免疫散射比浊法与PCR

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1、散射比浊法是指一定波长的光沿水平轴照射，通过溶液使遇到抗原抗体复合物粒子，光线被粒子颗粒折射， 发生偏转，光线偏转的角度与发射光的波长和抗原抗体复合物颗粒大小和多少密切相关。散射光的强度与 复合物的含量成正比，即待测抗原越多，形成的复合物也越多，散射光也越强。散射光的强度还与各种物 理因素，如加入抗原或抗体的时间、光源的强弱和波长、测量角度等密切相关。（一）散射颗粒与散射光 悬浮在反应溶液中的分子，无论是固体或胶体粒子都可以是散射中心，当入射光通过时，如果颗粒直 径比入射光的波长小很多，则散射光的分布比较均匀，称为Rayleigh散射。如果颗粒直径接近于入射光的 波长，则散射光的分布明显不均匀

2、，称为 Mile 散射。（二）反应物含量与散射浊度抗原抗体结合反应中，遵守典型的Heidelberger曲线，即当抗体量恒定时，抗原与抗体结合，形成免 疫复合物的反应与散射信号响应值的上升呈正比。多聚集链反应（polymerase chain reaction,PCR）技术发明至今已近20年了，在这期间技术得到了不断 的发展，近年来出现的实时荧光定量PCR（real-time quantitative PCR）技术实现了 PCR从定性到定量 的飞跃，它以其特异性强、灵敏度高、重复性好、定量准确、速度快、全封闭反应等优点成为了分子生物 学研究中的重要工具，本文就此技术及其应用做一综述。1实时荧光

3、定量PCR技术的方法学1.1原理 所谓real-time Q-PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实时监 测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。在real-time技术的发展过程中， 两个重要的发现起着关键的作用：（1）在90年代早期，Taq DNA多聚酶的5核酸外切酶活性的发现，它 能降解特异性荧光记探针，因此使得间接的检测PCR产物成为可能。（2）此后荧光双标记探针的运用使在 一密闭的反应管中能实时地监测反应全过程。这两个发现的结合以及相应的仪器和试剂的商品化发展导致 real-time Q-PCR 方法在研究工作中的运用。PCR反应过

4、程中产生的DNA拷贝数是呈指数方式增加的，随着反应循环数的增加，最终PCR反应不再 以指数方式生成模板，从而进入平台期。在传统的PCR中，常用凝胶电泳分离并用荧光染色来检测PCR反 应的最终扩增产物，因此用此终点法对PCR产物定量存在不可靠之处。在real-time Q-PCR中，对整个PCR 反应扩增过程进行了实时的监测和连续地分析扩增相关的荧光信号，随着反应时间的进行，监测到的荧光 信号的变化可以绘制成一条曲线。在PCR反应早期，产生荧光的水平不能与背景明显地区别，而后荧光的 产生进入指数期、线性期和最终的平台期，因此可以在PCR反应处于指数期的某一点上来检测PCR产物的 量，并且由此来推

5、断模板最初的含量。为了便于对所检测样本进行比较，在real-time Q-PCR反应的指数 期，首先需设定一定荧光信号的域值，一般这个域值（threshold）是以PCR反应的前15个循环的荧光信 号作为荧光本底信号（baseline）,荧光域值的缺省设置是315个循环的荧光信号的标准偏差的10倍。 如果检测到荧光信号超过域值被认为是真正的信号，它可用于定义样本的域值循环数（ Ct）。 Ct 值的含义 是：每个反应管内的荧光信号达到设定的域值时所经历的循环数。研究表明，每个模板的Ct值与该模板的 起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，Ct值越小。利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准 曲

6、线，因此只要获得未知样品的 Ct 值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。1.2荧光化学目前real-time Q-PCR所使用的荧光化学方法主要有五种，分别是：DNA结合染色，水解 探针，分子信标，荧光标记引物，杂交探针。它们又可分为扩增序列特异和非特异的检测两大类。扩增序列非特异性检测方法的基础是DNA结合的荧光分子，如SYBR green 1等荧光染料。Real-time Q-PCR发展早期就是运用这种最简单的方法，在PCR反应体系中，加入过量SYBR green 1荧光染料，SYBR green 1荧光染料特异性地掺入DNA双链后，发射荧光信号。荧光染料的优势在于它能监测任何ds

