谷蛋白提取实验ppt课件

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1、实验一实验一 小麦高分子量谷蛋白亚基小麦高分子量谷蛋白亚基HMW-GSHMW-GS的提取的提取一、实验目的一、实验目的 了解小麦了解小麦HMW-GSHMW-GS提取及提取及SDS-PAGESDS-PAGE原原理。理。掌握小麦掌握小麦HMW-GSHMW-GS提取及提取及SDS-PAGESDS-PAGE方方法。法。小麦小麦HMW-GS变异类型变异类型图图1 1 以中国春以中国春CSCS为基准的各种小麦为基准的各种小麦HMW-GSHMW-GS的的SDS-PAGESDS-PAGE谱带及谱带及亚基的编号亚基的编号a a、b b、c c、d d等等Payne lawrence,1983Payne lawr

2、ence,1983二、实验原理二、实验原理 变性剂变性剂SDSSDS破坏蛋白质分子构造。破坏蛋白质分子构造。强复原剂巯基乙醇使半胱氨酸残强复原剂巯基乙醇使半胱氨酸残基之间的二硫键断裂，裂解后的基之间的二硫键断裂，裂解后的氨基酸侧链和氨基酸侧链和SDSSDS充分结合构成带充分结合构成带负电荷的蛋白质负电荷的蛋白质-SDS-SDS胶束。胶束。蛋白质蛋白质-SDS-SDS胶束在水溶液中的外胶束在水溶液中的外形像一个长椭圆棒，椭圆棒的短形像一个长椭圆棒，椭圆棒的短轴对不同的蛋白质亚基轴对不同的蛋白质亚基-SDS-SDS胶束胶束根本是一样的，但长轴的长度那根本是一样的，但长轴的长度那么与亚基分子量的大小

3、成正比。么与亚基分子量的大小成正比。胶束在胶束在SDS-PAGESDS-PAGE中的电泳迁移率中的电泳迁移率主要取决于椭圆棒的长轴长度，主要取决于椭圆棒的长轴长度，即蛋白质或亚基分子量的大小。即蛋白质或亚基分子量的大小。SDSSDS电泳不仅可以分别蛋白质，而电泳不仅可以分别蛋白质，而且可以根据迁移率的大小测定蛋且可以根据迁移率的大小测定蛋白质亚基的分子量。白质亚基的分子量。图图1 蛋白质样品用蛋白质样品用SDS和复和复原剂处置后解聚成亚基原剂处置后解聚成亚基不延续电泳包括两种不同孔径的凝胶：浓缩胶和分别胶。不延续电泳包括两种不同孔径的凝胶：浓缩胶和分别胶。浓缩胶：凝胶浓度较小，孔径相对较大，把

4、较稀的样品加在浓浓缩胶：凝胶浓度较小，孔径相对较大，把较稀的样品加在浓缩胶上，经过较大孔径凝胶的迁移作用而被浓缩至一个狭窄的缩胶上，经过较大孔径凝胶的迁移作用而被浓缩至一个狭窄的区带，使样品组分在分别胶中得以高分辨率的分别。区带，使样品组分在分别胶中得以高分辨率的分别。分别胶：又称电泳胶，通常孔径较小，经过选择适宜的凝胶浓分别胶：又称电泳胶，通常孔径较小，经过选择适宜的凝胶浓度，使样品组分得以很好的分别。分别胶又可为均一胶和梯度度，使样品组分得以很好的分别。分别胶又可为均一胶和梯度胶。本实验用的是均一胶。胶。本实验用的是均一胶。二、实验原理二、实验原理图图2 SDS不延续电泳分别胶为均匀胶不延

5、续电泳分别胶为均匀胶1.1.实验仪器实验仪器 稳压稳流电泳仪及配套电泳槽、摇床、稳压稳流电泳仪及配套电泳槽、摇床、台式离心机、微量移液器、台式离心机、微量移液器、电子天平电子天平2.2.实验试剂实验试剂 样品提取液、样品提取液、1.5M Tris-HCl(pH8.8)1.5M Tris-HCl(pH8.8)溶液、溶液、0.5M Tris-HCl(pH6.8)0.5M Tris-HCl(pH6.8)溶液、溶液、30%Acr-0.8%Bis30%Acr-0.8%Bis溶液溶液 、10%SDS10%SDS溶液、溶液、1.5%1.5%过硫酸铵溶液、过硫酸铵溶液、Tris-Tris-甘氨酸电极缓冲液、考

6、马斯亮兰甘氨酸电极缓冲液、考马斯亮兰染色液染色液 三、实验仪器和实验试剂三、实验仪器和实验试剂2.实验试剂实验试剂1 1 样品提取母液样品提取母液:6g SDS(:6g SDS(十二烷基硫酸钠十二烷基硫酸钠)+37.5ml 0.5M Tris-HCl)+37.5ml 0.5M Tris-HClpH6.8pH6.8 +30.0mg+30.0mg溴酚兰溴酚兰+17.4ml+17.4ml蒸馏水蒸馏水+30ml+30ml甘油甘油2 2 样品提取液样品提取液:27.2ml:27.2ml样品提取母液样品提取母液+4.8ml-+4.8ml-巯基乙醇巯基乙醇+64ml+64ml蒸馏水蒸馏水3 1.5M Tri

