方法酶和细胞固定化方法 交联法交联法EOEEOOOE2.3.1.3 2.3.1.3 固定化对酶性质的影响固定化对酶性质的影响 底物专一性的改变

22、底物专一性的改变 稳定性增强稳定性增强 最适最适pHpH值和最适温度变化值和最适温度变化 动力学参数的变化动力学参数的变化 2.3.1.4 2.3.1.4 影响固定化酶促反应的主要因素影响固定化酶促反应的主要因素 分子构象的改变分子构象的改变 位阻效应位阻效应 微扰效应微扰效应 分配效应分配效应 （可用（可用Kp Kp 定量描述定量描述）链接 扩散效应扩散效应 （可定量描述）（可定量描述）分配系数分配系数 (Kp)(Kp)链接 分配系数：载体内外底物分配系数：载体内外底物(或其他物质或其他物质)浓度之比。浓度之比。KpKp的测定：的测定：已知底物浓度已知底物浓度(C CS0S0 )，体积，体积

23、(V(V0 0)的溶液的溶液中，放入不含底物的一定体积的载体，并保持适宜中，放入不含底物的一定体积的载体，并保持适宜条件，当达到平衡时，测定载体外溶液的底物浓度条件，当达到平衡时，测定载体外溶液的底物浓度(Cs)(Cs)。2.3.2 2.3.2 固定化酶促反应过程分析固定化酶促反应过程分析2.3.2.1 2.3.2.1 外部扩散过程外部扩散过程 以表面固定化酶为例。以表面固定化酶为例。SSmSSoutCKCrr maxCSCSSooutoutrr SmSoCKCrr max外扩散过程分析外扩散过程分析SSmSSoutCKCrr maxoutrN )(maxSSSLSSmSSCCakCKCr 外

24、扩散速率：外扩散速率：达到平衡时，达到平衡时，即即 )(SSSLCCakN 酶促反应速率：酶促反应速率：SLaCkN maxN,rrmaxNmax 0 CSS CS(CSS，rout)NmaxN，rrmax0 CSS CS(CSS，rout)maxmaxNr0,0outSSC maxmaxNr1,outSSSCC Da准数准数:maxmaxNrDa 当当 时，时，过程为外扩散控制。过程为外扩散控制。当当 时，时，过程为反应控制。过程为反应控制。1 Da1 Da0,0outSSC 1,outSSSCC 式中式中:)(maxSSSLSSmSSCCakCKCr *maxmaxmax)(1(CCKCa

25、CkrNrDaSL SmSSSCKKCCC ,*表明表明C*为为Da准数的函数，即准数的函数，即)(*DafC (时时,)*maxmaxCKCCKCCKCrCKCrrrSSmSSSmSSSmSSooutout mSKC maxrro 表明表明为为C*的函数，即的函数，即 out*)(Cgout 可见，Da准数是决定效率因子 和比浓度C*的唯一参数，因而是表征传质过程对反应速率影响的基本准数。Da准数越小，固定化酶表面浓度越接近于主体浓度CS，越接近于1。Da准数越大，固定化酶表面浓度越趋近于零，越小，越趋近于零。out out out 为提高固定化酶外扩散效率为提高固定化酶外扩散效率,应设法减

26、小应设法减小Da准数。减小准数。减小Da准数的措施：准数的措施：1、降低固定化酶颗粒的粒径，增大比表、降低固定化酶颗粒的粒径，增大比表面积，但由于粒径减小会伴随压降增加，面积，但由于粒径减小会伴随压降增加，因此应用中综合考虑，确定合适的粒径。因此应用中综合考虑，确定合适的粒径。2、使固定化酶表面流体处于湍流状态以、使固定化酶表面流体处于湍流状态以增大增大 。Lk2.3.2.2 内部扩散过程内部扩散过程 具有大量内孔的球形固定化酶颗粒Rdrroininrr 内扩散效率因子内扩散效率因子稳定状态下，对底物进行物料衡算：稳定状态下，对底物进行物料衡算：drrrdrdCDerdrdCDedrrSrSr

27、drrSr22244)(4 流入量流出量反应量流入量流出量反应量整理整理,得得drrrdrdCDerdrdCDedrrdrrSrSrdrrSr222244)(24 drrrdrdCrdrDedrdCdrdCDerSdrrSrrSrdrrSr22484 Dedrr24 两侧同除两侧同除,得得DerdrdCrdrCdSSrSr 222当反应符合米氏方程规律时，当反应符合米氏方程规律时，SrmSrSCKCrr max)(2max22SrmrSSrSrCKDeCrdrdCrdrCd 故故,令令 ,SSSrXCCC Rrl mSSKC mDeKrR9max22 上式可转化为无因次形式，得上式可转化为无因

