第七章蛋白质分分离纯化和表征ppt课件

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1、第七章第七章 蛋白质的分别纯化和表征蛋白质的分别纯化和表征一、蛋白质的酸碱性质一、蛋白质的酸碱性质二、蛋白质的分子大小与分子量的测定二、蛋白质的分子大小与分子量的测定三、胶体性质与蛋白质的沉淀三、胶体性质与蛋白质的沉淀四、蛋白质的变性与复性四、蛋白质的变性与复性五、蛋白质分别纯化的普通原那么五、蛋白质分别纯化的普通原那么六、蛋白质的分别纯化方法六、蛋白质的分别纯化方法 七、蛋白质的含量测定与纯度七、蛋白质的含量测定与纯度一、蛋白质的酸碱性质一、蛋白质的酸碱性质 蛋白质分子中有很多酸性和碱性解离基蛋白质分子中有很多酸性和碱性解离基团，是具有两性解离性质的化合物。各种解团，是具有两性解离性质的化合

2、物。各种解离基团的解离度与溶液的离基团的解离度与溶液的pH有关，有关，pH越低，越低，碱性解离度越大，蛋白质分子带正电荷越多，碱性解离度越大，蛋白质分子带正电荷越多，负电荷越少；负电荷越少；pH升高，那么解离情况相反。升高，那么解离情况相反。等电点等电点pI:在特定在特定pH条件下，某种蛋白质条件下，某种蛋白质分子所带正负电荷相等，静电荷为零，这一分子所带正负电荷相等，静电荷为零，这一pH 称为该蛋白质的等电点称为该蛋白质的等电点pI。几种蛋白质等电点几种蛋白质等电点 等电等电pH并不是一个恒定的值，它会因溶液并不是一个恒定的值，它会因溶液中盐的种类和离子强度的影响而有所不同。中盐的种类和离子

3、强度的影响而有所不同。等离子点等离子点(isoionic piont):蛋白质在纯水溶蛋白质在纯水溶液中的带电形状那么没有其他离子干扰，完全液中的带电形状那么没有其他离子干扰，完全由由H+的解离和结合来决议，这种条件下的等电的解离和结合来决议，这种条件下的等电点称为等离子点。等离子点是蛋白质的特征性点称为等离子点。等离子点是蛋白质的特征性常数。常数。二、蛋白质的分子大小与分子量的测定二、蛋白质的分子大小与分子量的测定蛋白质的分子量的范围：蛋白质的分子量的范围：61031106 Da。一根据化学组成测定最低相对分子量一根据化学组成测定最低相对分子量 用化学分析方法测出蛋白质中某一微量元用化学分析

4、方法测出蛋白质中某一微量元素的含量。并假设蛋白质分子中含有一个被测素的含量。并假设蛋白质分子中含有一个被测元素的原子，那么可由此计算出蛋白质的最低元素的原子，那么可由此计算出蛋白质的最低分子量。分子量。例：肌红蛋白和血红蛋白含铁量均为例：肌红蛋白和血红蛋白含铁量均为0.335%,计计 算二者的相对分子质量。算二者的相对分子质量。最低相对分子量最低相对分子量 x 100 =铁的百分含量铁的百分含量 铁的原子量铁的原子量0.335 55.8x 100=16700测定蛋白质相对分子量的原理和方法测定蛋白质相对分子量的原理和方法也可以利用蛋白质中含量特少的也可以利用蛋白质中含量特少的aa，用同样的原，

5、用同样的原理计算蛋白质的最低分子量。理计算蛋白质的最低分子量。二浸透压法测定相对分子量二浸透压法测定相对分子量 浸透压法测定浸透压法测定Mr操作简单，操作简单，Mr在在10-100 kDa时较准，但不能区别时较准，但不能区别蛋白质分子能否均一蛋白质分子能否均一。浸透压公式：浸透压公式：Mr=RTlimc0c(c=质量浓度，质量浓度，g/mol)浸透压法测定浸透压法测定Mr法的缺陷：不能确定溶液法的缺陷：不能确定溶液蛋白质分子能否均一。蛋白质分子能否均一。三沉降分析测定三沉降分析测定Mr 在强大的离心场中，假设蛋白质溶液在强大的离心场中，假设蛋白质溶液的密度大于溶液密度，溶液中的蛋白质的密度大于

