7第七章工业发酵染菌的防治lin

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1、 第七章第七章 染菌的防治染菌的防治一、染菌的影响一、染菌的影响所谓“杂菌”，是指在发酵培养中侵入了有碍生产的其他微生物。发酵过程污染杂菌，会严重的影响生产，是发酵工业的致命伤。l造成大量原材料的浪费，在经济上造成巨大损失l影响产品外观及内在质量l扰乱生产秩序，破坏生产计划。l遇到连续染菌，特别在找不到染菌原因往往会影响人们的情绪和生产积极性。1、染菌对不同产品发酵的影响放线菌由于生长的最适放线菌由于生长的最适pH为为7左右，染细菌较多；霉菌生长左右，染细菌较多；霉菌生长pH为为5左右，因此染酵母菌为多。左右，因此染酵母菌为多。青霉素发酵青霉素发酵染菌，绝大多数杂菌都能直接产生青霉素酶，另一染

2、菌，绝大多数杂菌都能直接产生青霉素酶，另一些杂菌则可被青霉素诱导而产生青霉素酶。不论在发酵前期、些杂菌则可被青霉素诱导而产生青霉素酶。不论在发酵前期、中期或后期，染有能产生青霉素酶的杂菌，都能使中期或后期，染有能产生青霉素酶的杂菌，都能使青霉素迅速青霉素迅速破坏。破坏。链霉素、四环素、红霉素、卡那霉素链霉素、四环素、红霉素、卡那霉素等发酵染菌也会造成不同等发酵染菌也会造成不同程度的危害。如杂菌大量消耗营养干扰生产菌的正常代谢；改程度的危害。如杂菌大量消耗营养干扰生产菌的正常代谢；改变变pH，降低产量降低产量。疫苗生产疫苗生产危害很大。现在疫苗多采用深层培养，有些疫苗是不危害很大。现在疫苗多采用

3、深层培养，有些疫苗是不加提纯而直接使用的产品，在其深层培养过程中，一旦污染杂加提纯而直接使用的产品，在其深层培养过程中，一旦污染杂菌，不论死菌、活菌或内外毒素，菌，不论死菌、活菌或内外毒素，都应全部废弃都应全部废弃。因此，发酵。因此，发酵罐容积越大，污染杂菌后的损失也越大。罐容积越大，污染杂菌后的损失也越大。（一）染菌对发酵的影响（一）染菌对发酵的影响2 2、污染不同种类和性质的微生物的影响、污染不同种类和性质的微生物的影响（1）污染噬菌体）污染噬菌体 噬菌体的感染力很强，传播蔓延迅速，也较难防治，故危害噬菌体的感染力很强，传播蔓延迅速，也较难防治，故危害极大。污染噬菌体后，可使发酵产量大幅度

4、下降，严重的造极大。污染噬菌体后，可使发酵产量大幅度下降，严重的造成断种，被迫停产成断种，被迫停产。（2）污染其它杂菌）污染其它杂菌 有些杂菌会使生产菌有些杂菌会使生产菌自溶自溶产生大量泡沫，即使添加消泡剂也产生大量泡沫，即使添加消泡剂也无法控制逃液，影响发酵过程的通气搅拌。无法控制逃液，影响发酵过程的通气搅拌。有的杂菌会使发酵液发臭、发酸，致使有的杂菌会使发酵液发臭、发酸，致使pH下降下降，使不耐酸，使不耐酸的产品破坏。的产品破坏。特别是染芽孢杆菌，由于芽孢耐热，不易杀死，特别是染芽孢杆菌，由于芽孢耐热，不易杀死，往往一次染菌后会反复染菌。往往一次染菌后会反复染菌。v不同发酵对杂菌感染的敏感