7、DNA序 列的扩增，不需要探针的设计，使检测方法变得简便，同时也降低了检测的成本。然而正是由于荧光染料 能和任何dsDNA结合，因此它也能与非特异的dsDNA （如引物二聚体）结合，使实验容易产生假阳性信号。 引物二聚体的问题目前可以用带有熔解曲线（melting curve ）分析的软件加以解决。扩增序列特异性检测方法是在 PCR 反应中利用标记荧光染料的基因特异寡核苷酸探针来检测产物，它 又可分为直接法和间接法。间接的方法就是利用水解探针的策略。目前在 real-time Q-PCR 中最广泛使用 的TaqMan系统就是运用了这个原理。PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探

8、针，该探 针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团，此时5端荧光基团吸收能量后 将能量转移给临近的3端荧光淬灭基团(发生荧光共振能量转移，FRET),因此探针完整时，检测不到该 探针 5端荧光基团发出的荧光。但在 PCR 扩增中，溶液中的模板变性后低温退火时，引物与探针同时与 模板结合。在引物的介导下，沿模板向前延伸至探针结合处，发生链的置换，Taq酶的5 -3外切酶活性 (此活性是双链特异性的，游离的单链探针不受影响)将探针 5端连接的荧光基团从探针上切割下来， 游离于反应体系中，从而脱离 3端荧光淬灭基团的屏蔽，接受光刺激发出荧光信号，即每扩增一条 DNA 链，就有一

9、个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。直接的方法指的是标记荧光的探针与扩增产物结合后即直接产生荧光，分子信标(molecular beacon) 就属于这一类，它本质上是一种标记荧光的发夹探针，当探针分子呈发夹结构时，结合在其两端的荧光基 团距离上接近，使得产生能量转移效应，而不发生荧光。当互补序列出现时，探针与 DNA 杂交，探针转变 成一个开放的结构，呈线性，报告荧光基团与淬灭荧光基团彼此在空间上产生足够的分离，荧光基团脱离 了淬灭基团的影响，从而产生可被检测到的荧光。荧光标记引物是从分子信标的概念变化而产生的一种联 合分子探针系统，它把荧光基团标记的发夹结构的序列

10、直接与PCR引物相结合，从而使荧光标记基团直接 掺入PCR扩增产物中。目前主要有两种：日出引物(sunrise primes)和蝎子引物(scorpion primes)。 杂交探针(hybridization probe )使用两个特异的探针，其中上游的探针的 3端标记有供体荧光素 (donor)，而下游的探针的5端标记有受体荧光素(acceptor)。在PCR中模板退火阶段，两探针同时与 扩增产物杂交，并形成头尾结合的形式，使供体和受体荧光素距离非常接近，两者产生荧光共振能量转移 (FRET，此作用与上述水解探针的方式相反)，使得受体荧光基团发出荧光；当两探针处于游离状态时，无 荧光产生。

11、由于反应中运用了两个探针，因此增加了方法的特异性，另外也可利用荧光寡核苷酸熔解曲线 (melting curve)对与寡核苷酸探针结合的序列进行分析，从中获取有用的信息。1.3定量方法 在real-time Q-PCR中，模板定量有两种策略；相对定量和绝对定量。相对定量指的是在 一定样本中靶序列相对于另一参照样本的量的变化。绝对定量指的是用已知的标准曲线来推算未知的样本 的量。1.3.1 标准曲线的法的相对定量 由于在此方法中量的表达是相对于某个参照物的量而言的，因此相对定 量的标准曲线就比较容易制备，对于所用的标准品只要知道其相对稀释度即可。在整个实验中样本的靶序 列的量来自于标准曲线，最终

12、必须除以参照物的量，即参照物是1*的样本，其它的样本为参照物量的n倍。 在实验中为了标准化加入反应体系的RNA或DNA的量，往往在反应中同时扩增一内源控制物，如在基因表 达研究中，内源控制物常为一些管家基因(如beta-actin,3-磷酸甘油醛脱氢酶GAPDH等)。1.3.2比较CT法的相对定量 比较CT法与标准曲线法的相对定量的不同之处于在于其运用了数学公式来 计算相对量，前提是假设每个循环增加一倍的产物数量，在PCR反应的指数期得到CT值来反应起始模板的 量，一个循环(CT=1)的不同相当于起始模板数2倍的差异。但是此方法是以靶基因和内源控制物的扩增 效率基本一致为前提的，效率的偏移将影