6、溶液密度，溶液中的蛋白质会发生沉降。会发生沉降。沉降速度决议于蛋白质的分子量、分沉降速度决议于蛋白质的分子量、分子密度、分子外形和溶剂的密度、粘度。子密度、分子外形和溶剂的密度、粘度。沉降系数沉降系数20,w：单位离心场：单位离心场强度时的沉降速度。定义强度时的沉降速度。定义110-13秒秒斯维得贝格单位。斯维得贝格单位。Mr=RTSD(1V)沉降速度法沉降速度法其中其中:S:是沉降系数是沉降系数D:是分散系数是分散系数:是溶剂的密度是溶剂的密度 v:是蛋白质的偏微分比容。是蛋白质的偏微分比容。将纯的分析样品放于离心池中，进展将纯的分析样品放于离心池中，进展 低速度长时间低速度长时间 离心，样

7、品颗粒沉降构成浓度差，离心，样品颗粒沉降构成浓度差，而分散又使样品而分散又使样品 颗粒由高浓度区向低浓度区分散颗粒由高浓度区向低浓度区分散,最终到达沉降与扩最终到达沉降与扩 散的平衡形状。散的平衡形状。Mr=2RTln(C2/C1)2(1V)(x22x12)沉降平衡法沉降平衡法四凝胶过滤法测定四凝胶过滤法测定Mr 凝胶过滤层析可按照蛋白质分子量大小进凝胶过滤层析可按照蛋白质分子量大小进展分别的技术，同时可以测定蛋白质分子量。展分别的技术，同时可以测定蛋白质分子量。蛋白质经过凝胶柱的速度即洗脱体积与其分子量有关蛋白质经过凝胶柱的速度即洗脱体积与其分子量有关:先测得几种规范蛋白质的先测得几种规范蛋

8、白质的Ve Ve VeVe为洗脱体积为洗脱体积 ，并，并以其分子量对数对以其分子量对数对VeVe作图得作图得不断线，再测出待测样品的不断线，再测出待测样品的VeVe，查规范曲线即可确定分，查规范曲线即可确定分子量，并以其分子量对数对子量，并以其分子量对数对VeVe作图得不断线，再测出待作图得不断线，再测出待测样品的测样品的VeVe，查规范曲线即，查规范曲线即可确定分子量。可确定分子量。LogMLogMA AB BC CLogMLogM测测V V测测五五SDS-PAGE法测定法测定Mr 聚丙烯酰胺凝胶电泳具有较高分辨率，用聚丙烯酰胺凝胶电泳具有较高分辨率，用它分别、检测蛋白质混合样品，主要是根据

9、各它分别、检测蛋白质混合样品，主要是根据各蛋白质各组分的电泳迁移率的不同。这种差别蛋白质各组分的电泳迁移率的不同。这种差别就蛋白质分子本身而言，主要与其所带净电荷就蛋白质分子本身而言，主要与其所带净电荷以及分子量和外形有关。以及分子量和外形有关。当电泳体系中含有一定浓度的十二烷基硫当电泳体系中含有一定浓度的十二烷基硫酸钠酸钠SDS时，那么得电泳迁移率的大小只时，那么得电泳迁移率的大小只取决于蛋白质的分子量，从而可直接由电泳迁取决于蛋白质的分子量，从而可直接由电泳迁移率推算出蛋白质的分子量。移率推算出蛋白质的分子量。聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳 SDS-PAGE0.5 1.0kD3302

10、2067603618.5kD9467433020.114.4Mol masskD30020010080605040302010Migration(Rf)Pharmacia:Molecular Markers for electrophoresis1蛋白质胶体溶液的稳定性蛋白质胶体溶液的稳定性 蛋白质颗粒大小属于胶体粒子的范围蛋白质颗粒大小属于胶体粒子的范围(1-100 nm)。又。又由于其分子外表有许多极性基团，亲水性极强，易溶于由于其分子外表有许多极性基团，亲水性极强，易溶于水成为稳定的亲水胶体溶液。水成为稳定的亲水胶体溶液。蛋白质亲水胶体的稳定性主要取决于两个要素：蛋白质亲水胶体的稳定性主