5、性不同不同发酵对杂菌感染的敏感性不同v(1)(1)青霉素和链霉素：青霉素和链霉素：细短杆菌细短杆菌的危害大；的危害大；v(2)(2)四环素：对四环素：对双球菌、芽孢杆菌和荚膜杆双球菌、芽孢杆菌和荚膜杆菌菌污染敏感；污染敏感；v(3)(3)柠檬酸：对柠檬酸：对青霉菌青霉菌敏感；敏感；v(4)(4)核苷酸：对核苷酸：对芽孢杆菌芽孢杆菌敏感敏感v(5)(5)氨基酸：对氨基酸：对噬菌体噬菌体敏感；敏感；3 3、不同时间染菌对发酵的影响、不同时间染菌对发酵的影响 污染时间污染时间是指用无菌检测方法确定的污染时间，不是杂菌窜入培是指用无菌检测方法确定的污染时间，不是杂菌窜入培养液的时间。养液的时间。（1）

6、种子培养期染菌。）种子培养期染菌。由于接种量较小，生产菌生长一开始不占优势。此时防御杂菌能由于接种量较小，生产菌生长一开始不占优势。此时防御杂菌能力低，容易污染杂菌，对发酵影响最大。如在此阶段染菌，力低，容易污染杂菌，对发酵影响最大。如在此阶段染菌，应将种应将种子液全部废弃。子液全部废弃。（2）发酵前期染菌。发酵前期最易染菌，且）发酵前期染菌。发酵前期最易染菌，且危害极大危害极大。原因原因 发酵前期菌量不很多，发酵前期菌量不很多，与杂菌没有竞争优势；与杂菌没有竞争优势；且还未合成且还未合成产物（抗生素）或产生很少，产物（抗生素）或产生很少，抵御杂菌能力弱。抵御杂菌能力弱。措施措施 可以用降低培

7、养温度，调整补料量，用酸碱调可以用降低培养温度，调整补料量，用酸碱调pH值，缩短值，缩短培养周期等措施予以补救。如果前期染菌，且培养基养料消耗不多，培养周期等措施予以补救。如果前期染菌，且培养基养料消耗不多，可以可以重新灭菌重新灭菌，补加一些营养，重新接种再用。，补加一些营养，重新接种再用。（3）发酵中期染菌。）发酵中期染菌。发酵中期染菌会严重干扰产生菌的代谢。发酵中期染菌会严重干扰产生菌的代谢。杂菌大量产酸，培养杂菌大量产酸，培养液液pH下降；糖、氮消耗快，发酵液发粘，菌丝自溶，产物分泌下降；糖、氮消耗快，发酵液发粘，菌丝自溶，产物分泌减少或停止，有时甚至会使已产生的产物分解。有时也会使发酵

8、减少或停止，有时甚至会使已产生的产物分解。有时也会使发酵液发臭，产生大量泡沫。液发臭，产生大量泡沫。措施措施 降温培养，减少补料，密切注意代谢变化情况。如果降温培养，减少补料，密切注意代谢变化情况。如果发酵单位到达一定水平可以发酵单位到达一定水平可以提前放罐提前放罐，或者抗生素生产中可以将，或者抗生素生产中可以将高单位的发酵液输送一部分到染菌罐，抑制杂菌。高单位的发酵液输送一部分到染菌罐，抑制杂菌。（4）发酵后期染菌。）发酵后期染菌。发酵后期发酵液内已积累大量的产物（如果是抗生素），对杂发酵后期发酵液内已积累大量的产物（如果是抗生素），对杂菌有一定的抑制或杀灭能力。因此如果染菌不多，菌有一定的

9、抑制或杀灭能力。因此如果染菌不多，对生产影响不对生产影响不大大。如果染菌严重，又破坏性较大，。如果染菌严重，又破坏性较大，可以提前放罐可以提前放罐。1、发酵染菌对过滤的影响、发酵染菌对过滤的影响 染菌的发酵液一般发粘，菌体多数自溶，所以在发酵液过滤时不能染菌的发酵液一般发粘，菌体多数自溶，所以在发酵液过滤时不能或很难形成滤饼，导致或很难形成滤饼，导致过滤困难过滤困难。由于过滤困难，过滤时间拉长，由于过滤困难，过滤时间拉长，影响发酵液储罐和过滤设备的周转使用影响发酵液储罐和过滤设备的周转使用，破坏了生产平衡。染菌发酵破坏了生产平衡。染菌发酵液还会因过滤困难而液还会因过滤困难而大幅度降低过滤收率，