13、响实际拷贝数的估计。1.3.3 标准曲线法的绝对定量 此方法与标准曲线法的相对定量的不同之处在于其标准品的量是预先可 知的。质粒DNA和体外转入的RNA常作为绝对定量标准品的制备之用。标准品的量可根据260nm的吸光度 值并用 DNA 或 RNA 的分子量来转换成其拷贝数来确定。2实时荧光定量PCR技术的应用Real-time Q-PCR的应用范围很广泛，包括mRNA表达的研究、DNA拷贝数的检测、单核苷酸多态性 (SNPs)的测定等。以下就目前real-time Q-PCR在易位基因的检测，细胞因子的表达分析，肿瘤耐药基 因表达的研究以及病毒感染的定量监测中的应用作一概述。2.1 微小残留病

14、变的检测 肿瘤疾病尤其是血液的恶性肿瘤常伴有特异性基因的易位，这种易位往往可以 作为监测临床治疗效果的一种肿瘤标志。虽然在过去的几十年里治疗方案的改进已大大地延长了病人的生 存期，但是缓解期的病人仍存在复发的危险性。因此微小残留病变(MRD)的检测对于进一步调整治疗方案 是至关重要的。 Real-time Q-PCR 的应用正成为检测肿瘤微小残留分子标志的一种必备的研究工具。通过 对肿瘤融合基因的定量测定能指导临床对病人实行个体化的治疗。急性粒细胞性白血病(AML)最常见的染 色体异常是交互易位t(8； 21) (q 22； q22),在这易位中，AML-1转录因子基因和8号染色体的MTG8基

15、因 发生融合，致使正常的 AML-1 转录调控受到影响，这可能是白血病的病因。目前的研究证明用 real-time Q-PCR 来检测融合基因有助于对这些病人的 MRD 进行定量，其作为预后的指标或对治疗方案的评估是有价 值的。同样的方法也被用于定量其它的易位融合基因水平，如慢性粒细胞性白血病(CML)的BCR-ABL融合 基因；急性淋巴细胞性白血病(ALL)的白血病特异的TEL-AML1融合基因；滤泡状淋巴瘤(FL)的染色体 易位t(14;18)(q32;q21)和bcl-2重排等。许多研究都在很大程度上受益于real-time Q-PCR方法的应用， 随着技术的发展，Real-time Q

16、-PCR的运用将不断地扩大。2.2 细胞因子的表达分析 细胞因子是调节蛋白，它通过调节免疫反应(包括淋巴细胞活化、增殖、分化、 生存和凋亡)在免疫系统中起着核心作用。许多不同类型的细胞都能分泌这种低分子量的蛋白质，其中包 括淋巴细胞、抗原递呈细胞、单核细胞、内皮细胞和成纤维细胞。细胞因子可被分为不同的组；白介素(IL-1 IL-23),干扰素(IFN-a , IFN-丫等)，集落刺激因子(CSF),肿瘤坏死因子(TNF),肿瘤生长因子(TGF-0 等)和化学因子(MCP-1, MIP-1等)。为了阐明在许多炎症反应，自身免疫性疾病和器官移植排异中的免 疫致病途径，细胞因子mRNA表达谱的可靠定

17、量是很重要的。尽管被检样本中细胞因子含量往往极低，然而 real-time反转灵PCR (RT-PCR)以其高敏感性和准确性在细胞因子的定量中越来越受到青睐。2.3 肿瘤耐药基因表达的研究 对化疗药物的耐药是治疗肿瘤病人的主要障碍。由于耐药限制了许多肿瘤 的成功治疗，因此研究肿瘤细胞对耐药机制就变得十分重要。目前研究中发现主要的耐药机制有：ATP结 合盒基因超家族(ATP-binding cassette superfamily)的膜转运蛋白介导的耐药，这些蛋白包括：MDR-1 基因编码的P-糖蛋白(P-gp),多药耐药相关蛋白(MRP),肺耐药相关蛋白(LRP),乳腺癌耐药蛋白(BCRP)

18、等；酶介导的耐药，包括拓扑导构酶(Topo),谷胱甘肽(GSH)及谷胱甘肽-S-转移酶(GST),蛋白激酶C(PKC),脱氧胞卩密喘核昔激酶(deoxycytidine kinase)等，凋亡基因介导的耐药，如bcl-2家族，p53 基因，c-myc等。多药耐药(MDR)是多因素，多种机制共同作用的结果。real-time反转录PCR (RT-PCR) 是了解肿瘤耐药，指导临床治疗策略的有用手段，它能观测用药前后及复发时肿瘤细胞的耐药基因mRNA表 达变化，从而及时调整治疗方案和评价疾病的预后。2.4 病毒感染的定量监测 扩增技术的发展使得对病毒的定性或定量检测的能力随之提高，也使研究病毒 的

