色谱知识介绍

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1、HPLC色谱知识及应用色谱知识及应用 反相分配色谱反相分配色谱 极性极性:固定相固定相 流动相流动相固定相固定相-极性极性流动相流动相(己烷己烷,庚烷庚烷)-非极性非极性极性极性物质后出峰物质后出峰正相色谱正相色谱 20%反相色谱反相色谱80%正相正相&反相色谱反相色谱 硅胶基质硅胶基质-pH 38 Al2O3.nH2O-pH114 聚合物基质聚合物基质-pH114高或低高或低pH下下,硅胶会溶解硅胶会溶解化学修饰困难化学修饰困难孔结构复杂孔结构复杂,孔径不均匀导致柱效不够高孔径不均匀导致柱效不够高,有有机溶剂可能导致聚合物基质溶涨而受损机溶剂可能导致聚合物基质溶涨而受损柱填料基质柱填料基质硅

2、胶纯度硅胶纯度 填料硅胶的纯度与残留金属离子浓度填料硅胶的纯度与残留金属离子浓度色谱柱尺寸色谱柱尺寸 填料床的长度和内径填料床的长度和内径颗粒形状颗粒形状 球型或不规则型球型或不规则型粒径粒径 平均颗粒直径平均颗粒直径,通常通常3-10m表面积表面积 颗粒外表面和内部孔表面的总和颗粒外表面和内部孔表面的总和,以以m2/gram表表示示孔径孔径 颗粒的孔或腔的平均尺寸颗粒的孔或腔的平均尺寸,范围范围80-300 色谱柱物理性质色谱柱物理性质C-18柱柱-性能影响因素性能影响因素键合类型键合类型 单体键合单体键合-键合相分子与基体单点相连键合相分子与基体单点相连 聚合体键合聚合体键合-键合相分子与

3、基体多点相连键合相分子与基体多点相连碳覆盖率碳覆盖率 键合相的键合量常用含碳量键合相的键合量常用含碳量(C%)来表示，也可以用覆盖度来来表示，也可以用覆盖度来表示。所谓覆盖度是指参与反应的硅醇基数目占硅胶表面硅醇基总数表示。所谓覆盖度是指参与反应的硅醇基数目占硅胶表面硅醇基总数的比例。的比例。封端封端 键合步骤之后键合步骤之后,用短链将裸露的硅羟基键合后封闭起来用短链将裸露的硅羟基键合后封闭起来色谱柱化学性质色谱柱化学性质C-18柱柱-性能影响因素性能影响因素二氧化硅二氧化硅NaNaK KM gM gAlAlCaCaTiTiFeFeZrZrCuCuCrCrZnZnZorbax Rx-SI LZ

4、orbax Rx-SI L1010 3 34 41.51.52 2ndnd3 3ndndndndndnd1 1Zorbax SI LZorbax SI L1717ndndndnd57579 9323221218888 1 4,000,选择选择 300 的孔径的孔径键合类型键合类型 -对色谱分离的影对色谱分离的影响响单齿键合：单齿键合：提高传质速率提高传质速率,加快色谱柱平衡加快色谱柱平衡双齿键合：双齿键合：增加色谱柱稳定性增加色谱柱稳定性,增加色谱柱的载样增加色谱柱的载样量量C-18柱柱-性能影响因素性能影响因素CHCHCHCHCHCHOSiOOOOSiSiSiCHCHCHCHCHCHSi33

5、3333333333SiSiOOSiSiOO碳覆盖率碳覆盖率-对色谱分离的影响对色谱分离的影响高碳覆盖率：提高分辨率高碳覆盖率：提高分辨率,分析时间长分析时间长低碳覆盖率：缩短运行时间低碳覆盖率：缩短运行时间封端封端 -对色谱分离的影响对色谱分离的影响封端：减轻待测组份与硅胶表面残留的酸封端：减轻待测组份与硅胶表面残留的酸性硅羟基反应而引起的色谱峰拖尾现象性硅羟基反应而引起的色谱峰拖尾现象对于极性样品对于极性样品,未封端与经过封端处理的未封端与经过封端处理的色谱柱在选择性上有明显差异色谱柱在选择性上有明显差异C-18柱柱-性能影响因素性能影响因素 固定相键合固定相键合二甲基硅烷二甲基硅烷 封端