10、大幅度降低过滤收率，直接影响提炼总收率。直接影响提炼总收率。措施：措施：加热、冷却、添加助滤剂等加热、冷却、添加助滤剂等2、发酵染菌对提炼的影响、发酵染菌对提炼的影响 染菌发酵液中含有比正常发酵液更多的水溶性蛋白和其它杂质。采染菌发酵液中含有比正常发酵液更多的水溶性蛋白和其它杂质。采用用沉淀法沉淀法，杂质污染产物。采用有机溶剂，杂质污染产物。采用有机溶剂萃取萃取的提炼工艺，则的提炼工艺，则极易发极易发生乳化，生乳化，很难使水相和溶剂相分离，影响进一步提纯。采用直接用很难使水相和溶剂相分离，影响进一步提纯。采用直接用离离子交换子交换树脂的提取工艺，如链霉素、庆大霉素，染菌后大量杂菌黏附树脂的提取

11、工艺，如链霉素、庆大霉素，染菌后大量杂菌黏附在离子交换树脂表面，或被离子交换树脂吸附，大大在离子交换树脂表面，或被离子交换树脂吸附，大大降低离子交换树降低离子交换树脂的交换容量，脂的交换容量，而且有的杂菌很难用水冲洗干净，洗脱时与产物一起而且有的杂菌很难用水冲洗干净，洗脱时与产物一起进入洗脱液，影响进一步提纯。进入洗脱液，影响进一步提纯。（二）发酵染菌对提炼和产品质量的影响（二）发酵染菌对提炼和产品质量的影响2 染菌的表现染菌的表现种子种子：生长缓慢、菌丝结团、代谢异常：生长缓慢、菌丝结团、代谢异常发酵发酵：菌体生长差、：菌体生长差、pH异常、溶氧异常、异常、溶氧异常、泡沫过多、菌体浓度异常泡

12、沫过多、菌体浓度异常（一）发酵染菌的检查判断（一）发酵染菌的检查判断n表观法表观法：溶氧水平、排气：溶氧水平、排气中中COCO2 2n实验法实验法：镜检法、平皿划：镜检法、平皿划线或斜面检查法、肉汤培线或斜面检查法、肉汤培养法养法二、染菌的原因二、染菌的原因日本工业技术院发酵研究所多年来抗生素发酵染菌原因分析日本工业技术院发酵研究所多年来抗生素发酵染菌原因分析 项目项目 百分率百分率%种子带菌或怀疑种子带菌种子带菌或怀疑种子带菌 9.64接种时罐压跌零接种时罐压跌零 0.19培养基灭菌不透培养基灭菌不透 0.79总空气系统有菌总空气系统有菌 19.96泡沫冒顶泡沫冒顶 0.48夹套穿孔夹套穿孔

13、 12.36盘管穿孔盘管穿孔 5.89接种管穿孔接种管穿孔 0.39阀门渗漏阀门渗漏 1.45搅拌轴密封渗漏搅拌轴密封渗漏 2.09罐盖漏罐盖漏 1.54其它设备渗漏其它设备渗漏 10.13操作原因操作原因 10.15 原因不明原因不明 24.94（二）染菌原因（二）染菌原因上海第三制药厂染菌原因分析上海第三制药厂染菌原因分析 项目项目 百分率百分率%种子带菌种子带菌 14.15盘管穿孔盘管穿孔 14.20阀门渗漏阀门渗漏 23.30空气系统有菌空气系统有菌 10.0管理不善管理不善 25.80其它其它 7.49原因不明原因不明 5.78 链霉素制药厂发酵染菌原因分析链霉素制药厂发酵染菌原因分

14、析 项目项目 百分率百分率%外界带入杂菌（取样、补料）外界带入杂菌（取样、补料）8.20设备穿孔设备穿孔 7.60空气系统有菌空气系统有菌 26.00停电罐压跌零停电罐压跌零 1.60接种接种 11.00蒸汽压力不足或蒸汽量不足蒸汽压力不足或蒸汽量不足 0.60管理问题管理问题 7.80 操作违反规程操作违反规程 1.60种子带菌种子带菌 0.60原因不明原因不明 35.00造成染菌的主要原因总结造成染菌的主要原因总结1、设备渗漏、设备渗漏设备渗漏包括夹套穿孔、盘管穿孔、接种管穿孔、阀门渗漏、搅拌轴渗漏、罐盖漏和其它设备漏等。日本工业技术院发酵研究所对染菌原因分析，这类染菌占33.85，上海三