19、负荷和疾病进展的关系成为可能。 Real-time Q-PCR 是主要被运用于科研和诊断领域的扩增技术，它不 仅能对病毒定性，而且由于其实验的批间和批内差异小，重复性好，因此能方便、快速、灵敏、准确地定 量病毒DNA或RNA的序列，更重要的是从中可以动态地研究在整个病程中潜在病毒的复活或持续，从而使 临床医生和病毒学家能检测临床的变化，如抗病毒治疗的效果，耐药变异的出现等。目前运用较多的是在 器官移值中对使用免疫抑制剂的病人用Real-time Q-PCR来定量测定CMV感染。研究表明在骨髓移植的病 人中用Real-time Q-PCR检测CMV感染比传统的pp65抗原试验更敏感，抗CMV药物

20、治疗能使血中的病毒含 量下降，Real-time Q-PCR对于快速定量骨移植病人的CMV感染和监测CMV复活是一个有用的工具。3 存在的问题及应用前景在real-time Q-PCR技术中，无论是相对定量还是标准曲线定量方法仍存在一些PCR定量方法均有的 问题有待解决。在标准曲线定量中，标准品的制备是一个必不可少的过程。目前由于无一统一标准，各个 实验室所用的生成标准曲线的样品各不相同，致使实验结果缺乏可比性。此外，用real-time Q-PCR来研 究mRNA时，受到不同RNA样本存在不同的逆转录(RT)效率的限制。在相对定量中，其前提是假设内源控 制物不受实验条件的影响的，合理地选择合

21、适的不受实验条件影响的内源控制物也是实验结果可靠与否的 关键。另外，与传统的 PCR 技术相比， Real-time Q-PCR 的不足之处是：(1)由于运用了封闭的检测，减 少了扩增后电泳的检测步骤，因此也就不能监测扩增产物的大小；(2)因为荧光素种类以及检测光源的局 限性，从而相对地限制了 real-time Q-PCR的复合式(multiplex)检测的应用能力；(3)目前real-time Q-PCR实验成本比较高，从而也限制了其广泛的应用。Real-time PCR 与 RT-PCR 比较Real-time PCR与RT-PCR是两种不同的PCR方法，适用范围也不同。Real-tim

22、e PCR中文译作“实时聚合酶链反应”，是一种最新发展的定量PCR技术。该技术借助于荧光信号来检 测PCR产物，一方面提高了灵敏度，另一方面还可以做到PCR每循环一次就收集一个数据，建立实时扩增曲线， 准确地确定CT值，从而根据CT值确定起始DNA拷贝数，做到了真正意义上的DNA定量，较以往常用的终点定量 的方法更加准确。根据所使用的技术不同，荧光定量PCR又可以分为TaqMan探针和SYBR Green I荧光染料两种 方法。Real-time PCR所采用的专用PCR仪能够自动在每个循环的特定阶段对反应体系的荧光强度进行检测，实 时的记录荧光强度的改变，从而对样品的浓度进行精确的定量。RT

23、-PCR是Reverse transcription PCR的简称，中文译作逆转录聚合酶链反应”，是将RNA的反转录（RT）和 cDNA的聚合酶链式扩增（PCR）相结合的技术。首先经反转录酶的作用从RNA合成cDNA，再以cDNA为模板，扩 增合成目的片段。RT-PCR技术灵敏而且用途广泛，可用于检测细胞中基因表达水平，细胞中RNA病毒的含量和直 接克隆特定基因的cDNA序列。作为模板的RNA可以是总RNA、mRNA或体外转录的RNA产物。无论使用何种RNA， 关键是确保RNA中无RNA酶和基因组DNA的污染。用于反转录的引物可视实验的具体情况选择随机引物、Oligo dT 及基因特异性引物中

24、的一种。对于短的不具有发卡结构的真核细胞mRNA，三种都可。但二者的基本原理是相同的， 即 PCR 技术。RT-PCR基础RT-PCR将以RNA为模板的cDNA合成同PCR结合在一起，提供了一种分析基因表达的快速灵敏的方法。RT-PCR用于对表达信息进行 检测或定量。另外，这项技术还可以用来检测基因表达差异或不必构建cDNA文库克隆cDNA。RT-PCR比其他包括Northern印迹、RNase 保护分析、原位杂交及S1核酸酶分析在内的RNA分析技术，更灵敏，更易于操作。RT-PCR的模板可以为总RNA或poly（A）+选择性RNA。逆转录反应可以使用逆转录酶，以随机引物、oligo（dT）或