6、封端四甲基硅烷四甲基硅烷SiOOHOOCH3SiRCH3CH3SiCH3CH3SiRCH3R=C8,C18,etc.OOHOHOCH3SiRCH3CH3SiRCH3+ClCH3SiCH3CH3OHOHOHOHCH3ClRCH3(TMS)传统键合及封端技术传统键合及封端技术 键合相种类键合相种类HPLC-色谱柱与色谱柱与pH的关系的关系StableBond C18 pH 18 Bonus-RP pH 29 Extend C18 pH 211.5 Eclipse XDB C18 pH 29（可用于（可用于100%全水相）全水相）未封端未封端双封端双封端三封端三封端双封端双封端HPLC-保留值与保留

7、值与pH的关系的关系 pH变化值变化值0.1RS变化值变化值1.6色谱柱：色谱柱：Zorbax StableBond C18 4.6 X 250mm,5um流动相：流动相：27%甲醇：甲醇：73%磷酸磷酸pH 2.5&2.6温度：温度：500C流速：流速：1.0mL/min.邻邻氯苯胺（氯苯胺（pKa2.636)12346750123456Time(min)01234561234675Time(min)pH 7.00pH 7.25色谱柱色谱柱:ZORBAX Eclipse XDB-C8 4.6 x 75 mm,3.5 m流动相流动相:44%25 mM磷酸磷酸,pH 7.00:56%甲醇甲醇流速

8、流速:1.0 mL/min 温度温度:25C 检测检测:UV 250 nm 可电离的组份的分离可能会随可电离的组份的分离可能会随pH变化发生显著变化变化发生显著变化 甚至很小的甚至很小的 0.050.25 个个pH变化单位变化单位.样品样品:1.ketoprofen 2.ethyl paraben 3.Hydrocortisone 4.fenoprofen 5.propyl paraben 6.Propranolol (游离碱游离碱pka 9.5）7.ibuprofenHPLC-保留值与保留值与pH的关系的关系0.25 个个pHHPLC-保留值与保留值与pH的关系的关系pH变化：变化：0.2个

9、个pH(7.07.2)保留时间改变：保留时间改变：1.2分钟分钟(13.614.8分钟分钟)保留时间随保留时间随pH改变不明显改变不明显保留时间随保留时间随pH改变改变不明显不明显(酸性环境中酸性环境中)（PKa：2.98）（PKa：10.1）保留时间保留时间酸性组份酸性组份中性组份中性组份碱性组份碱性组份 方法稳定区方法稳定区 方法波动区方法波动区(pKa+1.5)方法稳定区方法稳定区HPLC-保留值与保留值与pH的关系的关系复杂组分的流动相复杂组分的流动相pH选择技巧选择技巧色谱柱色谱柱:ZORBAX Extend-C184.6 x 150 mm,5 mm 流动相流动相:30%缓冲液缓冲液

10、:70%MeOH pH 7 缓冲液缓冲液20 mM Na2HPO4 pH 11缓冲液缓冲液 20 mM TEA 流速流速:1.0 mL/min 温度温度:RT 检测器检测器:UV 254 nm0 512,345Time(min)76Extend-C18pH 71.Maleate 马来酸盐马来酸盐 2.Scopolamine 东莨菪碱东莨菪碱 pKa 7.6 3.PseudoEphedrine 假麻黄碱假麻黄碱 pKa 9.8 4.Doxylamine 抗敏安抗敏安(多西拉敏多西拉敏)pKa 9.2 5.Chlorpheniramine 氯苯吡胺氯苯吡胺pKa 9.1 6.Triprol内径内径