15、厂的分析这类染菌为37.5。2、空气带菌、空气带菌从日本工业技术院和上海第四制药厂分析空气带菌而造成的染菌分别为19.96和 26%。国内外空气除菌技术虽已有较大改善，但仍然没有使染菌率降低到理想的程度。因为空气除菌系统较为复杂，环节多，偶遇不慎便会导致空气除菌失败。3、种子带菌、种子带菌种子带菌又分为种子本身带菌和种子培养过程中染菌。加强种子管理，严格无菌操作，种子本身带菌是可以克服的。种子培养过程染菌与发酵一样有许多因素造成。4、灭菌不彻底、灭菌不彻底l蒸汽通入培养基，升温快慢、保温时间产生过多泡沫l蒸汽总压是否达到要求标准5、技术管理不善（、技术管理不善（要对发酵每个环节严格控制）l环境

16、中的杂菌数量因季节而有很大差别。如在卡那霉素生产中，于炎热的夏季将连续灭菌预热至800C的培养基采样培养，可发现无法计数的大量的芽孢杆菌；而冬季取样的培养中，则仅发现23个芽孢杆菌。故染菌率因季节不同而发生明显变化。l原材料储存和保管，如液胨、玉米浆、母液糖等有机原料杂菌的数量l发酵罐、培养基配制罐等设备的清洗质量有无灭菌的死角对减少或避免染菌仍然是十分必要的。1，从染菌的规模来分析染菌原因，从染菌的规模来分析染菌原因 v大批发酵罐染菌：空气系统v部分发酵罐(或罐组)染菌：前期可能是种子带杂菌，或灭菌不彻底，中后期则可能是中间补料系统或油管路系统发生问题所造成的v个别发酵罐连续染菌：设备问题(

17、如阀门的渗漏或罐体腐蚀磨损)，设备的腐蚀磨损所引起的染菌会出现每批发酵的染菌时间向前推移的现象v个别发酵罐偶然染菌：原因比较复杂，因为各种染菌途径都可能引起。三、染菌情况分析三、染菌情况分析2，从染菌的时间来分析，从染菌的时间来分析v发酵早期染菌：种子带菌、培养基和设备灭菌不彻底、设备或管道有死角v中、后期染菌：中间补料、设备渗漏、操作不合理3，从染菌的类型来分析，从染菌的类型来分析v耐热性芽抱杆菌：死角或灭菌不彻底v球菌、酵母：可能是从蒸汽的冷凝水或空气中带来的v霉菌：灭菌不彻底或无菌操作不严格四、染菌的防止四、染菌的防止1 1、防止种子带菌、防止种子带菌l制备种子时对沙土管及摇瓶严格加以控

18、制。l沙土制备时要多次间歇灭菌l注意接种、移种时的无菌操作l无菌室和摇床间都要保持清洁。无菌室内要供给恒温恒湿的无菌空气，还要装紫外灯用以灭菌，或用化学药品灭菌。2 2、防止设备渗漏、防止设备渗漏发酵设备及附件由于化学腐蚀、电化学腐蚀，物料与设备摩擦造成机械磨损以及加工制作不良等原因会导致设备及附件渗漏。试漏方法可采用水压试漏法。即被测设备的出口处装上压力表，将水压入设备，待设备中压力上升到要求压力，关闭进出水，看压力有否下降。压力下降则有渗漏。但有些渗漏很小，看不出何处漏水，可以用稀碱溶液压入设备，然后用蘸有酚酞的纱布揩，只要酚酞能变红处即为渗漏处。3 3、防止培养基灭菌不彻底、防止培养基灭