25、基因特异性的引物（GSP） 起始。RT-PCR可以一步法或两步法的形式进行。在两步法RT-PCR中，每一步都在最佳条件下进行。cDNA的合成首先在逆转录缓冲液 中进行，然后取出1/10的反应产物进行PCR。在一步法RT-PCR中，逆转录和PCR在同时为逆转录和PCR优化的条件下，在一只管中 顺次进行。两步法RT-PCR比较常见，在使用一个样品检测多个mRNA时比较有用。然而一步法RT-PCR具有其他优点（表3）。一步法RT-PCR在处理大量样品时易于操作，有助于减少残余污染，因为在cDNA合成和扩增之间不需要打开管盖。一步法可以得到更高 的灵敏度，最低可以达到0.1pg总RNA,这是因为整个c

26、DNA样品都被扩增（图9）。对于成功的一步法RT-PCR，一般使用反义的基因特异性引物起始cDNA合成。表3. 一步法和两步法RT-PCR的比较起始第一链cDNA合成使用:起始第一链合成使用GSP引物Oligo(dT)GSP引物优点优点灵活方便引物选择扩增酶同逆转录酶预先混合扩增酶的选择转管步骤少，减少污染可能性困难RT-PCR的优化能力高灵敏度同Platinum酶结合提高特异性适用于大量样品分析同Platinum Pfx Taq DNA聚合酶结合提高忠实性适用于定量PCR适用于在单个样品中检测几个mRNA关于扩增酶和产物大小应注意：对于小于4kb的产物使用Taq DNA聚合酶或Platinu

27、m Taq DNA聚合酶对于小于 12kb 的产物使用 Platinum Pfx Taq DNA 聚合酶或 Platinum Taq DNA Polymerase High Fidelity对于大于12kb的产物使用ELONGAE Enzyme Mix对于一步法RT-PCR，如果产物小于3.5kb，使用Taq DNA聚合酶或Platinum Taq DNA聚合酶；如果 产物小于 9kb，使用 Platinum Taq DNA Polymerase High FidelityoRT-PCR原理RT-PCR是将RNA的反转录（RT）和cDNA的聚合酶链式扩增（PCR）相结合的技术。首先经反转录酶的

28、 作用从RNA合成cDNA，再以cDNA为模板，扩增合成目的片段。RT-PCR技术灵敏而且用途广泛，可用于检 测细胞中基因表达水平，细胞中RNA病毒的含量和直接克隆特定基因的cDNA序列。作为模板的RNA可以是 总RNA、mRNA或体外转录的RNA产物。无论使用何种RNA,关键是确保RNA中无RNA酶和基因组DNA的污 染。RT-PCR是将RNA的反转录（RT）和cDNA的聚合酶链式扩增（PCR）相结合的技术。首先经反转录酶的 作用从RNA合成cDNA，再以cDNA为模板，扩增合成目的片段。RT-PCR技术灵敏而且用途广泛，可用于检 测细胞中基因表达水平，细胞中RNA病毒的含量和直接克隆特定基

29、因的cDNA序列。作为模板的RNA可以是 总RNA、mRNA或体外转录的RNA产物。RT-PCR用于对表达信息进行检测或定量。另外，这项技术还可以 用来检测基因表达差异或不必构建cDNA文库克隆cDNA。RT-PCR比其他包括Northern印迹、RNase保护分 析、原位杂交及S1核酸酶分析在内的RNA分析技术，更灵敏，更易于操作。逆转录反应可以使用逆转录酶, 以随机引物、oligo（dT）或基因特异性的引物（GSP）起始。RT-PCR可以一步法或两步法的形式进行。在两 步法RT-PCR中，每一步都在最佳条件下进行。cDNA的合成首先在逆转录缓冲液中进行，然后取出1/10的 反应产物进行PC

30、R。在一步法RT-PCR中，逆转录和PCR在同时为逆转录和PCR优化的条件下，在一只管中 顺次进行。逆转录酶（reverse transcriptase）是存在于RNA病毒体内的依赖RNA的DNA聚合酶，至少具有以下 三种活性：1、依赖RNA的DNA聚合酶活性：以RNA为模板合成cDNA第一条链；2、Rnase水解活性：水解RNA杂合体中的RNA；3、依赖DNA的DNA聚合酶活性：以第一条DNA链为模板合成互补的双链cDNA.） : l# q J9 t 用于反转录的引物可视实验的具体情况选择随机引物、Oligo dT及基因特异性引物中的一种。对于短的不 具有发卡结构的真核细胞mRNA，三种都可。