11、ine 苯丙烯啶苯丙烯啶pKa 6.5 7.Diphenhydramine 苯海拉明苯海拉明 pKa 9.0Extend-C18pH 110 5 101234Time(min)657 高高pH下下,碱性成分的保留增加碱性成分的保留增加待测物待测物pKa+1.5以外以外的流动相的流动相pH可保证方法的稳定性可保证方法的稳定性样品溶剂溶解强度样品溶剂溶解强度 样品溶剂溶解能力强于流动相导致色谱峰峰形问题：裂分峰或宽峰样品溶剂溶解能力强于流动相导致色谱峰峰形问题：裂分峰或宽峰色谱柱色谱柱:ZORBAX StableBond SB-C8,4.6 x 150 mm,5 mm 流动相流动相:82%H2O:

12、18%ACN进样体积进样体积:30 mLA.样品溶剂样品溶剂100%乙腈乙腈0 10Time(min)12B.样品溶剂样品溶剂流动相流动相0 10Time(min)12样品样品:1.Caffeine(咖啡因咖啡因)2.Salicylamide(水杨酰胺水杨酰胺)中性分析时为何要使用缓冲液？中性分析时为何要使用缓冲液？色谱柱色谱柱:ZORBAX Eclipse XDB-C8,4.6 x 75 mm,3.5 m 流动相流动相:44%A:56%甲醇甲醇流速流速:1.0 mL/min 温度温度:25C 检测检测:UV 250 nm 含缓冲液的流动相可改善保留含缓冲液的流动相可改善保留,分离和色谱峰峰形

13、分离和色谱峰峰形.样品样品:1.ketoprofen 2.ethyl paraben 3.hydrocortisone 4.fenoprofen 5.propyl paraben 6.propranolol 7.ibuprofenA=pH 7.0水水A=pH 7.0 水水+25 mM 磷酸缓磷酸缓冲液冲液012345Time(min)1234675012341,4,6,7235Time(min)0 2.5 5.0 7.5Time(min)1234560 2.5 5.0Time(min)123456增加缓冲液浓度减少拖尾增加缓冲液浓度减少拖尾色谱柱色谱柱:ZORBAX Eclipse XDB-C

14、84.6 x 150 mm,5 mm流动相流动相:40%磷酸盐缓冲液磷酸盐缓冲液60%ACN流速流速:1.5 mL/min.温度温度:40CUSP Tf1.1.622.1.653.1.634.1.775.1.836.1.1210 mM 磷酸盐磷酸盐pH 7.0USP Tf1.1.412.1.503.1.334.1.395.1.366.1.0025 mM 磷酸盐磷酸盐pH 7.0 在中等在中等pH下下,离子强度较高离子强度较高,能有效掩蔽硅羟基的二次作用减少拖尾能有效掩蔽硅羟基的二次作用减少拖尾样品样品:Tricyclic Antidepressants（三环抗抑郁剂）（三环抗抑郁剂）1.Des

15、ipramine（脱甲丙咪嗪）（脱甲丙咪嗪）2.Nortriptyline（去甲替林）（去甲替林）3.Doxepin（多塞平）（多塞平）4.Imipramine（丙咪嗪）（丙咪嗪）5.Amitriptyline（阿米替林）（阿米替林）6.TrImipramine（三甲丙咪嗪）（三甲丙咪嗪）三乙胺对碱性成分峰形的影响三乙胺对碱性成分峰形的影响0 2.5 5.0Time(min)12345色谱柱色谱柱:ZORBAX Eclipse XDB-C8,4.6 x 150 mm,5 mm 流动相流动相:85%25 mM Na2HPO4:15%ACN 流速流速:1.0 mL/min.温度温度:35CUSP