7、s-HCl(pH8.8)3 1.5M Tris-HCl(pH8.8)溶液溶液:18.17g Tris:18.17g Tris 溶于溶于40ml40ml水中，加浓水中，加浓HClHCl调调pHpH至至8.88.8，定，定容到容到100ml100ml4 0.5M Tris-HCl(pH6.8)4 0.5M Tris-HCl(pH6.8)溶液溶液:6.05g Tris:6.05g Tris溶于溶于40ml40ml水中，加浓水中，加浓HClHCl调调pH pH 至至6.86.8，定容到，定容到100ml100ml5 30%Acr(5 30%Acr(丙烯酰胺丙烯酰胺)-0.8%Bis(N,N-)-0.8

8、%Bis(N,N-甲叉双丙烯酰胺甲叉双丙烯酰胺)溶液溶液:30gAcr+0.8gBis 30gAcr+0.8gBis溶于溶于40ml40ml水中，定容到水中，定容到100ml100ml6 10%SDS6 10%SDS溶液溶液:10g SDS:10g SDS加加40ml40ml蒸馏水溶解，定容到蒸馏水溶解，定容到100ml100ml7 1.5%7 1.5%过硫酸铵过硫酸铵APAP溶液溶液:0.15g AP:0.15g AP溶于溶于10ml10ml蒸馏水中，现用现配。蒸馏水中，现用现配。8 Tris-8 Tris-甘氨酸电极缓冲液甘氨酸电极缓冲液:3.032g Tris+1g SDS+14.4g:

9、3.032g Tris+1g SDS+14.4g甘氨酸甘氨酸,定至定至1000ml1000ml9 9 考马斯亮兰染色液考马斯亮兰染色液:250ml:250ml甲醇甲醇+100ml+100ml乙酸乙酸+0.6g+0.6g考马斯亮兰考马斯亮兰+250ml+250ml蒸馏水蒸馏水10 10 脱色液脱色液:50ml:50ml甲醇甲醇+50ml+50ml乙酸乙酸+400ml+400ml蒸馏水；也可以直接用自来水作脱色液蒸馏水；也可以直接用自来水作脱色液四、实验步骤四、实验步骤将小麦籽粒砸碎放入将小麦籽粒砸碎放入1.5ml离心管离心管参与参与400ul 50%异丙醇溶液，异丙醇溶液，60水浴水浴30min

10、，其间摇，其间摇摆摆2次。次。10000rpm离心离心3min，弃上清液，弃上清液反复以上步骤反复以上步骤2次次参与参与100ul提取液提取液B150%异丙醇异丙醇+0.3%二硫代苏糖二硫代苏糖醇，醇，60水浴水浴30min参与参与100ul提取液提取液B250%异丙醇异丙醇+1.4%v/v4-乙烯乙烯基吡啶，基吡啶，60水浴水浴1h，10000rpm离心离心10min把把160ul上清液转移到新的离心管中，并在其中加上清液转移到新的离心管中，并在其中加600ul丙酮，放在丙酮，放在41.5-2h10000rpm离心离心10min，弃上清液，在沉淀中参与，弃上清液，在沉淀中参与100ul样品提

11、取液，放置样品提取液，放置2h以上，沉淀充分溶解后即可运用。以上，沉淀充分溶解后即可运用。五五 制胶与电泳制胶与电泳1 1取一套或两套干净的制胶公用玻璃板，在制胶架上取一套或两套干净的制胶公用玻璃板，在制胶架上 固定好固定好2 2先按照表先按照表1 1的比例制好分别胶，摇匀后灌到玻璃板的比例制好分别胶，摇匀后灌到玻璃板 间，上端留间，上端留2.5cm2.5cm左右空间，参与蒸馏水；等待分别左右空间，参与蒸馏水；等待分别 胶凝结的时间里，按表胶凝结的时间里，按表2 2的比例制好浓缩胶预任务液的比例制好浓缩胶预任务液 参与前四项参与前四项表表1 分别胶任务液的配制分别胶任务液的配制表表2 浓缩胶任

12、务液的配制浓缩胶任务液的配制五五 制胶与电泳制胶与电泳3 3分别胶凝结后胶面与水面之间会出现明晰的界面，此分别胶凝结后胶面与水面之间会出现明晰的界面，此 时将水倒出来，用滤纸把剩余的水吸干；在浓缩胶预时将水倒出来，用滤纸把剩余的水吸干；在浓缩胶预 任务液中参与表任务液中参与表2 2中要求的中要求的1.5%AP1.5%AP及及TEMEDTEMED，混匀后，混匀后 灌进玻璃板内，迅速插入样梳灌进玻璃板内，迅速插入样梳4 4浓缩胶凝固后将其从制胶架上取下来，拔出样梳，用浓缩胶凝固后将其从制胶架上取下来，拔出样梳，用 蒸馏水水将点样孔冲干净；将胶板夹在电泳槽上，在蒸馏水水将点样孔冲干净；将胶板夹在电泳

13、槽上，在 电泳槽的倒入电极缓冲液，上样量为电泳槽的倒入电极缓冲液，上样量为4ul4ul5 5接通电源，每板胶稳流接通电源，每板胶稳流12-15mA12-15mA，指示剂出胶后再跑，指示剂出胶后再跑2 2 h h，停顿电泳；，停顿电泳；6 6揭开玻璃板，切下浓缩胶，将分别胶放到染色液内，揭开玻璃板，切下浓缩胶，将分别胶放到染色液内，染色染色15-3015-30分钟视染色液新旧而定；然后用脱色分钟视染色液新旧而定；然后用脱色 液或水脱色至背景明晰。液或水脱色至背景明晰。51021217187912*13168六六 实验结果实验结果1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18