28、次形式，得 XXXXccdldcldlcd 192222边界条件边界条件:0 l0 dldcX1 l1 Xc,该微分方程无解析解，只能用数值法求解。该微分方程无解析解，只能用数值法求解。西勒西勒准数准数()的物理意义是表面反应速率与内扩散速率的物理意义是表面反应速率与内扩散速率之比。对各类反应动力学与固定化酶的形状，之比。对各类反应动力学与固定化酶的形状，普遍化的普遍化的 的定义式为的定义式为:21,2 SSeqSCCssPPdCsDerrAVSSmSSRrSrSSmSSRrSroininCKCrdrdCDeRCKCrRdrdCDeRrr maxmax323344 引入无因次参数，则引入无因次

29、参数，则 11321lXindldcin 无解析解，只有数值解。无解析解，只有数值解。见教材见教材33页图页图2-10 内扩散效率因子内扩散效率因子 in 是是 和和 的函数。的函数。对对 in影响不大，影响影响不大，影响 in的主要参的主要参数是西勒准数数是西勒准数。如果。如果 ，则，则 不随不随 变化，近似等于变化，近似等于1，也就是说，也就是说没有内部传质阻力，若没有内部传质阻力，若 ，则则 ，反应为内扩散所限制。，反应为内扩散所限制。3.0 3.01inin 为提高固定化酶内扩散效率，为提高固定化酶内扩散效率，应设法减小应设法减小。减小减小 的措施主要是适当降低固的措施主要是适当降低固

30、定化酶颗粒粒径。定化酶颗粒粒径。外扩散过程外扩散过程内扩散过程内扩散过程 Da准数是决定外扩散准数是决定外扩散 效率的唯一参数。效率的唯一参数。准数是决定内扩散准数是决定内扩散效率的主要参数。效率的主要参数。Da准数定义：准数定义：西勒准数定义：西勒准数定义：外扩散效率因子定义：外扩散效率因子定义：内扩散效率因子定义：内扩散效率因子定义：Da1，过程为外扩散控，过程为外扩散控制制 0.3时，过程为内时，过程为内扩散控制。扩散控制。SLaCkrDamax DeKrRm9max22 0rroutout 0rrinin 2.4 酶的失活动力学2.4.1 未反应时酶的失活动力学未反应时酶的失活动力学2

31、.4.1.1 一步失活模型一步失活模型 式中式中:E具有活性的酶，具有活性的酶，D失活的酶。失活的酶。kd失活反应速率常数。失活反应速率常数。DEdk 建立酶失活动力学方程：建立酶失活动力学方程：边界条件：边界条件：积分，得积分，得EdECkdtdC 0,EECCot )exp(0tkCCdEE 几个概念：几个概念：一步失活常数：一步失活常数 ：半衰期，当：半衰期，当 ：时间常数，：时间常数，三者关系：三者关系：dkdk2/1tct02/121,EECCtt dckt1 dkt2ln2/1 dckt1 2.4.1.2 多步失活模型 多步串联失活模型：多步串联失活模型：同步失活模型：同步失活模型

32、：式中，式中，为失活速率常数为为失活速率常数为 的酶组分的的酶组分的分率。因此，分率。因此，DFE iiiEEtkxCCt)exp()(0 ik iix12.4.1.3 2.4.1.3 温度对酶失活的影响式中，式中，指前因子指前因子 反应活化能反应活化能RTEAkdddexp RTEAkdddexpdAdE同时考虑温度和时间对酶失活的影响：同时考虑温度和时间对酶失活的影响：（见教材（见教材3535页图页图2-112-11）RTEtACCTtAddEEexpexp),(02.4.2 反应中酶的热失活动力学反应中酶的热失活动力学 看图：看图：图图2-12（a)说明：说明：图图2-12（b)说明：说

33、明：2.4.2.1 反应中酶的失活模型PEESSEkkk 211DEdkSDESdk 建立失活动力学方程：建立失活动力学方程：ESdEdESEESEECkCkdtdCdtdCdtCCddtdC )(00211 ESESSEESCkCkCCkdtdCESEECCC 0方程联立求解，得SmSEdSmmEdECKCCkCKKCkdtdC 000SmSmEdCKCKCk 0121kkkKm 式中：讨论：讨论：1时，底物对酶失活无影响。时，底物对酶失活无影响。0时，酶完全被底物所保护。时，酶完全被底物所保护。0 1时，底物加速酶的失活。时，底物加速酶的失活。因此称因此称 为底物对酶稳定性影响系数。为底物对酶稳定性影响系数。