分子杂交课件

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1、分子杂交核酸分子杂交Nucleic Acid HybridizationNucleic Acid Hybridization分子杂交1 分子杂交概念及应用分子杂交：在分子克隆中的一类核酸和蛋白质分析方法，用于检测混合样品中特定核酸分子或蛋白质分子是否存在，以及其相对分子质量的大小。分子杂交 分子杂交实质上是DNA或RNA单链之间退火形成DNA/RNA或DNA/DNA杂合分子。应用范围：应用范围：重组子鉴别 基因分离 DNA片段分析 基因表达研究 。分子杂交 当用一个标记核酸分子与核酸样品杂交，便可以查明该样品中是否存在与该标记核酸分子具有同源性的分子。分子杂交2 探针的概念及其标记技术2.1

2、探针(probe):用于检测特定基因或转录产物存在或表达的DNA、RNA或寡核苷酸。分子杂交 2.2 探针的标记技术 2.2.1 均匀标记 2.2.2 末端标记分子杂交2.2.1 均匀标记 切口平移法标记 DNaseI HO P5 35 35 3DNaseI与与Pol I 的的切口移位切口移位Pol I分子杂交 随机引物标记 PCR扩增标记 要求：a-32PdNTP 分子杂交5353555555333333555-5分子杂交2.2.2 末端标记 DNA片段的末端标记 Klenow酶 3-末端补平(3-末端标记)5-ACGTTGCAAACTG-3 3-TGCAACGTTTGAC-5分子杂交四种不

3、同的补平反应四种不同的补平反应5-GGATCC-3 BamHI 5-G GATCC-33-CCTAGG-5 3-CCTAG G-5 dNTP dGTP dGTP/dATP dGTP/dATP/dTTP5-GGATC 5-GG 5-GGA 5-GGAT 3-CCTAG 3-CCTAG 3-CCTAG 3-CCTAG GATCC-3 GATCC-3 GATCC-3 GATCC-3 CTAGG-5 GG-5 AGG-5 TAGG-5 I S1 S1 S1 5-GG CC-3 5-GGA TCC-3 5-GGAT ATCC-3 3-CC GG-5 3-CCT AGG-5 3-CCTA TAGG-5 I

4、I III 分子杂交 T4 DNA polymerase T7 DNA polymerase T4 多核苷酸激酶(T4 polynucleotide kinase)末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)分子杂交 合成寡核苷酸的标记 T4 多核苷酸激酶(T4 polynucleotide kinase)末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)分子杂交3 分子杂交技术根据检测对象的不同：Southern 杂交 Northern杂交 Western杂交 斑点杂交 狭线杂交 菌落杂交分子杂交 1975年,Southern印迹杂交（Southern blot）由英国人埃德温迈勒萨瑟恩（Edwin Mellor South

5、ern）创建。3.1 Southern 杂交埃德温迈勒萨瑟恩 分子杂交Southern 杂交操作步骤：印迹转移(blotting)将DNA片段从琼脂糖凝胶转移到滤膜的方式。分子杂交 印迹转移方式(1)毛细管渗吸法分子杂交白瓷盘白瓷盘玻璃板玻璃板滤纸滤纸凝胶凝胶尼龙膜尼龙膜滤纸滤纸吸水纸吸水纸玻璃板玻璃板重物重物毛细管渗吸法毛细管渗吸法分子杂交真空转膜槽真空转膜槽滤纸滤纸尼龙膜尼龙膜凝胶凝胶盖子盖子印迹转移方式印迹转移方式(2)真空转膜真空转膜分子杂交分子杂交印迹转移方式(3)电转移分子杂交 分子杂交 预杂交 目的：将滤膜的空白处用鱼精DNA或牛奶蛋白封闭起来，防止在杂交过程中滤膜本身对探针的吸

6、附。预杂交液实际上就是不含探针的杂交液，其中主要含有鱼精DNA、牛血清等，这些大分子可以封闭膜上所有非特异性吸附位点。分子杂交 杂交 在一定的溶液和温度下，将标记的探针与滤膜混合；洗涤 25 1SSC/0.1%SDS 杂交温度 0.25SSC/0.1%SDS 放射性自显影或生化检测。分子杂交带有DNA片段的凝胶DNA分子分子酶切片段酶切片段 限制性酶切限制性酶切琼脂糖电泳琼脂糖电泳 通过毛细管渗吸或电转移或真空转移方式8080或紫外线处理将或紫外线处理将DNA固固定在滤膜上定在滤膜上杂交、显影杂交、显影凝胶凝胶滤膜滤膜0.4MNaOH溶液中DNA变性在1.5MNacl+1MTris中和，保存单

7、链状态。吸附有ssDNA的膜Southern Southern 印迹杂交的技术流程印迹杂交的技术流程分子杂交Southern杂交Edward Southern（1）提取总DNA（2）酶解（3）电泳（4）转移到滤膜（5）变性解链（6）DNA探针及杂交（7）洗脱（8）放射自显影（9）比较分析分子杂交Southern杂交的主要应用：判断某一生物样品中是否存在某一基因，以及该基因所在的限制性酶切片段的大小。分子杂交3.2 Northern杂交 印迹转移的是总RNA或mRNA。应用：在转录水平上某基因是否表达，在有合适对照的情况下，通过杂交信号的强弱可比较基因表达的强弱。分子杂交3.3 Western杂

8、交 印迹转移的是蛋白质。将待检测蛋白质（或酶）经PAGE电泳并染色后，转移到滤膜上固定，再用“抗体-抗原”免疫反应鉴别滤膜上的蛋白质。探针:针对某一蛋白质制备的特异性抗体。分子杂交 以上分子杂交可以获得精确的结果，但操作繁杂。当样品量比较大时，难以满足试验需求。当样品量比较大时，可以采用简化的方式做初步的检测，然后再对阳性样品作精确的检测。分子杂交 3.4 菌落杂交基本操作步骤：将细菌菌落影印到滤膜上；对滤膜上的菌体做原位裂解使DNA释放处来，并固定在滤膜上；分子杂交。用途：从质粒或黏粒载体构建的基因文库中寻找阳性克隆子，然后Southern杂交进一步筛选。分子杂交3.5 噬菌斑杂交基本操作步骤：将噬菌体基因组文库影印到滤膜上，使噬菌体中的DNA释放并固定在滤膜上。分子杂交 用途：从噬菌体载体构建的基因文库中寻找阳性克隆子，通过Southern杂交进一步验证。分子杂交3.6 斑点杂交 直接将DNA或RNA以斑点的形式固定在滤膜上，然后进行分子杂交。当核酸分子的斑点面积变得更小时，在单位面积滤膜上处理的样品的数量更多。当检测的灵敏度进一步提高时，就发展为DNA芯片。分子杂交小结：本节主要讲述探针的标记技术、常见分子杂交基本操作技术。要求你们掌握这些技术。作业：1、探针的标记技术有哪些？2、southern杂交技术基本操作步骤是什么？分子杂交