16、TF 5%1.1.292.1.333.1.634.2.355.1.57No三乙胺三乙胺10 Mm三乙胺三乙胺USP TF 5%1.1.192.1.183.1.204.1.265.1.14Time(min)0.02.55.035421pH 7样品样品:1.Phenylpropanolamine（去甲麻黄碱）（去甲麻黄碱）2.Ephedrine（麻黄素）（麻黄素）3.Amphetamine（苯丙胺）（苯丙胺）4.MethAmphetamine（脱氧麻黄碱）（脱氧麻黄碱）5.Phenteramine （苯丁胺）（苯丁胺）竞争酸对酸性组分的峰形的影响竞争酸对酸性组分的峰形的影响色谱柱色谱柱:ZORBA

17、X StableBond SB-C18 4.6 x 150 mm,5 mm流动相流动相:40%A:60%ACN流速流速:1.0 mL/min.温度温度:室温室温样品样品:Ibuprofen（异丁苯丙酸）（异丁苯丙酸）pKa 4.4pH 35 mM NaH2PO4Tf=1.8pH 35 mM NaH2PO41%乙酸乙酸pH 2.55 mM NaH2PO40.1%三氟乙酸三氟乙酸Tf=1.0Tf=1.09A:乙酸和三氟乙酸均能作为竞争酸填加至流动相中乙酸和三氟乙酸均能作为竞争酸填加至流动相中 三氟乙酸由于所需浓度较低三氟乙酸由于所需浓度较低,可作为首选可作为首选液相分析液相分析-小诀窍小诀窍1.提

18、高柱温，可增加柱效（提高灵敏度）提高柱温，可增加柱效（提高灵敏度）2.减小柱内径，可增加柱效（提高灵敏度）减小柱内径，可增加柱效（提高灵敏度）3.缩短检测器响应时间，可增加柱效（提高灵敏度）缩短检测器响应时间，可增加柱效（提高灵敏度）4.减小柱外体积，可增加柱效（提高灵敏度）减小柱外体积，可增加柱效（提高灵敏度）5.使用超纯硅胶，可增加柱效（提高灵敏度）使用超纯硅胶，可增加柱效（提高灵敏度）6.使用高能量氘灯，可增加柱效（提高灵敏度）使用高能量氘灯，可增加柱效（提高灵敏度）7.使用中孔透光氘灯，可增加柱效（提高灵敏度）使用中孔透光氘灯，可增加柱效（提高灵敏度）8.改变流动相改变流动相pH，可增

19、加柱效（提高灵敏度），可增加柱效（提高灵敏度）9.改变有机相改变有机相%，可增加柱效（提高灵敏度），可增加柱效（提高灵敏度）10.改变键合相改变键合相，可增加柱效（提高灵敏度），可增加柱效（提高灵敏度）11.改变有机添加剂改变有机添加剂，可增加柱效（提高灵敏度），可增加柱效（提高灵敏度）12.改变流动相配比方式改变流动相配比方式，可增加柱效（提高灵敏度），可增加柱效（提高灵敏度）样品样品:除草剂除草剂流动相流动相:52/48 0.1 M乙酸乙酸钠钠/甲醇甲醇,pH 6流速流速:0.45 mL/min温度温度:40,90检测检测:UV柱温的影响柱温的影响1.西玛津西玛津2.敌草隆敌草隆3.扑灭津

20、扑灭津4.扑灭净扑灭净5.异丙甲草胺异丙甲草胺液相色谱柱液相色谱柱:Zorbax StableBond-C18色谱柱尺寸色谱柱尺寸:4.6 x 150 mm,5m4090提高柱温，可增加柱提高柱温，可增加柱效（提高灵敏度）效（提高灵敏度）液相色谱柱液相色谱柱:Zorbax StableBond-C8色谱柱尺寸色谱柱尺寸:150 mm,5m减小毛细管内径来提高减小毛细管内径来提高低浓度样品的检测灵敏度低浓度样品的检测灵敏度流动相流动相:60%乙腈乙腈/40%水水流速流速:内径内径 0.3 mm-4 uL/min内径内径 0.5 mm-10 uL/min内径内径 1.0 mm-50 uL/min内