11、要取决于两个要素：双电层双电层 水化层水化层 a.丁达尔效应丁达尔效应 b.布朗运动布朗运动 c.不能透过半透膜不能透过半透膜三、胶体性质与蛋白质的沉淀三、胶体性质与蛋白质的沉淀2蛋白质的沉淀蛋白质的沉淀 蛋白质胶体溶液的稳定性是有条件的，相对的。蛋白质胶体溶液的稳定性是有条件的，相对的。假假设改动环境条件，破坏其水化膜和双电层，蛋假假设改动环境条件，破坏其水化膜和双电层，蛋白质亲水胶体便失去稳定性，发生絮结沉淀景象，白质亲水胶体便失去稳定性，发生絮结沉淀景象，这既是所谓的蛋白质沉淀作用。这既是所谓的蛋白质沉淀作用。盐析法盐析法salting out：中性盐中性盐NH4SO4，NaSO4，Na

12、Cl等等 蛋白蛋白 质脱去水化层。质脱去水化层。优点：不引起蛋白量变性。优点：不引起蛋白量变性。盐溶盐溶salting in：稀盐溶液中蛋白质溶解度增：稀盐溶液中蛋白质溶解度增 加的景象。加的景象。有机溶剂沉淀法：有机溶剂沉淀法：极性有机溶剂甲醇，乙醇，丙酮极性有机溶剂甲醇，乙醇，丙酮脱去水脱去水 化层以及降低介电常数化层以及降低介电常数 而添加带电质点间的相而添加带电质点间的相 互作用。互作用。条件：低温操作，缩短时间。条件：低温操作，缩短时间。重金属盐沉淀法：重金属盐沉淀法：当溶液当溶液pHpI,蛋白质颗粒带负电荷蛋白质颗粒带负电荷,易与重金属离子易与重金属离子 (Hg2+,Pb2+,Cu

13、2+,Ag+等等)生成沉淀。生成沉淀。生物碱试剂和某些酸类沉淀法：生物碱试剂和某些酸类沉淀法：生物碱试剂生物碱试剂能引起生物碱沉淀的一类试剂。能引起生物碱沉淀的一类试剂。当溶当溶 液液pHpI时时,蛋白质颗粒带正电荷蛋白质颗粒带正电荷 易与生物碱试剂易与生物碱试剂,酸根负离子反响酸根负离子反响沉淀沉淀 用途：临床除去体液中干扰测定的蛋白质用途：临床除去体液中干扰测定的蛋白质NoImage加热变性测定法加热变性测定法缘由：加热变性使蛋白质天然构造解体，疏水基外缘由：加热变性使蛋白质天然构造解体，疏水基外 露，损坏了水化层露，损坏了水化层 用途：制豆腐加热用途：制豆腐加热+少量盐卤少量盐卤1.定义

14、：定义：在某些物理或化学要素作用下，天然蛋白质严密在某些物理或化学要素作用下，天然蛋白质严密的空间构造被破坏，从而导致理化性质改动和生物学的空间构造被破坏，从而导致理化性质改动和生物学活性的丧失如酶失去催化活力，激素丧失活性，活性的丧失如酶失去催化活力，激素丧失活性，那么称之为蛋白量变性作用那么称之为蛋白量变性作用(denaturation)。有些蛋白质的变性是可逆的，经过适当的方法有些蛋白质的变性是可逆的，经过适当的方法如透析将变性剂除去后，蛋白质可以恢复其天然立如透析将变性剂除去后，蛋白质可以恢复其天然立体构造，这个过程称为复性体构造，这个过程称为复性renaturation。普通以为蛋白