19、菌不彻底培养基灭菌前含有大量杂菌，灭菌时如果蒸汽压力不足，就达不到要求的温度；灭菌时产生大量泡沫或发酵罐中有污垢堆积，就会窝藏大量杂菌，造成灭菌不彻底。4 4、防止空气引起的染菌、防止空气引起的染菌空气冷却器的列管穿孔泄露，冷却水会渗入到空气中，造成染菌。棉花-活性炭过滤器长期使用后，棉花和活性炭的体积被压缩而厚薄不均，厚的一边阻力大空气不畅通，薄的一边空气容易通过，久而久之，薄的一边长期受空气顶吹而使棉花活性炭改变位置，造成过滤器失效。过滤器用蒸汽灭菌时，若被蒸汽冷凝水润湿就会降低或丧失过滤效能，灭菌完毕应立即缓慢通入压缩空气，将水分吹干。超细纤维纸作过滤介质，灭菌时必须将管道中冷凝水放干净

20、，以免介质受潮失效。5、发酵染菌后的措施l染菌后的培养基必须灭菌后才可放下水道。可通蒸汽灭菌，也可加入过氧乙酸等化学灭菌剂搅拌半小时，才放下水道。否则由于各罐的管道相通，会造成其它罐的染菌，而且直接放下水道也会造成空气的污染而导致其它罐批染菌。l凡染菌的罐要找染菌的原因，对症下药，该罐也要彻底清洗，进行空罐消毒，才可进罐。l染菌厉害时，车间环境要用石灰消毒，空气用甲醛熏蒸。特别，若染噬菌体，空气必须用甲醛蒸汽消毒。五、染噬菌体的防治五、染噬菌体的防治（一）染噬菌体对发酵的影响（一）染噬菌体对发酵的影响发酵过程中如果受噬菌体的侵染，一般发生溶菌，随之出现发酵迟缓或停止，而且受噬菌体感染后，往往会

21、反复连续感染，使生产无法进行。染噬菌体表现为：染噬菌体表现为：1、镜检可发现菌体数量明显减少，菌体不规则，严重时完全看不到菌体，且是在短时间内菌体自溶。2、发酵pH值逐渐上升，48小时之内可达8.0以上，不再下降。3、发酵液残糖高，有刺激臭味，粘度大，泡沫多。4、生产量甚少或增长缓慢或停止（二）产生噬菌体的原因（二）产生噬菌体的原因通常在工厂投产初期并不感到噬菌体的危害，经过12年以后，主要是由于生产和试验过程中不加注意地把许多活菌体排放到环境中去，自然界中的噬菌体就在活菌体中大量生长，造成了自然界中噬菌体增殖的好机会。这些噬菌体随着风沙尘土和空气流动传播，以及人们的走动、车辆的往来也携带着噬

22、菌体到处传播，使噬菌体有可能潜入生产的各个环节，尤其是通过空气系统进入种子室、种子罐、发酵罐（三）染噬菌体的检测（三）染噬菌体的检测在培养皿上倒入培养生产菌的培养基（加琼脂）作下层。同样的培养基中加入2030培养好的种子液，再加入怀疑染噬菌体的发酵液，摇均匀后，铺上层。培养过夜观察培养皿上是否出现噬菌斑。也可以在上层培养基中不加怀疑染噬菌体的发酵液，而将发酵液直接点种在上层培养基表面，培养过夜，观察有无透明圈出现。（三）噬菌体的防治（三）噬菌体的防治1、必须建立工厂环境清洁卫生制度，定期检查、定期清扫，车间四周有严重污染噬菌体的地方应及时撒石灰或漂白粉。2、车间地面和通往车间的道路尽量采取水泥地面3、种子和发酵工段的操作人员要严格执行无菌操作规程，认真地进行种子保管，不使用本身带有噬菌体的菌种。感染噬菌体的培养物不得带入菌种室、摇瓶间4、认真进行发酵罐、补料系统的灭菌。严格控制逃液和取样分析和洗罐所废弃的菌体。对排放的废液应灭菌后才可排放。5、选育抗噬菌体的菌种，或轮换使用菌种。6、发现噬菌体停搅拌、小通风，将发酵液加热到7080杀死噬菌体(噬菌体不耐热，7080C经5分钟即可杀死)，才可排放。发酵罐周围的管道也必须彻底灭菌。v固定化酵母连续发酵酒精染菌问题