21、径内径 4.6 mm-1.0 uL/min温度温度:室温室温检测器检测器:UV 254 nm样品样品:200 ng联二苯联二苯(100 nl)减小柱径，可增减小柱径，可增加柱效（提高灵加柱效（提高灵敏度）敏度）色谱柱色谱柱使用小体积色谱柱对于检测器使用小体积色谱柱对于检测器响应时间的重要性响应时间的重要性(TE32)液相色谱柱液相色谱柱:ZORBAX StableBond-C18色谱柱尺寸色谱柱尺寸:4.6 x 15 mm 3.5m流动相流动相:乙腈乙腈:1%甲酸甲酸=32:68UV:254 nm流速流速:1.0 mL/min.30C进样量进样量:5 L响应时间响应时间:4.0秒秒响应时间响应

22、时间:2.0秒秒响应时间响应时间:1.0秒秒响应时间响应时间:0.5秒秒响应时间响应时间:0.1秒秒1.尿嘧啶尿嘧啶2.乙酰水杨酸乙酰水杨酸3.N-乙酰苯胺乙酰苯胺缩短检测器响应时间，可缩短检测器响应时间，可增加柱效（提高灵敏度）增加柱效（提高灵敏度）色谱柱色谱柱不同硅胶类型比较不同硅胶类型比较(TE1)流动相流动相:含含0.05%甲醇的二氯甲甲醇的二氯甲烷烷 液相色谱柱液相色谱柱Zorbax SilSpherisorbZorbax Rx-Sil1.甲苯甲苯2.N-苯甲酰苯胺苯甲酰苯胺3.苯酚苯酚4.苯甲醇苯甲醇使用高纯硅胶，使用高纯硅胶，可增加柱效可增加柱效（提高灵敏度）（提高灵敏度）pH对

23、苯胺取代物分析的影响对苯胺取代物分析的影响流动相流动相25mM磷酸磷酸:甲醇甲醇=58:42 流速流速:1 mL/min 22C液相色谱柱液相色谱柱:ZORBAX StableBond-C18色谱柱尺寸色谱柱尺寸:4.6 x 150 mm 5m1.对位甲氧基苯胺对位甲氧基苯胺2.间位苯甲胺间位苯甲胺(苯甲胺苯甲胺PKb=9.15)3.3-氨基氨基-苯甲腈苯甲腈4.对位氯苯胺对位氯苯胺5.间位氯苯胺间位氯苯胺6.邻位氯苯胺（邻位氯苯胺（pka=2.636）pH:2.5pH:7.0改变流动相改变流动相pH，可增加柱效可增加柱效（提高灵敏度）（提高灵敏度）三氟乙酸浓度对于反相肽的分离的影响三氟乙酸浓

24、度对于反相肽的分离的影响(B10)流动相流动相:A:水和三氟乙酸水和三氟乙酸B:乙腈和三氟乙酸乙腈和三氟乙酸0-30%B（30 min.内）内）流速流速:1 mL/minUV:254 nm进样量进样量:6uL十肽菌素标样十肽菌素标样S1-S5（疏水性有略微差异（疏水性有略微差异）40C液相色谱柱液相色谱柱:ZORBAX 300 SB-C8色谱柱尺寸色谱柱尺寸:4.6 x 150 mm 5m1.0%三氟乙酸三氟乙酸0.05%三氟乙酸三氟乙酸0.25%三氟乙酸三氟乙酸改变流动相改变流动相pH，可增加柱效可增加柱效（提高灵敏度）（提高灵敏度）有机改性剂和有机改性剂和pH对于选择性的影响对于选择性的影