15、量变性本质是次级键的破坏，只需普通以为蛋白量变性本质是次级键的破坏，只需空间构象的改动，并不涉及一级构造共价键的变空间构象的改动，并不涉及一级构造共价键的变化。化。四、蛋白质的变性与复性四、蛋白质的变性与复性 化学要素：强酸、强碱、有机溶剂、重金属盐、生物碱试剂、尿素等 物理要素：加热、射线、超声波、猛烈震荡等2.变性要素变性要素l 旋光值改动旋光值改动l 特性粘度添加特性粘度添加l 溶解度降低溶解度降低l 分散系数降低分散系数降低l 结晶才干丧失结晶才干丧失l 易于沉淀，假设加热还会凝固。但假设远离等易于沉淀，假设加热还会凝固。但假设远离等电点电点l 那么不一定沉淀那么不一定沉淀l 变性后蛋

16、白质肽键暴露而更加易于消化变性后蛋白质肽键暴露而更加易于消化3.变性后蛋白质的表现变性后蛋白质的表现变性蛋白质为什么能复性？变性蛋白质为什么能复性？在一定的环境条件下，蛋白质的一级构造可以决议二、三、四级构造。变性蛋白质的二、三、四级构造虽然遭到破坏，但是一级构造依然坚持不变，因此除去变性剂后，在适当的环境条件下，蛋白质能卷曲折叠成为能量最低的构象，普通天然蛋白质正是具有这种能量最低的构象。五、蛋白质分别纯化的普通原那五、蛋白质分别纯化的普通原那么么l 根据分子量：如沉降速度法离心根据分子量：如沉降速度法离心l 根据密度：沉降平衡法离心根据密度：沉降平衡法离心l 根据电荷和分子量：聚丙烯酰胺凝

17、胶电泳根据电荷和分子量：聚丙烯酰胺凝胶电泳l 根据分子量和分子外形：凝胶过滤根据分子量和分子外形：凝胶过滤l 根据溶解度：硫酸铵分级沉淀、有机溶剂分级沉淀根据溶解度：硫酸铵分级沉淀、有机溶剂分级沉淀l 根据电荷：等电点沉淀根据电荷：等电点沉淀六、蛋白质的分别纯化方法六、蛋白质的分别纯化方法 透析：利用半透膜的选择通透性来纯化象透析：利用半透膜的选择通透性来纯化象蛋白质这样的大分子物质的过程叫透析。蛋白质这样的大分子物质的过程叫透析。超越滤：是利用压力或离心力，强行使水超越滤：是利用压力或离心力，强行使水和其他小分子溶质经过半透膜，而蛋白质分和其他小分子溶质经过半透膜，而蛋白质分子被截留在膜上，

18、以到达浓缩和脱盐的目的子被截留在膜上，以到达浓缩和脱盐的目的，有时要用切向流过滤法。，有时要用切向流过滤法。一根据分子大小不同的分别纯化方法一根据分子大小不同的分别纯化方法凝胶过滤法凝胶过滤法 凝胶过滤层析是按照蛋白质分子量大小进展分别的技术，又称之凝胶过滤，分子筛层析或排阻层析。凝胶颗粒内部具有多孔网状构造，被分别的混合物流过层析柱时，比凝胶孔径大的分子不能进入凝胶孔内，在凝胶颗粒之间的空隙向下挪动，并最先被洗脱出来；比网孔小的分子能不同程度的自在出入凝胶孔内外，在柱内经过的路程较长挪动速度较慢，最后被洗脱出来。二利用溶解度差别的纯化方法二利用溶解度差别的纯化方法 影响蛋白质溶解度的外部要素

19、很多，其中主要影响蛋白质溶解度的外部要素很多，其中主要有：溶液的有：溶液的pH、离子强度、介电常数和温度。溶、离子强度、介电常数和温度。溶解度归根结底取决于他们本身的分子构造。解度归根结底取决于他们本身的分子构造。等电点沉淀技术：在等电点等电点沉淀技术：在等电点pH条件下，蛋白质为条件下，蛋白质为电中性，其物理性质如导电性、溶解度、黏度、电中性，其物理性质如导电性、溶解度、黏度、浸透压等都表现为最低值，易发生絮结沉淀。因浸透压等都表现为最低值，易发生絮结沉淀。因此，等电点性质常被用于蛋白质的分别制备，被此，等电点性质常被用于蛋白质的分别制备，被称为等电点沉淀技术。称为等电点沉淀技术。盐析：当离

20、子强度添加到足够高时，例如饱盐析：当离子强度添加到足够高时，例如饱和或半饱和的程度，很多蛋白质可以从水溶和或半饱和的程度，很多蛋白质可以从水溶液中沉淀出来，这种景象称为盐析。液中沉淀出来，这种景象称为盐析。有机溶剂分级分别法：引起蛋白质沉淀的主有机溶剂分级分别法：引起蛋白质沉淀的主要缘由是改动了介质的介电常数。要缘由是改动了介质的介电常数。温度对蛋白质溶解度的影响：温度对蛋白质溶解度的影响：0-40之间，之间，大部分球状蛋白质的溶解度随温度的升高而大部分球状蛋白质的溶解度随温度的升高而添加。添加。三根据电荷不同的纯化方法三根据电荷不同的纯化方法 电泳电泳：在外电场的作用下，带电颗粒向着在外电场

21、的作用下，带电颗粒向着与其电性相反的电极挪动，这种景象称为电泳与其电性相反的电极挪动，这种景象称为电泳。原那么上按电泳的原理来分，可分为：原那么上按电泳的原理来分，可分为：自在界面电自在界面电区带电泳区带电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳PAGE 三种物理效应：样品的浓缩效应、分子筛效应和三种物理效应：样品的浓缩效应、分子筛效应和电荷效应。电荷效应。CH2=CHC=ONH2丙烯酰胺丙烯酰胺N,N-甲叉甲叉双丙烯酰胺双丙烯酰胺CH2=CH C=O NH CH2 NH C=O CH2=CH聚丙烯酰胺聚丙烯酰胺CH2-CHC=ONH2CH2-CH C=O NH CH2 NH C=O CH2-C

22、HCH2 CHC=ONH2CH2-CHC=ONH2CH2-CHCH2-CHCH2-CHC=ONH2CH2-CHCH2-CH()n()n()m()mTris-Gly pH=8.3Tris-Gly pH=8.3Tris-HCl pH=6.8T=3%Tris-HCl pH=8.9T=7.5%聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳 SDS-PAGE0.5 1.0kD33022067603618.5kD9467433020.114.4Mol masskD30020010080605040302010Migration(Rf)Pharmacia:Molecular Markers for electroph

23、oresis 此法是利用离子交换树脂作为柱层析支持物，此法是利用离子交换树脂作为柱层析支持物，将带有不同电荷的蛋白质进展分别的方法。将带有不同电荷的蛋白质进展分别的方法。假设选择阳离子交换树脂，那么带正电荷的物质假设选择阳离子交换树脂，那么带正电荷的物质与与H+发生交换而结合在树脂上。发生交换而结合在树脂上。假设选择阴离子交换树脂，那么带负电荷的物质假设选择阴离子交换树脂，那么带负电荷的物质可与可与OH-发生交换而结合在树脂上。发生交换而结合在树脂上。物质在树脂上结合的结实程度即亲和力大小有差物质在树脂上结合的结实程度即亲和力大小有差别，因此选用适当的洗脱液便可将混合物中的组分别，因此选用适当

24、的洗脱液便可将混合物中的组分逐个洗脱下来，到达分别纯化的目的。逐个洗脱下来，到达分别纯化的目的。离子交换：离子交换：六六 亲和层析亲和层析 亲和层析法就是利用化学方法将可与待分别亲和层析法就是利用化学方法将可与待分别物质可逆性特异结合的化合物称配体衔接到物质可逆性特异结合的化合物称配体衔接到某种固相载体上，并将载有配体的固相载体装柱，某种固相载体上，并将载有配体的固相载体装柱，当待提纯的生物大分子经过此层析柱时，此生物当待提纯的生物大分子经过此层析柱时，此生物大分子便与载体上的配体特异的结合而留在柱上，大分子便与载体上的配体特异的结合而留在柱上，其他物质那么被冲洗出去。然后再用适当方法使其他物