25、响流动相流动相:25 mM磷酸缓冲液磷酸缓冲液流速流速:1.0 mL/min.22C液相色谱柱液相色谱柱:ZORBAX StableBond-CN色谱柱尺寸色谱柱尺寸:4.6 x 150 mm 5m1.甲氧基苯胺甲氧基苯胺2.间位苯甲胺间位苯甲胺3.4-氯氯-苯胺苯胺4.3-氨基苯甲腈氨基苯甲腈5.3-氯氯-苯胺苯胺6.2-氯氯-苯胺苯胺42%甲醇甲醇：58%缓冲液缓冲液 30%甲醇甲醇：70%缓冲缓冲液液pH 2.6pH 3.0改变有机相改变有机相%，可增加柱效可增加柱效（提高灵敏度）（提高灵敏度）色谱柱的选择性色谱柱的选择性液相色谱柱液相色谱柱:ZORBAX Eclipse XDB-Phe

26、nyl色谱柱尺寸色谱柱尺寸:4.6 x 150 mm 5m流动相流动相:甲醇甲醇:水水=70:30UV:254 nm流速流速:1.0 mL/min.室温室温Zorbax Eclipse XDB-苯基苯基Zorbax Eclipse XDB-C8Zorbax Eclipse XDB-C181.尿嘧啶尿嘧啶2.苯酚苯酚3.4-氯氯-硝基苯硝基苯4.甲苯甲苯5.萘萘改变键合相，改变键合相，可增加柱效可增加柱效（提高灵敏度）（提高灵敏度）流动相对色谱的影响流动相对色谱的影响液相色谱柱液相色谱柱:ZORBAX Eclipse XDB-C8色谱柱尺寸色谱柱尺寸:4.6 x 50 mm 3.5mUV:254

27、 nm流速流速:1 mL/min.室温室温1.尿嘧啶尿嘧啶2.尼帕尔金丁酯尼帕尔金丁酯3.萘萘4.二丙基邻苯二甲酸酯二丙基邻苯二甲酸酯5.苊苊刻度混合刻度混合:Dial-a-Mix A:水水 B:甲醇甲醇,用泵抽取用泵抽取50%B体积比混合体积比混合:Vol/Vol250 mL水水+250 mL甲醇甲醇,用泵抽用泵抽取取100%混合液混合液定容混合定容混合:Mix-to-Mark 250 mL甲醇甲醇,用水定容至用水定容至500 mL,用泵抽取用泵抽取100%混合液混合液预混合（重量比混合）预混合（重量比混合）:Premixed(w/w)200 g甲醇甲醇+200 g水水,用泵抽取用泵抽取10

28、0%混合液混合液改变流动相配比方改变流动相配比方式，可增加柱效式，可增加柱效（提高灵敏度）（提高灵敏度）反相反相HPLC常用缓冲液常用缓冲液 缓冲液缓冲液pKapH范围范围磷酸盐磷酸盐pK12.11.13.1柠檬酸盐柠檬酸盐pK13.12.14.1甲酸盐甲酸盐3.82.8 4.8 柠檬酸盐柠檬酸盐pK24.73.75.7 乙酸盐乙酸盐4.83.85.8 柠檬酸盐柠檬酸盐pK35.44.46.4 磷酸盐磷酸盐pK27.26.28.2羟甲基甲胺羟甲基甲胺8.37.39.3 氨氨9.28.210.2 硼酸盐硼酸盐9.28.210.2 甘氨酸甘氨酸9.88.810.8 1-甲基甲基-哌啶哌啶10.39.311.3 四氢化吡咯四氢化吡咯10.59.511.5 二乙胺二乙胺10.59.511.5 三乙胺三乙胺10.79.711.7 磷酸盐磷酸盐pK312.311.313.3pH 2.5磷酸磷酸 0.1%三氟乙酸三氟乙酸 0.1%鬼峰产生原因及解决方法鬼峰产生原因及解决方法鬼峰产生原因及解决方法鬼峰产生原因及解决方法