25、质那么被冲洗出去。然后再用适当方法使这种生物大分子从配体上分别并洗脱下来，从而这种生物大分子从配体上分别并洗脱下来，从而到达分别提纯的目的到达分别提纯的目的 。抗原和抗体抗原和抗体 激素和受体蛋白激素和受体蛋白 凝集素和糖蛋白凝集素和糖蛋白配体配体蛋白质蛋白质蛋白质和配蛋白质和配体复合物体复合物交联试剂交联试剂载体载体配体配体载体与配体载体与配体交联体交联体杂质杂质杂质杂质游离配体游离配体七、蛋白质的含量测定与纯度七、蛋白质的含量测定与纯度l 测定蛋白质的量是研讨蛋白质的最根本的一步。测定蛋白质的量是研讨蛋白质的最根本的一步。l 溶液中蛋白质的浓度测定方法很多，最早的经典溶液中蛋白质的浓度测定

26、方法很多，最早的经典方法是凯氏定氮法，稍后运用较广泛的方法是双方法是凯氏定氮法，稍后运用较广泛的方法是双缩脲法、福林酚法和紫外吸收法，近年来大多缩脲法、福林酚法和紫外吸收法，近年来大多数人用考马斯亮蓝法。数人用考马斯亮蓝法。一蛋白质的含量测定一蛋白质的含量测定1.双缩脲法双缩脲法l 双缩脲法是基于蛋白质分子中的肽键，凡具双缩脲法是基于蛋白质分子中的肽键，凡具两个以上肽键的物质均会发生双缩脲反响。两个以上肽键的物质均会发生双缩脲反响。l 在碱性溶液中蛋白质可以与在碱性溶液中蛋白质可以与Gu2构成紫红构成紫红色络合物，其颜色的深浅与蛋白质的浓度成色络合物，其颜色的深浅与蛋白质的浓度成正比，而与蛋白

27、质的分子量和氨基酸组成无正比，而与蛋白质的分子量和氨基酸组成无关。关。2.福林酚法福林酚法l 福林酚法主要基于蛋白质在碱性溶液中能与铜福林酚法主要基于蛋白质在碱性溶液中能与铜构成复合物，此复合物以及芳香族氛基酸残基可构成复合物，此复合物以及芳香族氛基酸残基可以复原酚试剂而产生蓝色，再与规范蛋白质以复原酚试剂而产生蓝色，再与规范蛋白质(通常通常采用牛血洁白蛋内采用牛血洁白蛋内)比色定量。比色定量。l 福林福林酚试剂法灵敏度高，但是假设样品和规范酚试剂法灵敏度高，但是假设样品和规范蛋白质的芳香族氨基酸差别较大时，会有较大的蛋白质的芳香族氨基酸差别较大时，会有较大的系统误差。系统误差。3.紫外吸收法

28、紫外吸收法 蛋白质组成中常含有酪氨酸等芳香族氨基酸，蛋白质组成中常含有酪氨酸等芳香族氨基酸，在紫外光在紫外光280nm波优点有最大吸收峰，故可用波优点有最大吸收峰，故可用280nm波长的光吸收即光密度的大小来测定普波长的光吸收即光密度的大小来测定普通蛋白质的含量。通蛋白质的含量。4.考马氏亮蓝法考马氏亮蓝法l 考马斯亮蓝考马斯亮蓝G-250是一种染料，在游离形状下呈是一种染料，在游离形状下呈红色，与蛋白质结合那么呈现蓝色。在一定范红色，与蛋白质结合那么呈现蓝色。在一定范围内，溶液在围内，溶液在595nm波长下的吸光度与蛋白质波长下的吸光度与蛋白质含量成正比，可用比色法测定。含量成正比，可用比色法测定。l 本法试剂配制简单，操作简便，是一种常见的本法试剂配制简单，操作简便，是一种常见的蛋白质快速微量测定方法。蛋白质快速微量测定方法。二蛋白质纯度鉴定二蛋白质纯度鉴定 电泳、沉淀、HPLC、N末端测序等 本章根本要求 1.掌握蛋白质的酸碱性质。2.掌握测定蛋白质相对分子质量的常用方法。3.掌握蛋白质的胶体性质与蛋白质沉淀的方 法和原理。4.掌握蛋白质分别纯化的普通原那么。5.熟习蛋白质分别纯化的常用方法。6.了解蛋白质含量测定与纯度鉴定的常用方法。